BD FACSCalibur中文操作手册FACSCalibur分选.doc

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1、第六章 FACSCalibur 分选本章要点1. 分选原理2. 维护分选管路3. 分选操作4. 纯度检验61 分选概述流式细胞仪流动室中细胞由下至上运动，流动室喷嘴上方有捕获管用于收集细胞。细胞通过激光时，电子系统马上依据分选门的限定判定该细胞是否为目的细胞，如确定，即依照之前用户选定的分选模式分选。一旦决定捕获该目的细胞，电子系统在移动捕获管至样本液流中进行捕获前等待一段固定时间以便让细胞到达捕获部位 。捕获管最大捕获速率为300/秒，不进行细胞分选时，捕获管停留在鞘液中。下图显示了捕获管静止与分选时的位置。由于捕获管等待捕获时停留在鞘液中，它在捕获细胞的同时也收集了鞘液，因此会导致样本稀释

2、，所以收获管必须离心以浓集细胞。 图16 1.1 收集系统分选后的细胞被收集到50mL收集管中，如图，收集管可以放置在3个收集端口。机器可以自动检测已连接的收集管数目并自动由左（管1）向右注入分选的样本。注满每管（4045mL）大约需要9分钟。如果在分选结束前收集管被注满，分选会继续，而样本会流入废液罐中。如果你想在收集管注满后继续分选，可以将其换下换上用BSA包被的新管，点击PAUSE , 然后点击START或RESUME。分选液路清洗按钮你的机器是否有清洗按钮取决于你购买时的选择。如机器配有清洗按钮，按动按钮，机器会自动冲洗分选管路。该按钮用于分选前检测管路是否干净，分选后冲洗管路。收集管

3、 图2 图36.1.2 分选模式分选液滴（sort envelope）是指捕获管捕获一个目的细胞时所收集的那一段样本液流，其大小反映了捕获管捕获细胞时在样本液流中停留的时间。当然，该液滴包含目的细胞，也可能包含非目的细胞，这就产生了矛盾：如果有非目的细胞与目的细胞在一起，捕获管是否该捕获该液滴？由此需引出分选模式，下图显示了不同分选模式下捕获管的分选策略。 图4 分选模式分选模式的选择依据目的细胞所占的百分比及分选的目的，例如，如果你在分选一个稀少的细胞群你会要求较低的纯度以便获得尽可能多的目的细胞。可供选择的分选模式有： 单细胞模式（single cell）只有在分选液滴中仅含有单个目的细胞

4、时才会发生分选，如有其它细胞在液滴中，则该液滴将不被捕获。该模式会有高纯度，不太重视回收率。 回收模式(recovery)如分选液滴中除含有目的细胞外还含有其它细胞，该液滴仍会捕获。如果另一目的细胞恰巧位于该液滴外，捕获管会在样本液流中继续停留至将其捕获。 排除模式(exclusion)只有在分选液滴中含有一个目的细胞且不含非目的细胞时分选才会发生。如果另一目的细胞恰巧位于该液滴外，捕获管不会在样本液流中继续停留捕获它。6.1.3 样本浓度与分选模式的选择 在样本速率为2000粒子/秒时会有最大分选速率，如果一个样本细胞浓度在107细胞/mL，使用低速（LO）即可得到最大分选速率。如样本浓度增

5、加，样本速率增加，反之则减少。如样本速率低于或高于2000细胞/秒则分选速率下降。 有时一个细胞浓度为107个细胞/mL的样本上机后，仍需调节细胞浓度以使分选速率达到2000粒子/秒，这可能是因为流式细胞仪低速并非绝对12L/秒（LO122L/秒），另一个原因可能是血球计数仪不计数红细胞、血小板及碎片等流式细胞仪计数的粒子。 如果你准备分选一个低浓度样本，最好使用2000粒子/秒（最高可达2500粒子/秒）时分选速率仍增加，表明未达到300次分选/秒，由于忽略了coincidence，分选纯度将随样本速率的增加而下降，这是由于非目的细胞出现在分选液滴中的可能随样本速率增加而最大。因此在超过单细

6、胞模式最佳样本速率2000粒子/秒时系统仍继续分选。6.1.4 样本速率对分选速率的影响 理解样本速率对分选速率的影响十分重要，下图显示了单细胞模式下两者的关系。对于不同给定目的细胞百分比的样本，其最大分选速率都出现在样本速率为2000粒子/秒时。例如，对一个含目的细胞60%的样本，在样本流速为2000粒子/秒时出现其最大分选速率300细胞/秒。注意：如果样本目的细胞含量低于30，在单细胞模式下将不能达到300次分选/秒的最大分选速率，例如，含目的细胞10的样本在样本速率为2000粒子/秒时其分选速率为50100次分选/秒。 图56.2 分选窗口6.2.1 SortSetup 从Acquire

7、 menu选择SortSetup 如图6。依据样本中目的细胞的百分比及实验目的决定分选模式，例如在分选所占样本比例小的群体时，应选择较低纯度以获得尽可能多的目的细胞。 图6 图7SortSetup窗口中的选项：l Sort Gate 显示逻辑门列表，用户从中选择分选门，如选择No Gate（所有细胞）将只进行获取不分选。l Sort Count-选择将要分选的细胞数，选择0将连续分选。l Sort Mode-有3种模式可供选择：Single Cell、Recovery、Exclusion 。l Aborted Cell-选择是否显示排除细胞数。细胞不能准确时将被排除，常见的情况是两个细胞出现距

8、离过近，即coincedence 。6.2.2 Sort Counters从Cytometer菜单选择Sort Counters，如图7。3个计数板可以显示4个速率或累积数：阈值（Theshold）、辅助（Auxiliary）、分选（Sort）、排除（Abort）。计数板1可以选择Theshold或Auxiliary计数板2可以选择Theshold或Sort计数板3可以选择Abort或Sortl 阈值（Theshold）速率或累积数-显示设定阈值以上检测的细胞速率（粒子/秒）或累积数（包括排除细胞） l 辅助（Auxiliary）速率或累积数-显示检测的全部细胞速率（粒子/秒）或累积数（包括排

9、除细胞）l 分选（Sort）速率或累积数-显示分选细胞速率（粒子/秒）或累积数l 排除（Abort）速率或累积数-显示分选细胞速率（粒子/秒）或累积数6.3 准备收集管收集管应用4%牛血清白蛋白（BSA）包被，以便在离心时保持细胞完整，提高收获率。BSA使用前过0.45m滤膜。4%牛血清白蛋白（BSA）用1PBS/0.1%NaN3配制。注意：如要分选活细胞，BSA溶液中不加NaN3！1. 在50mL锥型管中加满4 % BSA（1PBS/0.1%NaN3）。剩余BSA储存在2-80C。2. 将锥型管冰浴或冰箱至少放置1小时。3. 将BSA转入其他锥型管。 BSA溶液可以循环使用1个月。6.4 分

10、选6.4 .1清洗分选管线如果您的机器有冲洗按钮（Purge Button）l 进样针处放一支装有PBS的上样管，用PBS替换鞘液。l 按液流控制键RUN。l 在最左边的收集接口放上一支50 mL锥型管。l 点击冲洗按钮（Purge Button）。l 取下锥型管换到中间的收集接口。l 点击冲洗按钮（Purge Button）。l 取下锥型管换到最右边的收集接口。l 点击冲洗按钮（Purge Button）。l 按液流控制键STANDBY。如果您的机器没有冲洗按钮（Purge Button）l 进样针处放一支装有PBS的上样管，用PBS替换鞘液。l 从左至右依次在收集接口放上3支50 mL锥型

11、管。l 按液流控制键RUN。l 点击获取控制窗口内的Aquire键。l 当最左边的锥型管收集大约2 mL时取下。同样操作中间及最右边的。l 点击获取控制窗口内的Pause、Abort键。l 按液流控制键STANDBY。6.4.2 准备分选前应优化流式细胞仪的测定条件，建立分选门。l 进入CellQuest。l 从获取菜单连机。l 打开CellQuest中存储的获取窗口，打开优化后存储的仪器设置条件。l 进样针处防上样本管。l 点击Aquire。l 点击工具栏，在FITC与PE双阳性的细胞群体圈门2。如图8，门1在优化时圈在淋巴细胞上。 图8l 从Gates菜单选择Gate List，定义G3

12、= R1 AND R2（旦门被定义，将变为斜体显示G3 ）此时FL1与 FL2双阳性的淋巴细胞将被分选。l 关闭Gate List。6.4.3 收集分选前数据分选前收集一个数据资料，将此数据与用分选后的样本收集的数据比较，以确定分选样本的纯度。l 选取存储文件夹及文件名l 选取存储参数，去除P6、P7。l 去除获取控制窗口SETUP前的 。l 获取样本。l 进样针处换上蒸馏水跑至少30秒。l 按液流控制键STANDBY。l 保存实验文件。6.4.4 分选条件设置l 从获取菜单选取SortSetup。l 分选门一栏选择G3=R1 AND R2。l 分选计数一栏选择0。l 分析模式一栏选择排除（E

13、xclusion）。l 排除细胞一栏选择不显示。l 点击OK。l 从Cytometer菜单选择分选计数板。l 计数板第一栏选择Threshold Total。l 计数板第二栏选择Sort Total。l 计数板第三栏选择Sort Rate。6.4.5 分选目的细胞l 确认除获取控制窗口SETUP前的 存在。l 从左至右依次在收集接口放上3支BSA包被的50 mL锥型管。l 按流速控制键LO。注意：注满一支50 mL锥型管大约需要9分钟。当锥型管注满，点击Pause，换新管，再点击Restart，计数板会回零，如点击Resume，计数板将继续计数。但无论点击Restart或Resume，分选收集

14、将从最左边的锥型管重新开始。l 点击液流控制键RUN。l 从进样针进样。l 点击获取控制窗口Aquire。l 分选结束时点击Pause，Abort。l 取下样本管，换上1mL蒸馏水。l 点击获取控制窗口Standby。l 取下收集锥型管。注意：分选的细胞含有大量BSA，如果实验要求低水平的外源性蛋白（如Western-blot），可以将细胞重新悬浮与1mL PBS中，转入干净的试管再离心。6.4.6 清洗分选管路准备注射器l 将注射器注满蒸馏水。l 排空气泡。l 将注射器与流式细胞仪SALINE FILTER端口连接。如图9。 图9如果您的机器有冲洗按钮（Purge Button）l 在最左边

15、的收集接口放上一支50 mL锥型管。l 进样针处放一支装有蒸馏水的上样管。l 按液流控制键RUN。l 点击冲洗按钮（Purge Button）。l 缓慢而有力的推进注射器柄，直至推入10 mL蒸馏水，进入收集锥型管。注意：每次点击冲洗按钮（Purge Button）真空泵将连续工作30秒，如果锥型管未收够10 mL，可以再次点击冲洗按钮。l 取下锥型管换到中间的收集接口。l 点击冲洗按钮（Purge Button）。l 取下锥型管换到最右边的收集接口。l 点击冲洗按钮（Purge Button）。l 取下注射器，重新连好液路。l 从获取菜单选择Sort Setup。l 分选门一栏选择NO GA

16、TE。l 点击OK。l 按液流控制键STANDBY，进样针处放上1mL 蒸馏水。如果您的机器没有冲洗按钮（Purge Button）l 从左至右依次在收集接口放上3支50 mL锥型管。l 断开滤膜。l 将注射器与流式细胞仪SALINE FILTER端口连接。l 进样针处放一支装有蒸馏水的上样管。l 按液流控制键RUN。l 确认除获取控制窗口SETUP前的 存在。l 点击获取控制窗口内的Aquire键。l 缓慢而有力的推进注射器柄，直至推入10 mL蒸馏水，进入收集锥型管。l 取下锥型管换到中间，同样操作中间及最右边的。l 点击获取控制窗口内的Pause、Abort键。l 按液流控制键STAND

17、BY。l 取下注射器，重新连好液路。l 从获取菜单选择Sort Setup。l 分选门一栏选择NO GATE。l 点击OK。l 按液流控制键STANDBY，进样针处放上1mL 蒸馏水。6.4.7 浓缩样本l 取下锥型收集管，盖好。l 离心300g 5分钟。l 用真空系统及巴斯德加样器吸取上清。l 将细胞重新悬浮于0.5mL PBS中。l 将细胞悬液转移至12 75mm Falcon管中。6.5 检验分选纯度分选后细胞纯度应在95%以上。包括：l 获取一个分选后数据资料。l 检验分选纯度。注意：收集分选后数据资料前应跑3分钟蒸馏水，确保分选前的残存细胞不影响分选后数据资料的分析。1、 用先前的获

18、取窗口或文件获取分选后的细胞，存储一个数据文件。2、 重新定义FSC & SSC,FL1 & FL2 两个获取窗口为分析窗口，设为NO GATE。3、 载入分选后 数据资料至两窗口。4、 做两窗口的门内统计。5、 比较 % Gated 与 % Total for G3（两者数值应一致）。6.6 分选问题讨论下列几个因素会影响分选的结果，是实验中需要严格控制的关键。1、 鞘液l 分选前切记拧紧鞘液桶盖。分选过程中，鞘液流速是决定分选时间的重要因素，鞘液桶盖不严或滤膜处大量气泡会改变液流流速，影响分选效果。拧紧鞘液桶盖后，仔细听有无嘶嘶声，如有，需要重新拧紧鞘液桶盖，如果鞘液桶盖已拧紧，仍有嘶嘶声

19、，说明鞘液筒或盖子有漏洞，需要更换。l 分选前灌满鞘液，避免分选中加液。可以用CellQuest 中的Status窗口监测鞘液筒状况，但最好在实验开始前查看鞘液水平。2、 细胞收获率与存活率l 如果分选后的细胞不能马上转移，应将锥型收集管置于冰上。如果希望获得活细胞，应在分选后立即离心，离心后细胞于含蛋白培养基中40C冰浴。用5mL 冷的20% BSA在分选前包被收集管会提高细胞存活率。l 确定分选后的目的细胞都被收集了，在分选时间较短的情况下更为重要。分选结束后取下样本管，防上PBS管继续分选20秒以使所有被分选了的目的细胞都能到达收集管。可以用CellQuest中的计时器（Timer）计时

20、。3、 分选l 优化样本测定阈值 阈值以下的粒子仪器会自动排除在分选之外。如果希望检测红细胞或血小板， 散射光阈值应射得足够低，使其能够被检测到。 如果阈值过低，机器会检测到碎片，碎片与目的细胞同时出现在一段分选液 柱的频率增大（coincidence），会影响目的细胞被分选。l 使用低速分选分选模式是依据低速液流建立，高速或中速会影响分选纯度。l 如果分选时细胞未到达收集管，检查分选液路及收集部件电子系统。小的盐晶会在分选管或收集部件处形成。轻触管路会使它们松脱，如果不行，见下一节栓块排除或日常维护清洗章节。注意：当打开分选装置盖检查时，激光会自动熄灭以确保安全。查看机器状态栏确保激光回复到

21、最大功率后再开始分选。如果分选时细胞仍未到达收集管，检查分选液路及收集部件后边的电子系统：分选时会有两个红灯亮着，一个表示机器处于分选模式，另一个显示处于收集状态的收集管位置。如果更换收集中的收集管，一个灯继续亮，另一个灯将转换到新的收集部位。如果此处有异常，请与BD工程师联系。l 长时间分选时经常摇晃样本管，防止样本沉积。样本沉积是分选中分选速度降低的最常见原因。 如果取下样本摇匀,应点击Pause停止分选。重新上样后等几秒钟再按Restart或Resume，避免在样本加压时分选。l 当收集管3收满后换上3个新的包被过的收集管，将收集设到管1。 4、 栓塞使用下列方法排除分选管路或收集管路中

22、的栓塞。l 确认进样针处有上样管，液流控制打到RUN。l 打开仪器盖，断开分选管路。即关闭到收集部的管路。 如果断端有液体流出，说明此处无栓塞，可以重新连上管路。反之，需要仔细检查该管路，有无可见颗粒、盐晶，可以轻压栓塞处管外壁以排除。l 检查收集部管路。5、 检测分选工作状况建议鞘液使用，用FACSFlow 稀释的CaliBRITE标准微球检测分选状况。l 清洗分选管路。l 样本采用未标记、FITC与PE标记的标准微球，FSC-SSC图上，圈单个微球群体为门1，FL1-FL2图上圈FITC阳性群体为蒽，设分选门G3=R1 AND R2。l 分选至3支BSA包被的50 mL锥型管中。离心300

23、g 5分钟。弃上清，流0.5ml 液体，重新悬浮细胞。用此样本获取一个分选后数据资料。l 用先前的获取窗口或文件获取分选后的细胞，存储一个数据文件。重新定义FSC & SSC,FL1 & FL2 两个获取窗口为分析窗口，设为NO GATE。载入分选后 数据资料至两窗口。做两窗口的门内统计。比较 % Gated 与 % Total for G3（两者数值应一致）。% Gated应在95%以上。分选样本的纯度与样本处理技术密切相关。 6、 结束分选结束分选的方法选择结果获取控制窗口Acquisition Control Window分选设置窗口Sort Setup Window获取与存储窗口Acq

24、uisition &Storage Window 点击Pause，Abort分选结束Setup 前打分选计数板设到0分选继续，但不存储数据Setup 前无分选计数板设到0设定获取细胞数达到设定细胞数时分选停止，存储了一个数据文件Setup 前无分选计数板设到0设定获取细胞数或获取时间达到设定细胞数或时间时分选停止，如果希望用时间标准，可以将获取细胞数设大，即在到达细胞数标准前到达时间标准。存储了一个数据文件Setup 前打设定分选计数板达到设定细胞数时分选停止，无数据文件存储Setup 前无设定分选计数板设定获取细胞数达到设定细胞数时分选停止，存储了一个数据文件Setup 前无设定分选计数板设

25、定获取细胞数或获取时间达到设定细胞数或时间时分选停止，如果希望用时间标准，可以将获取细胞数设大，分选计数设为0，即在到达细胞数标准前到达时间标准。存储了一个数据文件6.7 FACSCalibur无菌分选 FACSCalibur可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。1、 应用无菌技术制备下列无菌工作液。l 3L 70% 乙醇（乙醇用无菌蒸馏水配制）l 5L 无菌PBS2、 在干净的鞘液筒中加入3L 70% 乙醇（注意按无菌技术操作）。3、 盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗涤。

26、4、 安好鞘液筒，用一小瓶乙醇冲洗收集管接口处。5、 在收集管接口处安装3支收集管。6、 放上一支装有70 % 乙醇的进样管。7、 设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。8、 从Acquire menu选择SortSetup 。9、 在Sort Gate菜单中选择步骤设定的分选门。10、 按液流控制键RUN。11、 点击Acquisition Control菜单中Acquire。在Setup方框中打叉。12、 跑乙醇直至3支收集管注满。13、 点击Pause，Abort，断开鞘液筒。14、 重复上述步骤直至乙醇跑完。15、 在鞘液筒中加入500mL 无菌PBS，振摇鞘液筒，倒掉PBS，反复

27、操作直至洗净桶内壁残余乙醇。16、 在鞘液筒中加入3L无菌PBS，盖紧盖子。17、 安好鞘液筒。18、 在收集管接口处安装3支新的收集管。 19、 放上一支装有无菌PBS的进样管。20、 点击Acquisition Control菜单中Acquire。21、 跑PBS约10分钟以洗净管路中的乙醇。第一支收集管（最左）中收集15 mL PBS后取下，使PBS由左至右流入下一收集管。重复操作至3个管都收集了15 mL PBS为止。22、 点击Pause，Abort。23、 应用无菌技术，用无菌PBS/4 % BSA缓冲液包被50mL锥型管。24、 将包被好的锥型管安置于收集接口。25、 按前述分选

28、步骤分选样本。注意：无菌分选时机器所在的房间最好为无菌间，如不能达到，可以在房间内安装紫外灯，使用紫外线消毒。操作人员应穿着无菌衣，戴口罩、帽子操作。上样前可以以酒精喷雾消毒进样针周围。6.8 分选细胞浓缩系统6.8.1 系统简介细胞浓缩系统是FACSCalibur或FACSort流式细胞仪的附件，用来收集和浓缩被分选的细胞。这是一个完整的独立的系统包括一个可移动的浓缩器和一个废液罐。（见下图所示）通过将细胞浓缩系统连接在细胞仪的收集部位，你可直接将细胞分选到细胞培养嵌入物或者是浓缩器中的滤膜上。这个系统还配有废液罐，可以收集从分选细胞悬液中溢出的多余的鞘液。细胞浓缩系统的供气管路和分选管路都

29、连接在细胞仪第三个（即最右边）收集端口的位置，因此，配有细胞浓缩系统的流式细胞仪既可以将细胞分选至浓缩器，也可分选至其它两个收集端口。*注意：BDIS并无检验过该系统对细胞的活性有无影响，因此，不建议用户用细胞浓缩系统来回收有活性的细胞。1. 控制面板控制面板安装在细胞仪的收集部分，如图所示。系统开关，气压按钮和气压调节悬钮都位于这个面板上。Concentrator ON/OFF button这个按钮控制着细胞浓缩系统的开关，一旦打开，流式细胞仪将自动分选细胞到细胞浓缩系统而不是收集管，这时气压显示屏的灯亮，并显示000。Pressure ON/OFF button这个按钮控制着浓缩器气压的开

30、关，在打开气压之前，你必须确认系统的开关已经打开。一旦气压打开，显示屏会显示在000和999之间的某一个数字。Pressure ADJUST knob这个悬钮允许你调节浓缩器内的气压，增大气压也就增大了液流通过滤膜或细胞培养嵌入物的速度。显示屏显示的是外加在调节气流的阀门上的电压的大小。Sort-Line Purge Button位于控制面板下方的一个按钮，用于自动清洗分选管路。2. 浓缩器这个可移动的容器分成上下两个部分，通过细胞培养嵌入物或滤膜支持物隔开。被分选的细胞流经分选管路被沉积在培养基或是滤膜支持物中。空气被过滤后通过气管导入容器的上层，以起到加压的作用；容器的下层用来收集通过滤膜

31、的鞘液，一条废液管引导鞘液至废液罐，如图所示。容器底部安装了一块磁铁以确保该容器稳固地放置在细胞浓缩系统的基座上或是仪器的收集部位。3 废液罐这个1升的容器用来收集从被分选的细胞悬液中溢出的鞘液（如图），这部分鞘液通过滤膜，沉积到浓缩器的下部，然后被输出到废液罐，而洁净的空气最后则由一个0.22-um的滤器中逸出。记住，每次在你给细胞仪的鞘液罐添加鞘液时，同时倒空废液罐。6.8.2 细胞培养基嵌入物和滤膜的制备从浓缩器中回收细胞可通过两种途径：在滤器支持物中插入滤膜或是使用细胞培养基嵌入物。细胞培养基嵌入物在使用前需要经过小牛血清白蛋白（BSA）溶液包被，以防止被分选的细胞黏附在嵌入物上，使得

32、在分选结束后，细胞较易与嵌入物分离。使用滤膜不需要经过BSA包被，但在分选之前，你必须将滤膜与滤器支持物装配在一起。1 准备细胞培养基嵌入物s 将培养基嵌入物放入多孔培养板中；s 加入滤好的4%BSA溶液，浸没培养基；将BSA溶解于1X PBS + 0.1% NaN3中s 将平板盖紧，放入冰箱过夜；可在4保存一个月s 使用前用1X的PBS冲洗倒掉BSA溶液，用1X PBS冲洗，然后倒掉PBS，马上使用。2准备滤膜s 用专门的滤器镊子夹一片滤膜放在滤器支持物的底部（如图）滤膜无须用BSA包被s 将一白色的O环放置于支持物的上部；避免滤膜卷曲，若发现滤膜的位置不当，请重新调整。s 将支持物的上部与

33、底部旋紧（如图）。6.8.3 确定气压参数如何针对每一个不同大小和类型的培养基嵌入物或滤膜确定一个合适的气压，这对于整个分选过程是非常重要的。调节气压的悬钮，使得培养基嵌入物或滤膜支持物中的鞘液维持在一半的水平，这时的气压大小最为合适。对于任何一种特定尺寸的嵌入物，一旦你确定了气压的大小，可以将这一数值作为下一次调节同样大小的嵌入物的压力时的起始值。*注意：培养基嵌入物或孔径小于1 um的滤膜可能会使浓缩的速率小于鞘液流入嵌入物或滤膜的速率，从而导致在分选时鞘液从嵌入物或滤膜中溢出，在这种情况下，通常也很难将气压调节到一个合适的值。6.8.4 如何用细胞浓缩系统进行分选1 冲洗分选管路s 装配

34、浓缩器将浓缩器的上部顺时针方向拧紧，并确保浓缩器固定在系统的基座上，这时，不用安装任何插入物。s 按CONCENTRATOR ON/OFF按钮注意：在按Purge按钮前确保收集端口1和2上没有收集管。s 在进样针上换上装有PBS的试管，将液流控制设置成RUN，按下Purge按钮若分选管路中没有阻碍，你会看到鞘液从分选管路中滴到浓缩器的下部。s 若分选管道畅通无阻，可将液流控制回到Standby状态。2 准备在开始分选之前，你需要先优化实验条件，并设定分选门。3 收集分选前的数据文件在样本开始分选之前，你需要先收集保存一个数据，这样，才可能将分选后的数据与分选前的数据相比较来计算分选的纯度。4

35、确定压力的参考值s 将一个橡胶的O环放进浓缩器下部的固定器中s 将嵌入物支持物放在O环的上面s 将第二个O环放在支持物的上面s 确保O环刚好放进支持物的凹槽内（如图）s 将BSA包被的培养基嵌入物放入支持物中，并把浓缩器的上部盖上，顺时针拧紧（如图），但不要过紧。同时注意分选管道和废液管是否纠结在一起。s 若此时还没有按下CONCENTRATE ON/OFF按钮，请打开此开关s 在获取控制窗口中选择SETUP状态s 在分选设置对话窗中选择分选门s 在进样针上换上装有PBS的试管，将液流控制设置成RUN，开始获取s 当嵌入物中进入差不多一半的鞘液时，打开气压开关，开始对浓缩器加压s 通过压力调节

36、悬钮调节气压到一个合适的水平首先将悬钮调到500左右，然后逐渐调节悬钮，同时密切观察嵌入物中鞘液的变化，增大压力也就增大了液体流过嵌入物的速度，反之亦然。若此时鞘液持续稳定地保持在一半的水平，则表明压力合适。 *注意：若鞘液很快地充满了嵌入物，则点击PAUSE键，暂时停止获取和分选，同时顺时针方向扭动悬钮增加压力，使液面下降后再开始分选；若液面飞快地下降，则需关掉气压的开关，然后逆时针扭动悬钮减小气压使得液面上升，但不要忘了再重新打开气压的开关以免鞘液蓄满了整个浓缩器。s 一旦气压值确定，点击Pause，然后Aborts 关掉气压的开关s 将液流设置成STANDBY6.8.5 分选浓缩细胞s

37、在分选之前先在空的废液罐中加入100ml未稀释的漂白剂s 选择低速（LOW）进样s 将液流控制设成RUNs 放上样本管，点击Acquire*注意：不要试图用12-mm的培养基嵌入物分选超过50，000个细胞或25-mm的嵌入物分选超过200，000个细胞，分选的细胞数若大于嵌入物所建议的数目很容易造成嵌入物的堵塞。s 当鞘液在嵌入物中上升到一半的水平时，打开气压开关开始加压s 参照开始确定的压力参考值扭动压力调节悬钮，如需要，可以做些微调s 分选结束后点击Pause，然后Aborts 等到嵌入物中的鞘液积累到一个理想的水平后再关掉气压的开关残留在嵌入物中的鞘液量可以根据预期值或是细胞的浓度决定

38、。s 从Aquire菜单下找到Sort Setup命令s 在Sort Gate pop-up菜单中选择No Gates 点击OKs 这时细胞可以从浓缩器中移出做进一步的处理或是分析6.8.6 从分选管路中回收细胞当分选结束时，分选管路中总会残留一些细胞没有进入浓缩器，这一部分被认为是分选的死角。你也可以收集这些细胞或则希望在做另外一次分选前将其清除。s 分选结束后，取下样本管，换上装有PBS的试管，液流控制为RUN如果你希望回收这些残留的细胞，先不要移动浓缩器内的嵌入物，并且取下收集端口1和2的收集管，这样才能确保当按下Purge键时，管路中的细胞全部进入嵌入物。s 确定留在嵌入物中的鞘液足够

39、少以容纳管路中的鞘液进入若留在嵌入物中的鞘液过多，可打开浓缩系统的气压开关，清除掉一些鞘液，当达到理想的水平时关掉开关。s 按下位于收集部位的Purge键当Purging结束后，打开气压开关清除过多的鞘液，但要注意鞘液不可太少，这将会影响细胞的回收。6.8.7 回收细胞做进一步分析s 打开浓缩器s 用吸液管小心地吸打鞘液，将细胞重悬避免产生空气泡，如有必要可加入PBS来增加鞘液的体积s 用吸液管将细胞悬液转入另一个合适的容器6.8.8 清洗分选管路具体方法详见流式细胞仪分选部分。6.8.9 清洗浓缩器在每一天分选结束以后都应该将浓缩器清洗去污，但无论是浓缩器还是嵌入物或滤膜支持物都不能使用高温

40、高压灭菌，你可以使用下面任何一种清洗液清洗容器。u 70%酒精u 10%漂白剂s 将浓缩器与流式细胞仪去连接，包括气路，废液管和分选管路分别去连接s 用一个小的橡胶套套在浓缩器上部与分选管路连接的针头上作为保护s 拧开浓缩器，取出培养基嵌入物或滤膜的支持物，倒50ml清洗液进浓缩器的底部s 关上浓缩器，剧烈地摇晃一分钟（如图）s 将废液管和废液罐重新连接起来s 提高浓缩器使其高于废液罐，并稍微打开浓缩器使得清洗液可以流进废液罐s 如果清洗液用的是漂白剂，则再用蒸馏水重复以上步骤两次冲洗浓缩器s 擦干浓缩器，将其放在浓缩系统的基座上保存用一块湿布擦干净容器螺纹中的盐粒和污物，如打开容器时有困难，可用一块薄的硅脂涂在螺纹上。