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1、柱层析培训SundiaXie Lihua,2012,柱层析的原理,硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离，一般悄况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。,主要步骤,一、估算和称量硅胶。,二、选柱子，,三、装柱,四、上样。,五、过柱和收集。,六、检测。,七、样品最后处理。,一、估算和称量硅胶。,200 一 300目硅胶，称 15 一 30倍上样量；这个比例不是绝对的，如果是很好分的样品，比例可以更低，如果是很难分的样品，比例还可以更高，如果极难分，也可以用 50 倍量硅胶H。但超出50就没有太大意义了。干
2、硅胶的视密度在 0.4 左右，所以要称 40g硅胶，用烧杯量 100ml 也可以。,二、选柱子。,柱子的大小是根据硅胶的用量决定的，硅胶的用量又是由样品的性质和数量决定的，其次就是柱子应该装多高，通常柱子的高度是根据它的直径来决定的，大约柱高：柱直径的比例是1:61:10，这个比例也不是绝对的，好分的样品可以用短粗的柱子，高/径比例就低，难分的要用细长的柱子，高/径比例就高些，但也不是越高越好，太高了，过柱时间太长，无序扩散厉害，反而分离效率低。有了以上的两条，基本上就可以算出来要选用什么尺寸的柱子了,三、装柱。有干法装柱和湿法装柱两种,真空干法装柱：在色谱柱下端接上真空，把干的硅胶一次性直接
3、倒入干净的色谱柱，轻轻拍打柱身使柱子结实、上端面平齐，然后再加装石英砂。再小心加注过柱起始洗脱配比的溶剂。这时候溶剂会被真空快速吸到柱子下端，此时一定要保持真空不能松懈，否则功亏一篑。直到有溶剂流出后，就可以关闭柱子的下阀门，再拔掉柱子下的真空，让柱子内部的压力自动平衡。注意溶剂液面，千万别让柱子干掉。平衡后，压掉多余的溶剂（液面压到与石英砂平齐），就算装好了。,三、装柱。有干法装柱和湿法装柱两种,湿法装柱：先要把干硅胶搅成匀浆，具体做法是加入干硅胶体积一到两倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌，如果洗脱剂是石油醚乙酸乙酯丙酮体系，就用石油醚：如果洗脱剂是氯仿醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂
4、太少或者其中含水量太大，尤其是用乙酸乙酯丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。然后如果是小柱子装上蓄液球，打开柱下活塞，保持柱子通畅，把硅胶与低极性溶剂混合的悬浊液（硅胶溶剂比约1:12）倒入柱子将匀浆一次倾入蓄液球内。然后轻轻敲打柱身使混入的气泡自然排出。然后随着沉降，会有些硅胶沾在蓄液球内最后用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。如果柱子比较大，敲打柱身一般是排不出气泡的，还需要用干净的搅棒，轻轻朝一个方向慢慢搅动，以利于气泡的排出。如此反复几次，再用装柱溶剂把柱子压实（约2倍柱体积溶剂），在保持
5、10cm以上的溶剂高度下，慢慢加入石英砂，再把液面压到与石英砂平齐，柱子就装好了。注意悬浊液既不能太稠也不能太稀，太稠会影响流动性，气泡不容易赶出，导致柱身有空洞，太稀了太花时间，影响工作效率。,三、装柱。有干法装柱和湿法装柱两种,干法和湿法装柱的共同注意事项及优缺点比较：鉴于硅胶是弱酸性的，如果过柱样品对酸敏感或者本身是碱性的，一般在装柱溶剂中添加2-5%的三乙胺，可以改善敏感和拖尾。如果是加压，一定记住先泄压，再关柱子的阀门，否则柱填料可能会被顶空，如果是真空负压，则一定是先关阀门，然后再泄真空，否则也是会被顶空。总而言之，时时刻刻都要保持柱子的下端压力一定不能超过上端。干法优缺点：这种方
6、法的好处是速度快，柱子装的非常紧密，柱效相对较高。不好的地方是，操作较苛刻，柱子的下阀门一定不能漏。有时候柱子过于密实，影响洗脱流速。湿法优缺点：操作相对简便，但费时费事费溶剂，硅胶容易扬尘。,四、上样。有干法上样和湿法上样两种,干法上样：就是把样品溶解后加入粗硅胶，然后除去溶剂，先把样品制砂。要点有以下几点，样品一定要全溶，不能用细硅胶，制砂一定要干燥彻底。特别是溶样溶剂如果是大极性时，更要干燥彻底。否则，会影响洗脱时的实际洗脱比例，导致分离效率过低。样品：粗硅胶：溶剂的大概比例为1:12：2左右，具体比例还要根据样品的溶解性和粘稠性确定。难溶、粘稠的样品，硅胶和溶剂的比例就越高。硅胶过少会
7、让粘稠难溶的样品粘结成团，无法均匀分散，洗脱的时候，洗脱剂只会冲洗到团块的表面，而洗不到团块的内部。导致拖尾严重和回收率损失。硅胶过多则造成浪费，同时也会造成拖尾。,四、上样。有干法上样和湿法上样两种,湿法上样：对于在较弱极性溶剂（如石油醚）中易溶且流动性良好不粘稠的样品，可以用湿法上柱。就是把样品直接用溶剂溶解，直接滴加到硅胶柱上，选取的溶剂有讲究，最好极性是略小于过柱起始洗脱的溶剂。溶解的容积比例最好不要超过1:3，否则，上样太长，影响分离效果。如果待分离样品是流动性良好的液体，可以不加溶剂稀释直接上样。上柱的时候同样应尽量保持硅胶柱上端面的平整。,四、上样。有干法上样和湿法上样两种,干法
8、和湿法上样的共同注意事项：尽量不要破坏硅胶柱上端面的平整。越平整越好。干法优缺点：干法上样理论上适用于所有样品。但这个方法的缺点就是制砂过程太费时、费事，又浪费溶剂。产品热稳定性不好时，操作上要特别小心。否则容易坏掉。有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如 DMF，DMSO等，会随着溶剂一起走，显色是一个很长的脱尾），这时就必须用干法上柱了。湿法优缺点：湿法上样的优点是快速。缺点是适用范围窄。如果样品的溶解性不好，就会造成样品在柱子里析出来，导致样品与硅胶结块成团。特别是用溶解性好的溶剂上样，用溶解性不太好的溶剂做起始洗脱。很容易发生这种情况。这种情况较多发生在用DCM、甲醇洗脱体系，
9、因为这个体系里甲醇极性大，但溶解性弱。如果是PE/EA体系，如果溶样溶剂的EA比例太高，也可能会发生这种情况。,五、淋洗和收集。,柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。收集的例子：100mg 上样量，3-5g硅胶 H,1-2ml 收一馏分。,六、检测。,要更多地使用专用喷显剂如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂低 12 个数量级。这一段已经有其他的人给你们培训过点板。我这里就不再重复。,七、样品最后处理。,收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm 左石
10、所谓的“硅胶”峰,经验分享一：关于柱子的选择,应该是粗长的最好。柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子10厘米，而样品曾就有2厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂馒馒冲了。而如果样品层只有 0.5 厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，成本和环保就是一个大问题。不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的也不计成本的人说）。不过溶剂重蒸回收后也就减小了部分浪费.现在见到的柱子径高比一般在 1:5 10，书中写硅胶量是样品量的
11、 30 一 40 倍具体的选择要具体分析如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分 rf 在0.20.4，杂质相差0.1 以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如 200 毫克的样品，用 2cmX20cm 的柱子）；如果相差不到 0.1，就要多用硅胶、加大柱子，也可以减小淋洗剂的极性等等。,经验分享二：关于淋洗溶剂的选择,洗脱剂的选择，过柱洗脱剂的选择往往是由点板展开剂决定的，感觉上要使所需点在rf0.2一0.3左右的比较好。不要认为在板上爬高了分的比较开过柱子就用那种极性，如果rf在0.6即使相差 0.2也不容易在柱子上分开，因为柱子是一个多次爬板的状态，可以通过公式的比较：0.8/0.6一
12、次的分离度，肯定不如（0.3/0.2）的三次方或四次方大，但是也不是绝对的，特别是针对难溶性的样品，因为点板的时候，一般都不用考虑板的载量问题，但是过柱就必须考虑。溶解性太差就会造成柱载量很低，过载的情况下，往往分离效率和回收率都很低。选取的原则是在溶解性和极性之间平衡考虑，极性最好控制所要产物的Rf0.5，超过分离效果就会很差，最好是0.2-0.3之间。如果在该极性条件下，样品溶解度太差，就要适当牺牲极性、适当提高溶解性。比如由PE/EA体系转换成DCM/乙醚的体系。,经验分享三：关于操作过程,1、装柱柱子下面的活塞一定不要涂润滑利，会被淋洗剂带到产品中的，可以采用四氟的。干法和湿法装柱觉得
13、没太大区别，只要能把柱子装实就行。装完的柱子应该要适度的紧密（太密了淋洗剂走的太慢），一定要均匀（不然样品就会从一侧斜着下来）。书中写的都是不能见到气泡，我觉得在大多数悄况卜有些小气泡没太大的影响，一加压气泡就慢慢消失。但是大气泡不行。当然如果你装的柱子总是有气泡就说明需要多练习了柱子最忌讳的是开裂，甭管竖的还是横的，都会影响分离效果，特别是竖的，甚至作废！,经验分享三：关于操作过程,二、加样用少量的溶剂溶样品加样，加完后将下面的活塞打开，待溶剂层下降至石英砂下方时，再加少量的低极性溶剂然后再打开活塞，如此两三次，一般石英砂就基本是白色的了。加入淋洗剂，一开始不要加压，等溶样品的溶剂和样品层有
14、一段跟离（1一3cm 就够了），再加压，这样避免了溶样溶剂（如二氯甲烷等）夹带样品快速下行。,经验分享三：关于操作过程,三、洗脱洗脱时的流速和压力控制，理论上柱子的分离效率与流速没有太大关系，反而是越快越好，但是由于实际装填的柱子，密实性和均匀性都不可能达到理想状态，所以应该控制适当的流速，不能太快，合理的流速可以让流动相在不均匀的柱子里有足够的时间重新自我平衡，从而提高分离效率。还有就是高流速必须要有高压力，普通的玻璃柱，耐压都不能超过3atm，越大的柱子越不耐压。安全角度考虑，最好不能超过1.5atm。直径超过25cm的玻璃柱子，基本就不能再加压了。流速也不能太慢，前面说了，太慢的话，会由
15、于各组分的无序扩散，降低分离度。鉴于此，大尺寸的柱子就必须用粗硅胶做填料，而不能用细硅胶。用细硅胶，在不能加压的情况下，流速会很慢既浪费时间、效果也会很差。所以过柱的时候，只要确保安全，1.5atm以下的加压对于分离效率不会有什么影响，但可以大大节省时间。在上样和刚刚开始洗脱时，在柱子还没完全平衡的情况下，尽量不要上太大的压力，一般上样层粘稠阻力较大，马上加压很容易会把上样层击穿，一旦击穿，柱子的整体性就被毁了。这就好比跑马拉松比赛有些人抄了近道。！,经验分享三：关于操作过程,4、样品的收集首先，每个收集容器都要依次编号，否则一旦弄乱了，就将前功尽弃。理论上每个收集单位收集流出液越少越好，但太
16、少了，所需要的收集单元就越多，劳动量太大。每管收集太多，容易把原本分开的组分重新混起来收集在了一根试管里。所以一般我们控制每个收集单位不超过上样量20倍体积。如果是小量过柱，我们可以一口气收集50管甚至100管以上，然后每隔10管取一个样，把若干个样同时点在一块板上，先找到产品大约在什么位置，然后再在起点和终点附近精确定位，也是一块板上多个点，这样的话只要3-4块板基本就能把要的组分确定下来，大大提高工作效率。采用这种方法过柱，只要编号不乱，可以同时过好几根柱子，工作效率可以翻几倍。边过柱边点板，往往造成效率低下。浪费层析板。有时来不及更换收集瓶，会流到外面来。好处就是需要的组分出完了，就可以
17、及时终止，可以节约溶剂。但对于小量的过柱，溶剂用量有限，浪费时间反而更不值得。另外用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。有时候会发生后面的点先出，而前面的点后出。这是因为如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出。,经验分享三：关于操作过程,5、最后的处理柱分后的产品，由于使用了大量的溶剂，其中的杂质也会累积到产品中，所以如果想送分析最好用少量的济剂洗涤一下，因为大部分的杂质是溶在溶剂里的，一洗基本就没了，必要时进行重结晶。,经验分享四：关于操作过程中其他情况,另外，在过柱的时候，有时会出现气泡，一是和使用的溶剂有关，如果是易挥发的溶剂，如乙醚、二氯甲烷等，在室温稍高的情况下，很
18、容易出现这种现象，因此，在室温高的时候，可以选择沸点较高，挥发相对小的溶剂。还有使用混合溶剂时，使用的两种溶剂的沸点应该相差不大，如：乙酸乙酯和石油醚（6090),如用乙醚却要选择30 一 60 的石油醚。二是：不论是用带砂板的还是塞棉花的，在装柱之前，最好都要用N2吹一下将空气排干净，这样就可避免潮湿天气柱中空气里的水分干扰。,谢谢！,人有了知识，就会具备各种分析能力，明辨是非的能力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋。”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，培养逻辑思维能力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培养文学情趣；通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。有许多书籍还能培养我们的道德情操，给我们巨大的精神力量，鼓舞我们前进。,
