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1、高等医学院校实验教材医学微生物与免疫学实验指导供临床医学、影像、护理、中医等专业使用 三峡大学医学院病原生物与免疫学教研室二00五年六月高等医学院校实验教材医学微生物与免疫学实验指导主 编 韩 莉副主编 张昌菊 宋利琼编 者 （以姓氏笔画为序）王 磊 朱 平 刘 嘉 刘 英 宋利琼 吴红艳 杨建林 周永芹 张 颖 张昌菊 韩 莉三峡大学医学院生物病原部2005年6月29日前 言本教材由医学微生物学和医学免疫学两部分组成，通过实习课教学使学生了解和掌握医学微生物学、医学免疫学的基本实验技能操作和基本研究方法，同时也能获取相应的感性知识。为培养学生的思维能力和独立操作能力，在进行设计性实验课教学时
2、，学生也能利用本实习指导作为工具，顺利地进行实验操作，以节省学生获取知识的时间。为此目的，对每项实验的目的及实际意义都有所交代，对实验结果的观察与分析，也予以必要的辅导。限于教学时数和条件，有些内容将以示教、电视或电影教学方式教学，这部分尤其需要加强复习，以弥补未能亲自操作之不足。有关实验课的改革设想，仍须不断地接受实践考验，发扬成绩克服缺点，以不断地充实和提高。为上好实验课，要求同学课前做好预习，明确实验任务、目的、原理、方法及操作中的注意事项等，避免和减少发生错误，实验过程中必须持严肃认真的态度，对实验结果必须进行仔细地观察和认真地记录，然后进行科学分析，得出恰当结论，独立认真完成实验报告
3、，书写实验报告要字迹清楚，语言简练，表格清晰，画图应力求反映实际标本的原状。 编者 2005年6月29日内 容 简 介第一篇 医学微生物学医学微生物学实验是医学微生物学课程的重要组成部分，我们将医学微生物学实验课内容分为六个单元，改变以往单一的实验方式，在综合性实验的基础上开设设计性实验，学生能比较系统地了解常用微生物学实验的原理、方法、结果分析、注意事项及用途，可以帮助学生理解和巩固所学的理论知识，培养学生的操作技能以及观察问题，分析、解决问题的能力、严谨的科学态度，同时实验与病案讨论结合，学生能将理论知识与临床实践有机联系，为学习其它基础医学，临床医学及预防医学奠定基础，从而提高学生的综合
4、素质。第二篇 医学免疫学实践教学是课程建设的重要环节，培养和提高学生的综合素质与创新能力重要途径。在免疫学实验教学中我们大力改革实验教学的形式和内容，将免疫学的16学时实验内容分为两大部分，第一部分为综合性实验，包括了解天然免疫的组成与生物学功能的检测；常见体液免疫检测指标的设计，使学生能较熟练应用基本的免疫学实验技术，能针对不同的临床病例开展相关免疫学项目的基本检测，并对检测结果进行合理的临床解释和分析。为了学生既能适应一般临床与科研工作，又具有一定的创新工作能力。第二部分我们开设设计性实验：市场有某一生物制剂有免疫增强作用，请设计实验方案证实。在这部分内容要求同学们初步掌握从不同角度证实某
5、产品有免疫增强作用的实验设计，掌握与了解常见细胞免疫的检测技术和应用（ELISA检测细胞因子）、免疫标记技术的种类、原理、特点、应用、淋巴细胞分离记数技术、淋巴细胞增殖等实验。目 录第一篇 医学微生物学实验室规则 2实验一 常见细菌形态学检查方法（综合性实验）3实验二 细菌的分离培养法与消毒灭菌（综合性实验） 11实验三 化脓性球菌的分离鉴定（设计性实验） 27实验四 肠道杆菌的分离鉴定（设计性实验） 32实验五 厌氧菌、分支杆菌的检查法（综合性实验） 41实验六 各种微生物形态、病毒学检查法（综合性实验） 46微生物学各论自学提纲 56第二篇 医学免疫学实验一 天然免疫功能的检测（综合性实验
6、） 60实验二 常见抗原抗体反应（综合性实验） 67实验三 细胞免疫检测I：细胞因子的检测（设计性实验）86实验四 细胞免疫检测：淋巴细胞分离、计数及活性检测（设计性实验）94实验五 细胞免疫检测III：淋巴细胞增殖实验（设计性实验）103综合复习 107附录 113实验三 细胞免疫检测I：细胞因子的检测（设计性实验）【实验任务】市场上有一广告产品，据说有免疫增强作用，请设计一个方案证实之（从细胞因子的角度考虑）。【目的要求】一、初步掌握从细胞因子的角度证实某产品有免疫增强作用的实验设计。二、了解五种标记技术的原理、特点和应用。三、掌握ELISA的实验原理、操作方法及其临床实用意义。【实验条件
7、】一、昆明小鼠若干只、EP管、试管若干只、眼科镊若干把、试管离心机两台、生理盐水50ml。二、聚乙烯塑料反应板（PH9.6时可吸附蛋白Ag或b）。三、抗原（IL-2），冻干酶联抗体。四、邻苯二胺（OPD），包被液（0.05M碳酸钠碳酸氢钠溶液，PH9.6）。五、稀释液：10%免疫血清PBS吐温20，防止非特异性吸附。六、洗涤液：0.02MTrisTWeen20，Ph7.4防止非特异性吸附。七、底物溶液：0.02M磷酸氢二钠25.7毫升，0.1M柠檬酸24.3毫升，蒸水50毫升。临用前新鲜配制，在上述缓冲液中溶解40毫克邻苯二胺，然后加入30%双氧水0.15毫升，底物对光敏感，需要避光并立即使用
8、。八、终止液：2M硫酸。九、湿盒，37OC洹温箱，酶标仪。【作业】请将你们小组的设计方案与技术路线在讨论完善后记录在实验报告本，并将可行的实验内容在实验课中实施。【参考资料】一、小鼠眼球取血：抓住小鼠的尾巴使小鼠悬于空中，旋转十几圈（使小鼠处于晕旋状态），再突然用左手拇指和食指抓紧小白鼠颈部及两耳，将鼠体收入手掌中，再用左手无名指和手掌夹住小白鼠尾根，以无名指和小指夹住其左腿，使小鼠的头部向下，这时小鼠的眼球处于突出状态，快速用小镊子夹着小鼠的眼球用力一拉，再用小试管放在血滴下的位置即可。一般情况下，一只小鼠可取血l。二、常见的免疫标记技术包括 免疫荧光技术 免疫酶技术 放射免疫技术 化学发光
9、免疫技术 金免疫技术。用荧光素、同位素或酶标记抗体或抗原，用于抗原或抗体检测是目前广泛应用的敏感、可靠的方法。上述三种常用的标记物与抗原或抗体化学连接之后不改变后者的免疫特性。本方法可用于定性、定量或定位检测。1免疫荧光技术免疫荧光技术（immunofluorescence techni）是用化学方法使荧光素标记的抗体（或抗原）与组织或细胞中的相应抗原（或抗体）结合，进行定性定位检查抗原或抗体的方法。 （1）直接荧光法：把荧光抗体加到待检的细胞悬液，细胞涂片或组织切片上进行染色，经抗原抗体反应后，洗去未结合的荧光抗体，将待检标本在荧光显微镜下观察，有荧光的部位即有相应抗原存在，此法可用于病毒感
10、染细胞、带某种特异抗原的细胞（如T细胞和B细胞）或病原菌的检查，也可用于组织中沉着的免疫复合物的检查。本法的缺点是检查多种抗原，就需分别制备相应的多种标记抗体。（2）间接荧光法：可克服直接法需制备多种荧光抗体的复杂操作。将组织或细胞上的抗原直接与相应抗体（不标记荧光）结合，此为第一抗体，再把能与第一抗体特异结合的荧光标记的抗免疫球蛋白抗体加入，此为荧光标记的第二抗体，观察结果与直接法相同。间接法比直接法敏感性高，如果用于检查抗原的第一抗体是人或动物的只需制备一种抗人或动物的免疫球蛋白荧光抗体。免疫荧光技术在传染病诊断上有广泛的用途，如在细菌、病毒、螺旋体感染的疾病，检查抗原或抗体，如查出IgM
11、抗体，可做为近期接触抗原的标志，所以使用荧光标记抗IgM可诊断近期感染。除微生物学方面的应用外，还可利用单克隆抗体鉴定淋巴细胞的亚类。使用流式细胞仪(fluorescene-activated cell sorting,FACS)，能自动检测细胞的大小、荧光强度。针对细胞表面不同抗原，可以使用两种不同的荧光染料，如用异硫氰荧光素（FITC）发黄绿荧光，用罗丹明（TMRITC）发红色荧光。由于荧光颜色不同标记两种不同的抗体，对同一细胞进行双标记染色。对淋巴细胞亚类鉴定起着巨大推动作用。应用间接荧光法也用于自身免疫病的抗核抗体检查。 2放射免疫分析法 放射免疫分析法（radioimmunoassa
12、y RIA）应用竞争性结合的原理，应作放射性同素标记抗原（或抗体）与相应抗体（或抗原）结合，通过测定抗原抗体结合物的放射活性判断结果，本方法可进行超微量分析，敏感性高，可用于测定抗原、抗体、抗原抗体复合物。本法常用的同位素有125和131。放射免疫分析常用的有液相法和固相法两种：（1）液相法：将待检标本（例如含胰岛素抗原）与定时的同位素标记的胰岛素（抗原）和定时的抗胰岛素抗体混合，经一定作用时间后，分离收集抗原抗体复合物及游离的抗原，测定这两部分的放射活性，计算结合率。在反应系统中，待检标本的胰岛素抗原与同位素标记的胰岛素竞争夺战性与胰岛素抗体结合。非标记的抗原越多，标记抗原与抗体形成的复合物
13、越少。非标记抗原含量与标记抗原抗体复合物的量呈一定的函数关系。预先用标准的非标记抗原作成标准曲线后，即可查出待检标本中胰岛素的含量。（2）固相法：将抗原或抗体吸附到固相载体表面，然后加待检标本，最后加标记抗体。测定固相载体的放射活性，常用的固相载体有溴化氰（CNBr）海豹化的纸片或聚苯乙烯小管。放射免疫分析法应用范围广泛，包括多种激素（胰岛素、生长激素、甲状腺素等）维生素、药物、IgE等。3酶联免疫分析法 酶联免疫分析法（enzyme immunoassay,EIA）是当前应用最广泛的免疫检测方法。本法将抗原抗体反应的特异性与酶对底物高效催化作用结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变化判断试
14、验结果，可经酶标测定仪作定量分析，敏感度可达ng水平。常用于标记的酶有辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase)、碱性磷酶（alkaline phosphatase）等。它们与抗体结合不影响抗体活性。这些酶具有一定的稳定性，制成酶标抗体可保存较长时间。目前常用的方法有酶标免疫组化法和酶联免疫吸附法。前者测定细胞表面抗原或组织内的抗原；后者主要测定可溶性抗原或抗体。本法既没有放射性污染又不需昂贵的测试仪器，所以较放射免疫分析法更易推广。4化学发光免疫分析法 放射免疫分析法有很高的灵敏度，但存在着放射性防护和同位素污染等问题。近年来，许多非放射性同位素标记的免疫分析方法相继出现
15、。其中，在化学发光反应及抗原-抗体特异性识别基础上建立起来的一种新的非放射免疫分析技术-化学发光免疫分析法，由于这种方法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，线性范围宽，仪器设备简单，试剂价格低廉，方法稳定、快速等优点，已成为一种重要的非同位素标记免疫分析方法，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测。化学发光免疫分析包括三大类型：即标记化学发光物质的化学发光免疫分析；标记荧光物质的荧光化学发光免疫分析和标记酶的化学发光酶联免疫分析。 5金免疫技术 金免疫技术的特点是以胶体金作为标记物。这一技术在70年代初期由Faulk和Taylor始创，最初用于免疫电镜技术。迄今为止，
16、金标记仍主要用于免疫组织化学中。1981年Danscher建立了银显影液增强，光镜下金颗粒可见性的方法；1983年Moeremans等在蛋白质转移电泳中应用了免疫金银染色法；1986年Fritz等在免疫金银法基础上成功进行了彩色免疫金银染色。下面重点介绍酶联免疫吸附试验。三、酶联免疫吸附试验（一）原理：近二十几年来，免疫学分析方法发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比。继50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后，在70年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术。由于酶的高效生物催化作用，一
17、个酶分子在数分钟内可以催化几十几百个底物分子发生反应，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法（EnzymeLinked Immunosorbent Assay，ELISA），本法自70年代初期由VAN WEEMEN、SCHUARS.ENGVALL及PERLMARN等相继分别报道后，现已引起广泛重视。ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定
18、及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本，因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面：1免疫酶染色各种细胞内成份的定位。2研究抗酶抗体的合成。3显现微量的免疫沉淀反应。4定量检测体液中抗原或抗体成份。ELISA的基本原理有三条：1抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；2抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物
19、仍能保持其免疫学和酶学活性；3酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。由于ELISA法一方面是建立在抗原与抗体免疫学反应的基础上，因而，具有特异性。而另一方面又由于酶标记抗原或抗体是酶分子与抗原或抗体分子的结合物，它可以催化底物分子发生反应，产生放大作用，正因为此种放大作用而使本法具有很高的敏感性。因此，ELISA法是一种既敏感又特异的方法。常用的ELISA有以下两个方面。(一)测定抗原的，主要有四种方法。1、竞争法（Competition method
20、）:方法的基本原理可见图1：图1：竟争法测抗原示意图本法首先将特异性抗体吸附于固相载体表面，我们把抗原和抗体吸附到固相载体表面的这个过程，称为包被（Coated），也可叫做致敏。经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液，而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为我们所要测定的未知抗原的量。这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可，因此，对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此法。该法的优点是快，因为只有一个保温洗涤过程。但需用较多量的酶标记抗原为其缺点。2、双抗体夹心法方法的基本原理可用图2来表示：图2：.双抗体夹心法测抗原示意图本法首先也是用特
21、异性抗体包被于固相载体，经洗涤后加入含有抗原之待测样品，如待检样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量。这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。因此，不能用于分子量小于5000的半抗原之类的抗原测定。我们用在霍乱肠毒素的测定、HbSAg及HbS的测定。3、改良双抗体夹心法：本法是双抗体夹心法的一种改良形式，也是用于测定抗原的，其原理可用图3来表示。本法首先是将特异性抗体a包被于固相
22、载体，经洗涤加入含有欲测抗原之待检样品。经孵育洗涤后再加一次未标记的特异性抗体b，而这次加入的抗体b于第一次包被于固相载体上的特异性抗体a对被测抗原来说都是特异性的，但不是用同种动物免疫制备的，否则可出现非特异性反应。经孵育洗涤后，再加酶标记抗b抗体，再经孵育洗涤后加底物显色进行测定。这种方法与双抗体夹心法不同之处是多加了一层抗体。因此，放大的倍数更高，故比双抗体夹心法更加灵敏。同时避免标记特异性抗体，而另一优点是只要标记一种抗抗体，即可达到多种应用。图3：改良双抗体夹心法测抗原示意图用于测定抗原的尚有第4种叫做抑制性测定法（见图4），它是先用抗原包被固相载体，然后分为二组，一组加入用参考抗体
23、和被检标本混合孵育后的混合溶液，假如标本中不含抗原，则参考抗体未被结合。因此它可以和包被于固相载体上的抗原结合。如标本中含有抗原，则抗原先与参考抗体结合，故参考抗体不再与包被于固相载体上的抗原结合。对加入酶结合物（抗球蛋白）和底物仅显示剩余结合的抗体量。再与另一组不加待检标本的参考系统比较，被检标本对底物显色的抑制程度与标本中所含抗原量成比例，二者之差，即为欲测抗原的量。图4：抑制性测定法的原理被检标本对底物显色的抑制程度与标本中所含抗原的量成比例，二者之差即为欲测抗原的量。(2)测定抗体方面：所用的方法称为间接法，也是目前最常用的方法，其原理可用图5来表示。图5：间接法测抗体示意图间接法首先
24、用抗原包被于固相载体，这些包被的抗原必须是可溶性的，或者至少是极微小的颗粒，经洗涤，加入含有被测抗体之标本，再经孵育洗涤后，加入酶标记抗抗体，(对人的标本来说即加酶标抗人球蛋白IgG、IgM)，再经孵育洗涤后，加底物显色,底物降解的量，即为欲测抗体的量，其结果可用目测或用分光光度计定量测定，本法用不同种抗原包被固相载体后，只要用一种酶标记抗人球蛋白，即可作多种人的传染病、寄生虫病以及其他疾病的血清学诊断。如用酶标记抗人IgM，则可用于早期诊断。 (二)材料：聚乙烯塑料反应板（PH9.6时可吸附蛋白Ag），抗原IL-2，待测血清，冻干酶联抗体，湿盒，37OC洹温箱，酶标仪等。（三）方法与结果（双
25、抗体夹心法为例）1抗体包被取洁净的聚苯乙烯微量反应板，于每孔内加抗IL-2抗体0.1毫升（用包被缓冲液稀释，蛋白含量10微克/毫升），置371小时，弃抗体液，用洗涤液3次每次3分钟。2加待测血清于每孔内分别加不同稀释度（如1：5，1：10，1：201：80）的待测血清，PBS空白对照，阴性对照血清，阳性对照血清各0.1毫升。置3730分钟，洗涤3次。3加酶联抗体于每孔加酶联抗体各0.1毫升，置3720分钟，洗涤3次。4加临时配制的底物溶液各0.1毫升，置暗处15分钟。加2M硫酸1滴终止反应。5. 结果判断：（肉眼判断）若颜色于阴性对照相同则为阴性，若较阴性对照深则为阳性，根据颜色深浅以（+）表
26、示。6用酶标仪检测：待测值除以阴性值的比值大于2.1为阳性，否则阴性。【思考题】一、有哪些实验可以检测机体的细胞免疫功能？二、常见的免疫标记技术包括哪些？ 三、试述ELISA常用的三种方法都是什么，何种检测抗原、何种检测抗体。【附】 细胞因子活性检测检测细胞因子对阐明机体免疫应答及其调节机制、免疫相关疾病的发生、发展规律和知道临床治疗均具有重要意义。细胞因子的检测主要分为免疫学、生物学和分子生物学三种检测方法。免疫学方法主要采用双位点ELISA法定量检测细胞因子，分子生物学方法主要检测细胞因子mRNA表达水平。本部分只介绍生物学方法检测细胞因子活性，其原理是根据细胞因子对特定的依赖性细胞株（即
27、靶细胞）的促增殖作用，以增殖细胞中的DNA合成或酶活性为指标，间接推算出细胞因子的生物学活性单位。一、IL-1生物学活性检测（小鼠胸腺细胞增殖法）白细胞介素-1（IL-1）主要是由活化的单核-巨噬细胞合成和分泌的一种细胞因子，具有活化淋巴细胞、协同刺激胸腺细胞增殖、参与抗体产生和促炎症反应等多种生物学功能。IL-1有IL-1和IL-1构成，结合同种受体，表现相同的生物学活性。用于检测IL-1生物活性的方法有多种，如小鼠胸腺细胞增殖法、D10G4.1细胞增殖法、EL-4细胞测定法等。（一）原理：IL-1与小鼠胸腺细胞共同培养时，IL-1可刺激小鼠胸腺细胞增殖。进一步通过3H-TdR掺入法或染料摄
28、入法判定小鼠胸腺细胞增殖量，推定IL-1的生物学活性。通过检测IL-1的生物学活性，可了解单核-巨噬细胞等的功能。（二）材料：110%FCS-RPMI-1640培养液。2LPS 用10% FCS-RPMI-1640配制10ug/ml。3刀豆蛋白A（ConA） 用10% FCS-RPMI-1640配制2.5ug/ml。43H-TdR5C57BL小鼠，610周龄，雌雄均可。（三）方法：1小鼠巨噬细胞产生IL-1的诱导（1）常规收集小鼠腹腔巨噬细胞，10%FCS-IMDM培养液悬浮细胞2106/ml，接种于24孔培养板，0.5ml/well。 （2） 每孔加20ug/ml LPS0.15ml，37，
29、5%CO2孵育3648小时。（3）此时培养上清内含巨噬细胞分泌的高水平IL-1，收集培养上清，12000r/min离心15分钟，将上清移入新的1.5ml试管中，-20冻存。2IL-1的生物学活性测定 胸腺细胞的制备：颈椎脱位处死小鼠，无菌取胸腺至于平皿中，加入5ml10%FCS-IMDM培养液，200目不锈钢网制成单个细胞悬液；1500r/min离心10分钟，再用5%Hanks液洗涤细胞2次后，重悬于10%FCS-IMDM培养液中，调细胞浓度为1.0107/ml。 加样：取胸腺细胞加入96孔细胞培养板，0.1ml/well。再加入IL-1待测样品或IL-1标准品，50ul/well，实验孔再加
30、入50ul ConA（终浓度0.625ug/ml），同时设培养液对照孔（0.1ml细胞+0.1ml培养液）、ConA对照（0.1ml细胞+50ul培养液+50ul ConA），均设3复孔。37，5% CO2孵育3660小时。 3H掺入：每孔加1.851010uBq/20ul（0.5uCi/20ul）3H-TdR，继续培养8小时。 测定：多孔细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤纸上，用液体闪烁仪测定3H-TdR掺入量（cpm）以净cpm值（实验孔- ConA对照孔cpm值）为纵坐标，对应的不同稀释浓度IL-1标准品为横坐标，在半对数图纸上绘制出标准曲线，再从标准曲线上查出待测样品中的IL-1含量。（四
31、）关键点 （1）吸取LPS刺激的小鼠巨噬细胞培养上清时，必须离心，以除去细胞及细胞破碎成分。 （2）ConA应选择淋巴细胞转化实验的亚剂量，即选择能够激活胸腺细胞，又不引起明显增殖的量，如果ConA过量，则不能有效反应IL-1的刺激活性。二、IL-2生物学活性检测（MTT）（一）原理白细胞介素-2（IL-2）是由活化的辅助性T细胞分泌的一种细胞增殖因子，具有促T细胞增殖和维持T细胞体外长期生长的作用。CTLL-2为IL-2依赖细胞株可用作IL-2生物学活性定量检测。本实验采用MTT分析法，通过测定CTLL-2细胞的增殖量，确定IL-2生物学活性单位。检测IL-2的生物学活性，可以间接了解辅助性
32、T细胞的功能。（二）材料 （1）1）10%FCS-RPMI-1640培养液，含2mmol/L谷氨酰胺、25mmol/LHEPES、10U/ml青霉素、100ug/ml链霉素。 （2）MTT（4，5-dimethythiazoyl-zyl2,5-diphenylterrajolium bromiole）用PBSA缓冲液配制成1mg/ml浓度工作液，4避光保存。 （3）IL-2标准品。 （4）PHA（200ug/ml）。（三） 方法 （1）人外周血T细胞分泌IL-2的诱生： 人PBMC分离：采用常规淋巴细胞分层液浓度梯度离心法分离PBMC，用10%FCS-RPMI-1640培养液调整细胞浓度为11
33、05/ml加样：接种细胞悬液于24孔培养板，每孔0.5lml，每孔再加PHA0.5ml，37度，5% CO2孵育48小时。 回收上清：吸出细胞培养上清，12000r/min离心15分钟，收集上清，-20度冻存。 （2）IL-2生物活性测定 CTLL-2细胞制备：取传代培养2448小时对数生长期的CTLL-2细胞，用培养液离心洗涤2次，每次1000r/min离心5分钟，再用10%FCS-RPMI-1640培养液调制细胞浓度为1105/ml。 加样：将细胞接种于96孔培养板，每孔0.1ml。同时将待测样品和标准品做倍比稀释，每孔加入0.1ml，每个稀释浓度均设3复孔。另设培养液对照孔（100ul细
34、胞+100ul培养液）。37，5% CO2孵育40小时。 MTT掺入：轻轻吸取上清液100ul，加MTT（1mg/ml）100ul，37度，5% CO2孵育2小时。 测定：离心培养板，2000r/min，5分钟，吸弃上清液，每孔加100ulDMSO，作用30分钟，用酶标测定仪于波长570nm测吸光值（A）。 计算：用标准品浓度和对应的净A570nm值（实验孔-阴性对照孔的A570nm值）绘制标准曲线。根据标准曲线求出待测样品IL-2水平。（四）关键点 （1）CTLL-2细胞存活率应大于95%。 （2）因标本中含IL-4等，可影响IL-2的测定，最好采用抗IL-4mAb吸附剂除去IL-4。三、I
35、L-8生物学活性检测（一）原理IL-8对中性粒细胞具有激活和趋化作用，通过检测中性粒细胞的迁移距离可以确定IL-8的生物学活性，即对中性粒细胞的趋化活性。（二）材料（1） 6%右旋糖酐生理盐水溶液。（2） 淋巴细胞分层液比重为1.077+（-）0.001。（3） 2%琼脂糖：称取2g琼脂糖，加入到100ml蒸馏水中，煮沸溶解。（4） 0.1%白明胶Hanks液。（5） DMEM培养液（2浓缩），内含20%FCS和0.75mg/mlNa2CO3溶液。（6） 甲醇溶液、Wright-Giemsa染液。（7） 洁净载玻片。（8） 打孔器，直径为3mm。（三）方法 （1）IL-8的诱生 常规分离PBM
36、C，洗涤后，调细胞浓度为5106/ml。 将细胞接种于24孔细胞培养板，每孔0.5ml。 加诱生剂LPS（20ug/ml），每孔0.5ml，37度，5% CO2孵育48h。 离心收集细胞培养上清液，用HCl溶液调为酸性（PH4.0），经SephadxG-75柱分离，收集活性组分即为待测的IL-8粗品。（2）IL-8的生物活性检测 琼脂板的制备；取溶化后50度左右保温的2%琼脂糖与等体积50度水浴预温的DMEM培养液（2浓缩），混合，取3ml加到洁净的载玻片上，铺成薄层，室温凝固后，放4度，进一步凝固3060分钟，红打孔器打孔。 中性粒细胞制备：常规分离人外周血中性粒细胞。 加样：取10ul中性
37、粒细胞悬液加入琼脂板各组中心孔，分别取10ul待检样品及阳性对照品加入样品孔，取10ulDMEM培养液加入对照孔；将玻片置于湿盒内，37度温育2小时。 染色：用甲醇溶液固定30分钟，用瑞氏染液染片并干燥。 检测：显微镜下分别测量细胞从中心孔向样品孔游走的距离（趋化游走距离）及向阳性对照孔的游走距离（自发游走距离），趋化 活性以趋化指数表示。 趋化指数=趋化游走距离/自发游走距离（四）关键点 为确认待检样品中IL-8的特异性趋化效应，最好同时比较抗IL-8抗体与待测样品作用后的趋化结果。实验四 细胞免疫检测II：淋巴细胞分离计数及活性（设计性实验 ）【实验任务】市场上有一广告产品，据说有免疫增强
38、作用，请设计一个方案证实之（从淋巴细胞数目及活性的角度考虑）。【目的要求】一、初步掌握从淋巴细胞数目及活性的角度证实某产品有免疫增强作用的实验设计。二、掌握用密度梯度离心的方法分离外周血淋巴细胞。三、掌握用溴花二氨基异硫氢化物法分离外周血淋巴细胞。四、了解用间接免疫吸附分离法分离外周血淋巴细胞。五、了解FCM的原理、操作步骤及其实用意义。【实验条件】一、淋巴细胞分离液(聚蔗糖一泛影葡胺)，外周血，肝素，Hanks液。二、注射器、针头、10ml离心管、滴管、乳胶头、试管、试管架、离心机、天秤。三、新鲜豚鼠血、兔红细胞（RRBC）、溴花二氨基异硫氢化物（AET）、淋巴细胞分层液。四、其它：Hank
39、s液，含小牛血清的199培养液，无菌生理盐水，3.5%氯化钠溶液，离心机等。【作业】请将你们小组的设计方案与技术路线在讨论完善后记录在实验报告本，并将可行的实验内容在实验课中实施。【参考资料】一、淋巴细胞主要分T淋巴细胞和B淋巴细胞两大亚群，它们具有不同的特性和功能，为此在进行某些免疫学实验时，首先需分离出纯的T淋巴细胞和B淋巴细胞，淋巴细胞广泛分布在组织和器官中，但由于采血方便，目前多由血液中分离淋巴细胞，从外周血中分离淋巴细胞的方法很多，下面介绍几种常用的分离淋巴细胞方法。二、密度梯度离心法（一）原理： 根据各类血细胞的比重不同，采用分离液提取淋巴细胞。分离液的比重稍高于淋巴细胞，而低于红
40、细胞和粒细胞；本实验用比重为1.077聚蔗糖一泛影葡胺淋巴细胞分离液分离出淋巴细胞。 (二)材料： 1淋巴细胞分离液(聚蔗糖一泛影葡胺) 2外周血，肝素、Hanks液 3注射器，针头，10ml离心管，滴管、乳胶头 试管，试管架，离心机、天秤（三）方法与结果： 1取肝素抗凝血：取静脉外周血2ml，每ml血加肝素2530国际单位。 2用Hanks液稀释一倍到4ml。 3用10ml离心管，加入2ml淋巴细胞分离液，在分离液的界面上轻轻加入4ml已稀释的肝素抗凝血。4将离心管装入离心机的套筒，平衡后，以2000转分的速度离心20分钟。 5此时可见液体分为四层，最下层是红细胞和粒细胞，分离液在它的上层，
41、最上层是血浆层，淋巴细胞在血浆层和分离液之间。用滴管直接插入淋巴细胞层（灰白色混浊层）吸取淋巴细胞。（见图）6将淋巴细胞放入含有Hanks液5m1试管中，充分混匀，1000转分离心10分钟，弃去上清液，即获得纯淋巴细胞。图用分层液离心后的血细胞层三、溴花二氨基异硫氢化物法（AET法）（一）原理：淋巴细胞与用溴花二氨基异硫氢化物（简称AET）处理的绵羊红细胞（SRBC）混合后，其中全部T淋巴细胞均能吸附AETSRBC，形成牢固稳定而巨大的E花环，较正常未处理的SRBC形成的E花环百分比为高，而且形成快速，不易脱落，重复性好。再经淋巴细胞分层液分离时，AETE花环易沉于管底，而未形成E花环的T淋巴
42、细胞，用低渗液解花环周围的AETSRBC，便可获得纯T淋巴细胞，而B淋巴细胞可直接取自分层液的界面。(二)材料：1新鲜豚鼠血，兔红细胞（RRBC），溴花二氨基异硫氢化物（AET），淋巴细胞分层液。2其它：Hanks液，含小牛血清的199培养液，无菌生理盐水，3.5%氯化钠溶液，离心机等。（三）方法与结果：1AETRRBC制备（1）AET溶液的制备称取AET粉剂402毫克，溶于10毫升蒸馏水中，使成为0.143M溶液，用4N NaOH溶液调pH9.0。该溶液必须新鲜配制，不宜久存。（2）AET处理RRBC取洗涤好压积的RRBC，按一份压积AETRRBC加入4份新鲜配制的pH9.0的AET溶液充分
43、混匀置37水浴15分钟，每隔5分钟摇匀一次。取出加冷无菌生理盐水至离心管口（12厘米）1800转/分离心5分钟。连续洗涤35次，每洗一次，必须充分摇匀，以减少AETRRBC粘附成团，并观察有无溶血。若有溶血现象，则用含小牛血清的199培养基再洗一次，最后配成10%AETRRBC悬液，置4保存，不得超过5天。（3）1%AETRRBC的配制：将预先配制并保存于4冰箱的10%浓度的AETRRBC，以含10%小牛血清的199培养液稀释至1%。2从新鲜豚鼠血液分离单个核细胞，操作见后试验。3AETE花环试验：将分离的单个核细胞（2106/毫升）与等量1%AETRRBC混合，置37水浴15分钟，每隔5分钟
44、摇匀一次，分装数管，每管23毫升，低速离心（1000转/分钟）5分钟后，移至4冰箱45分钟。4T淋巴细胞和B淋巴细胞的分离将形成E花环的细胞悬液，再用淋巴细胞分层液分离，吸取界面云雾状的细胞，即为富含B淋巴细胞群。沉淀于管底的E花环，用Hanks液洗一次后，加双蒸水3毫升处理3分钟，低渗裂解E花环周围的RRBC，立即加3.5%氯化钠溶液1毫升，使还原为等渗，低速离心沉淀，即得富含T淋巴细胞群。【作业】请将你们小组的设计方案在讨论完善后记录在实验报告册，并将可行的实验内容在实验课中实施。【思考题】一、为什么要将待分离血液稀释一倍?二、为什么在分离液界面上加肝素抗凝血时不能打乱两液间的液面?【附】
45、一、间接免疫吸附分离法（一）原理 将T细胞与针对某种T细胞亚群特异表面分化抗原的特异性鼠抗人单克隆抗体一起孵育，再置人预先包被有羊抗鼠Ig的平皿中。此时结合有鼠抗人特异性抗体的T细胞亚群将吸附在平皿中，而其他T细胞则不被吸附，由此即可将某一T细胞亚群从T细胞群体中分离出来。现以用抗CD8抗体将T细胞分为CD4+与CD8+细胞两大类为例。（二）材料1羊抗鼠Ig，对T细胞无毒性作用。2特异性鼠抗人CD8单克隆抗体或多抗。315X100mm塑料平皿。4已纯化的T细胞悬液。（三）方法1用pH9.5，0.05molL的Tris-HCl缓冲液将羊抗鼠Ig稀释至10gml，加10ml至平皿中，室温下孵育40min，或4下孵育24h，轻摇平皿使整个皿底均被抗体包被。此平皿在4下可贮存12周。2测定抗CD8抗体的最适使用浓度，并用PBS将抗CD8抗体稀释至该浓厦。3将21073
