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1、其它工具酶2014-9-29,一、逆转录酶逆转录酶（reverse transcriptase）是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，又称RNA依赖的DNA聚合酶，其产物DNA 称cDNA，即互补DNA。逆转录酶也是一个多功能酶,1、RNA依赖的DNA聚合酶以RNA链为模板，以带有3-OH末端的DNA片段为引物，沿5 3方向合成DNA链。几乎所有真核生物的mRNA分子3末端都有一段Poly A，故加入寡聚dT后，mRNA就可以成为逆转录酶很好的模板，由此可合成cDNA。,2、外切RNA酶活性底物是RNA-DNA杂交分子中的RNA链，其水解方向有两种：从RNA链5末端外切：称5 3外切RNA酶从
2、RNA链3末端外切：称3 5外切RNA酶,3、DNA依赖的DNA聚合酶以ssDNA为模板，以带有3-OH末端的DNA片段为引物，沿5 3方向合成DNA链。可在新合成的DNA链上合成另一条互补DNA。,4、逆转录酶在基因工程中的应用,合成cDNA，克隆至载体中；黏性末端补平、标记；双脱氧测序时，如用其它酶效果不好，可使用反转录酶。,5、商品化的逆转录酶禽成髓细胞瘤病毒（AMV）逆转录酶Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV）逆转录酶两种逆转录酶均无3 5外切DNA酶活性，故不具备校对功能，在高浓度dNTP和Mn2+存在下，容易出现核苷酸错误掺入。,二、甲基化酶（Methylase）,(一)甲基
3、化酶的种类与识别序列(二)甲基化对限制酶切的影响,原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。,1.限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶,三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤。,2.E.coli 的dam、dcm甲基化酶,这类甲基化酶与限制酶无关，不构成相应的限制修饰系统。Dam 甲基化酶可在 GATC 序列中的腺嘌呤 N6 位置上引入甲基。G mATCDcm 甲基化酶识别 CCAGG 或 CCTGG 序列，在第二个胞嘧啶 C5 位置上引入甲基。C mCAGG C mCTGG
4、,该酶可使CG中的胞嘧啶甲基化，其甲基化反应与DNA复制、基因转录等过程有关。,3.哺乳动物的甲基化酶,E.coli 中至少有 3 种依赖于甲基化的限制系统 mcrA、mcrBC 和 mrr 它们识别的序列各不相同，但只识别经过甲基化的序列都降解由 CpG 甲基化酶（M Sss）作用的 DNA。,4.E.coli中依赖于甲基化的限制修饰系统,(一）甲基化酶的种类与识别序列(二）甲基化对限制酶切的影响,1、修饰酶切位点,M.Taq 处理 DNA 后，GTCGAC 将不受 Hinc 切割。,2、产生新的酶切位点,Dpn 是依赖甲基化的限制酶TCGATCGA 受 M.Taq 处理后形成甲基化产物 T
5、CG*ATCG*A，其中 G*ATC 即为 Dpn 位点。,三、核酸酶SI,1.作用特点：此酶是从米曲霉（Aspergillus oryzae）中提取的，可降解ssDNA或RNA，又称单链特异性酶，其降解产物是5-磷酸末端的单或寡核苷酸片段。,核酸酶SI对DNA底物的活性比对RNA强。高浓度的核酸酶SI可从缺口（nick）或裂口（gap）处降解dsDNA。,2.作用条件：需要Zn2+作为辅助因子，最适pH是4.5这是与基因工程的其它工具酶不同的两个特点。3.在基因工程中的应用：由于核酸酶SI能从DNA片段中切除单链尾巴，因而在质粒的重建和DNA重组中被广泛使用。切除单链粘性末端，产生平末端，再
6、用T4连接酶连接。切除cDNA的发夹结构。,1.作用特点：此酶是从小牛腺中提取的，可催化单核苷酸转移到另一个DNA分子的3-OH末端上，不需要模板，其引物是带3-OH末端的ssDNA（Mg2+为辅因子）。平末端的dsDNA或带有3延伸末端的dsDNA，只有CO2+存在时才能作引物。,四、末端脱氧核苷酸转移酶,2.在基因工程中的应用：在连接平末端DNA片段时加上互补的同源多聚物（同聚物加尾法）,五、外核酸酶III,1.作用特点：此酶是从E.coli中分离得到的，是一种从dsDNA的3-OH末端降解产生5单核苷酸的外切酶。2.在基因工程中的应用：产生具有5延伸末端的DNA片段制备特异的DNA探针,
7、作用特点此酶是从乳白短杆菌（Brevibacerium aldidum）中提取的。能以渐进的方式从线型DNA分子的3，5两端同时降解，产物是单核苷酸或寡核苷酸片段：形成截短了的平端双链 DNA 分子（约占 10-20%）以及带有约 5 个核苷酸突出单链的截短分子（约占 80-90%）。作用对象：可以是带粘末端或是平末端的dsDNA，对3，5两端的结晶速度相同。,六、外核酸酶Bal 31,2.作用条件：降解时需要Ca2+作辅助因子，以EDTA作螯合剂，可使Bal 31失活3.在基因工程中的应用：可用于组建DNA的物理图谱，以及造成克隆DNA分子的末端缺失,1.作用特点：此酶是从噬菌体T4感染的E
8、.coli中分离的能催化ATP的-磷酸转移到DNA或RNA的5-OH末端上,七、T4多核苷酸激酶,2.在基因工程中的应用：可用于缺乏5-磷酸的待连接DNA片段的5端磷酸化：反转录mRNA生成的cDNA、人工合成的DNA片段及PCR扩增得到的DNA都缺少5-磷酸基，在与克隆载体连接之前，需用T4多核苷酸激酶将DNA的5-磷酸化。,1.作用特点：从细菌中分离的碱性磷酸化酶简称BAP从小牛肠中分离的简称CAP。它能特异性地切去DNA或RNA的5-磷酸。底物可以是ssDNA、dsDNA或RNA，也可以是核糖或脱氧核糖核苷三磷酸。,八、碱性磷酸化酶,2.在基因工程中的应用：在用32P标记DNA的5末端之
9、前，除去未标记的磷酸。在DNA重组技术中，除去DNA片段的5-磷酸，阻止质粒自身环化，提高转化效率。,形成带有两个缺口的开环分子，由于环状DNA（即使是有缺口的环状DNA）的转化效率比线状质粒DNA片段高得多，因此绝大多数转化子都含有重组质粒，并且这样的缺口在寄主细胞内可自行补上。,九、依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶,1、来源：,SP6 噬菌体 RNA 聚合酶来源于感染鼠伤寒沙门氏菌 LT2 菌株 T4 或 T7 噬菌体 RNA 聚合酶来源于噬菌体感染的大肠杆菌,RNA 聚合酶实际上就是转录中的 RNA 合成酶，识别 DNA 中各自特异的启动子序列，并沿此 dsDNA 模板起始 RNA 的
10、合成。无需引物，但需识别特异性位点。,2、活性：,体外合成 RNA 分子。用于表达外源基因。,3、用途：,RNaseA 来源于牛胰，为内切核酸酶，可特异攻击 RNA 上嘧啶残基的 3端。可除去 DNA:RNA 中未杂交的 RNA 区，可用来确定 DNA 或 RNA 中单碱基突变的位置。广泛用来去除 DNA 样品中的 RNA。,十、核糖核酸酶 A（RNase A）,DNase 来源于牛胰，是内切核酸酶，可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链 DNA。DNase 用途广泛，如切口平移标记时在 dsDNA 上随机产生切口；在闭环 DNA 上引入单切口，以将分子截短；建立随机缺失的嵌套缺失体，用于功能分析或测序；除去 RNA 样品中的 DNA。,十一、脱氧核糖核酸酶（DNase）,RNase H是内切核酸酶，特异性水解与 DNA 杂交的 RNA 上的磷酸二酯键，产生带有 3-OH 和 5-磷酸末端的产物。,十二、核糖核酸酶 H（RNase H）,十三、DNA结合蛋白,单链 DNA 结合蛋白（SSB）RecA 蛋白质 拓扑异构酶,
