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1、第八章 HLA-B27分析81 检测HLA-B27的意义HLA抗原是人类主要组织相容性复合体（Major Histocompatibity Complex， MHC）的表达产物，在免疫系统中主要负责细胞之间的相互识别和诱导免疫反应，调节免疫应答的功能。根据HLA抗原结构，功能与组织分布的不同，可分为三类：类分子为HLA-A、-B、-C系列抗原，广泛分布于各组织有核细胞表面，包括血小板和网织红细胞，成熟的红细胞一般不含HLA抗原；类分子为HLA-D/DR、-DP、-DQ系列抗原，主要在B细胞和抗原提呈细胞上表达，这两类抗原都与移植有关，其中类抗原更为重要；类分子为补体成分。近年来研究HLA与疾病
2、相关性的资料表明，某些疾病的发生率与一些特殊型别的HLA检出率有关，这些病大多是发病机理不明并伴有免疫功能异常和有遗传倾向性的疾病，因此，分析HLA抗原表达情况不仅有助于了解发病机理，对于疾病的诊断、预防和预后判断都有重要意义。HLA-B27基因属于型MHC基因，基本上表达在机体中所有含核的细胞上，尤其是淋巴细胞的表面有丰富的含量。早在二十多年前，人们就已发现HLA-B27抗原的表达与强直性脊椎炎有着高度相关性，超过90%的强直性脊椎炎患者其HLA-B27抗原表达为阳性，普通人群中仅5-10%的为阳性，而强直性脊椎炎由于其症状与许多疾病相似而难以确诊，因此HLA-B27的检测在病情的诊断中有着
3、重要意义。在脊椎性关节病这一类的疾病中除了强直性脊椎炎以外，还有许多其它的疾病与HLA-B27抗原的表达有着或多或少的相关性，比如说Reiter，s综和症，HLA-B27阳性率为70-90%；银屑病性关节炎，HLA-B27阳性率为50-60%；葡萄膜炎（眼色素层炎），HLA-B27阳性率为40-50%；溃疡性结肠炎伴有关节病，HLA-B27阳性率为5-10%等等，因此HLA-B27的检测在这些疾病的诊断中是一个非常有价值的指标。82 HLA-B27的检测方法821 传统方法常规检测HLA抗原的方法为Terasaki和McClelland提出的微量细胞毒实验，其基本原理是：标准抗血清中含有细胞毒
4、抗体，与待测细胞表面相应的HLA抗原结合，激活随后加入的补体，使细胞损伤或裂解，再利用染料排斥实验，通过显微镜判断受检细胞的活性。抗血清由经产妇提供，为多克隆的，因此其灵敏度和特异性都很难达到100%；再加上需要密度梯度离心来分离淋巴细胞，整个实验过程相当耗时且劳动强度较大；除此之外，它还需要专门的技术人员来诠释实验结果，无法普及。822 流式细胞术单克隆抗体和荧光素的开发使得流式细胞仪在各个领域得到空前的发展，多参数同时测定使得流式细胞术得以快速，灵敏，特异地检测某一特定细胞群中某一特异性抗原的表达。与传统方法相比，用流式细胞仪来检测HLA-B27的表达，无须分离淋巴细胞，操作简单，自动化程
5、度高；灵敏度可达100%，特异性达97.4%；结果稳定，样本之间，不同仪器之间，不同实验室之间可重复性高。BD公司推出的HLA-B27试剂盒与HLA-B27自动软件配套使用，为我们提供了一种快速准确地检测病人T-淋巴细胞表面HLA-B27抗原表达的方法。u 试剂盒介绍Reagent A：Anti-HLA-B27 FITC/CD3 PE，1.5ml包括FITC标记的抗-HLA-B27（GS145.2），与HLA-B27抗原特异结合，PE标记的抗-CD3（SK7），与人类T淋巴细胞特异结合。Reagent B：10X Lysing Solution，30ml使用前，用蒸馏水稀释10倍。Reagen
6、t C：Calibtation beads for FL1，1.5ml用于调试仪器。u 实验原理将单克隆抗体与外周血共孵育，裂解红细胞，洗涤固定后，上机检测。在检测之前，仪器已经CaliBRITE beads和HLA-B27 calibration beads调试成功，并通过试剂批号的后缀确定了decision marker的位置。HLA-B27软件首先在FSC-FL2的点图上确定CD3强阳性细胞群体的位置，设定一个CD3+T淋巴细胞门，然后再根据FSC设定光散射门，去除FSC过大或过小的细胞，确保门内至少有50%的CD3+T淋巴细胞，这样通过二者的结合，将随后进行的分析严格地定位在T淋巴细胞
7、上。注意：HLA-B27单克隆抗体（GS145.2）不仅可与所有已知的HLA-B27亚型结合，还会与HLA-B7发生交叉反应，少数情况下与其他HAL-B等位基因的产物也能结合。由于T细胞只表达HLA型抗原，所以通过分析T淋巴细胞上的抗-HAL-B27 FITC平均荧光强度，就能最大限度地减少检测假阳性，将HLA-B7或其他交叉反应阳性而HLA-B27阴性的样本与确实表达HLA-B27的样本区别开。软件随后计算FSC/FL2门内细胞抗HLA-B27 FITC信号的平均荧光强度，并与decision marker的值相比较，大于或等于则判定为HLA-B27阳性，小于则为HLA-B27阴性。deci
8、sion marker的值可从试剂批号的后缀中得到。由于每一批试剂的后缀都可能不同，因此，一定要注意输入正确的后缀。 HLA-B27阳性样本 HLA-B27阴性样本u 操作步骤样本的收集和准备用K3EDTA或heparin或ACD抗凝的真空采血管收集至少1ml的外周血，若不能及时染色，则最好选用ACD或Heparin，因此两种抗凝剂对保存细胞表面抗原之抗原性为了保证实验结果的可靠性，持久性较佳。请尽量在采血后24小时内进行染色，染色前将抗凝血室温放置，无须冷藏。固定保存、冷藏保存的样本和发生溶血的样本都不应该使用。染色和固定1) 在试管上对应于每一个样本作好识别标志；2) 加30ul试剂A到试
9、管中；3) 用微量移液器小心地将50ul充分混匀的抗凝血加到进样管的底部，确保WBC的浓度在3.5103-9.4103WBC/ul之间，低速混匀3秒钟，室温避光静置15-20分钟；注意：小心避免血样加到试管壁上，以免血与试剂不能充分接触，静置时避免样本直接光照4） 将10X 溶血素用蒸馏水稀释成1X，每管中加入2ml 室温1X的溶血素，立即低速混匀，避光室温静置10-12分钟，不要超过12分； 注意：溶血时间不应太长，以免破坏白细胞5） 静置后立即离心，室温，5分钟，转速300xg；6） 吸去上清液，留大约50ul液体于试管中以免损伤细胞团；7） 低速混匀，重悬细胞，每管中加入2ml 含0.1
10、%叠氮钠的PBS或CellWASH清洗细胞，低速混匀，室温离心5分钟，转速200xg；8） 吸去上清液，留大约50ul液体于试管中以免损伤细胞团；9） 低速混匀，重悬细胞，每管中加入0.25ml 1%的多聚甲醛来固定细胞，低速混匀，固定30分钟；10） 将已处理好的样本管盖好，避光保存于2-8以待上机检测。最好在染色后24小时以内分析样本，上样前充分混匀悬液以防细胞聚集。u 仪器调试由于HLA-B27的检测是基于抗HLA-B27平均荧光强度与decision marker的比较，而不同的流式细胞仪由于其光学系统和电子系统的微细差异可能导致测出的荧光值发生变动，为了保证同样的试剂在不同的仪器上得
11、到同样的结果，就需要以相同的标准来调试每一台仪器的FL1的电压，而这是通过试剂盒中的HLA-B27 calibRation beads来实现的。1） 用FACSComp和CaliBRITE beads检测仪器的工作性能，调节仪器的基本设置。在成功的基础之上（至少两色Lyse/Wash），方可进行HLA-B27的调试；2） 充分混合HLA-B27 calibRation beads，垂直向下滴两滴到1ml FACSFlow或PBS中，混匀，待测；3） 进入FACSComp软件，在Set Up窗口选择HLA-B27 Calib，输入正确的Beads Lot Number，Suffix和HLA-B2
12、7 Lot Number，Suffix，点击Accept，进入调试窗口；注意：Beads Suffix和 HLA-B27 Suffix中分别隐藏了FL1 PMT的标准和decision marker的位置，对于结果至关重要，不可弄错。4） 上样，点击Start，软件开始自动调节FSC放大器的倍数和FL1 PMT的电压，获取结束后，调试后的结果会被自动保存，并生成Summary Report，报告中包含所有你输入的信息，仪器当前的设置，调试的结果，FSC及FL1的直方图等。5） 调试成功后，也就意味着此时的仪器已经准备好做HLA-B27的检测了，当您进到Patients窗口时，调试后的仪器条件会
13、自动下载，不要更改任何条件，否则将影响您最终的结果。u 运行条件硬件要求s BD公司的FACSCalibur，FACSort，或FACScan流式细胞仪，使用FACStation数据处理系统。软件要求s HLA-B27软件s Macintosh操作系统7.1以上s FACSCompu HLA-B27软件文件s Flow Cytometry Standard（FCS）Data fileHLA-B27可生成并阅读FCS2.0数据文件，一个文件包括一个样本的所有数据。该文件无法浏览，但可进行分析，生成实验室报告。s Schedule Document File这个文件包括所有输入的信息和参量，文件名
14、后缀为.sch，如你选择保存这个文件（软件不会自动保存），你可打开查看，或继续未完成的操作，或者增加更多的样本。每次只能打开一个文件，不能打印。s Laboratory Report File 这是一个PICT文件，包括单个样本的分析结果以及FL1的直方图和FSC-SSC，FSC-FL2的点图，按管序排列，后缀名为.lab。可打开，打印，但不可编辑。s Summary Report FileTEXT文件，包含所有样本的分析结果。一个Schedule document文件对应一个Summary report，文件名后缀为.sum，可打开，输出，打印。u 菜单介绍Apple菜单包括About HL
15、A-B27，HLA-B27 alias及其它应用程序命令。从About HLA-B27中可得知HLA-B27这个软件的版本和系列号。File菜单F New Schedule 每次打开HLA-B27软件是都会生成一个新的schedule document，若当前状态下没有schedule document，你可通过这个命令打开一个新的。F Open Schedule 打开一个已经存在的并已被保存的schedule document。F Open Lab Report 打开一个已经存在的并已被保存的Lab Report。F Close 关闭当前的的schedule document 或Lab Re
16、port。F Save 保存schedule document。F Save As 将当前的schedule document换一个名字保存或保存到另外的文件夹中。F Save Report 保存Lab Report或Summary Report。F Page Setup 选择打印模式。F Print 打印报告。F Quit 退出程序。Edit菜单F Undo 删除当前的文本编辑命令，回到原来的状态。F Cut 从document中剪切所选的文本内容，并将其保存在剪贴板上。F Copy 复制所选的文本内容，并将其保存在剪贴板上。F Paste 将剪贴板中被剪切或复制的文本内容粘帖在光标所在的位
17、置。F Clear 删除所选的文本内容。F Select All 选择所有的文本内容。F Show Clipboard 显示剪贴板上的内容。Cytometer菜单F Detector/Amps 调节PMT的电压以及放大器的倍数。F Threshold 调节阈值。F Compensation 调节补偿，减少荧光信号之间的的重叠。F Status 显示仪器的当前状态。F Instrument Setting 查看、打印当前的仪器设置，保存当前的设置，或打开并下载原有的设置。HLA-B27菜单F Sign in 输入操作者，单位及实验室主任，登录软件。F Set up 输入本次测试的有关资料。F C
18、alibration 运行FACSComp及HLA-B27调试。F Patiens 输入病人资料。F Preference 设定输出，打印及比例尺等参数。u 软件运行4） Signing In输入操作者，单位及实验室主任，其中操作者是必须的。5） Setting Ups 选择数据来源（Data sources）From Data Files：对以前保存的数据作分析From Cytometer：运行样本，获取数据，并自动进行分析。如你选择这种模式，请输入须获取的细胞数（15000-50000），默认值为15000。在这里还显示了HLA-B27试剂及调试微球的产品批号，但不能编辑。s 确定您希望自
19、动保存的文件类型及保存位置若您是获取数据进行分析，建议您最好保存数据文件以备日后再作分析。所有文件的都有默认的保存路径且可通过Location更改。s 确定文件名的前缀可以是病人姓名，病人编号，病历号，日期或用户自定义。s 选择阅读报告所需的时间建议您选择Until “Next”Button Pressed6） Calibration若您选择的数据来源是From Cytometer，Setting Up之后会出现Calibration窗口，显示您最近一次的调试结果及时间，您可从这里进入FACSComp做HLA-B27的调试。若您在运行软件之前已经做完了调试工作，您可在这里点击Skip FACS
20、Comp，进入下一个窗口。7） 输入病人资料s 获取分析模式在相应栏中填写病人姓名，病人编号，或病历号，点击Run Test进入获取窗口。s 分析模式点击Add Patient Files，选择需要分析的数据文件，填加到病人信息栏中，点击Run Test进入分析。8） 获取s 上样，将流速调到HI，不要调节仪器的设置，此时仪器的条件是经过调试适合于HLA-B27测试的，任何变动都将影响最后的结果。s 点击Acquire，开始获取细胞，直到获取到所需的细胞数。在获取的过程中，如需要可以点击Pause键暂停，暂停后您有如下选择：Stop 结束所有的测试回到Patiens窗口Restart 清除刚才
21、保存的不完整数据，回到获取前状态，再点击Acquire重新开始获取Skip 放弃当前的样本测试，进入到下一个样本的获取Resume 继续刚才没有完成的获取Analyze 计算现有获取的数据生成报告，但至少要获取15000个细胞，Analyze键才被激活9） 分析获取结束后，软件自动开始分析，分析的过程非常短暂，然后生成实验室报告。实验室报告包括每一位病人的下列资料：s FCS文件名以及在Sign In，Set Up，和Patients中输入的全部信息s 获取样本的日期和时间s 门内的细胞数，预先设定的FL1定标值，样本FL1的平均值和结论（HLA-B27阳性或HLA-B27阴性或是其它错误信息
22、）s FSC-SSC点图，FSC-FL2点图显示门的设定和FL1的直方图显示预设的靶值以及样本FL1的平均值注意：若样本FL1的平均值与定标值一样，同样判定为HLA-B27阳性s 可能出现的错误信息点击Next键继续下一个样本的获取，直到所有的样本都分析完后，软件生成一份总结报告，包括所有样本的下列资料：s FCS文件名以及在Sign In，Set Up，和Patients中输入的全部信息s 预先设定的FL1定标值，样本FL1的平均值和结论（HLA-B27阳性或HLA-B27阴性或是其它错误信息）s 可能出现的错误信息若还要检测更多的样本，点击More Tests，在出现的Patients窗口
23、填入病人的有关资料。10） 退出点击File菜单下的Quit键，退出程序，若您还没有保存Schedule document文件，软件在退出时会询问是否需要保存。u 质量控制为了得到可靠的结果，BD要求在检测之前一定要用FACSComp，CaliBRITE beads，HLA-B27 calibration beads成功调试仪器。BD建议您在每一次测试样本前，同批处理一个已知HLA-B27阳性和HLA-B27阴性的样本，作为测试系统的质控品。HLA-B27软件采用如下标准来评价结果的可靠性：1） 获取的细胞中至少有2%为T淋巴细胞以保证软件能够设门；2） CD3+和CD3-细胞群要能清楚分开，
24、软件能够识别。u 常见错误排除问题 可能原因 解决方法找不到合适的门 在所有获取的细胞中，淋巴细胞 占了不到2%，可能因为：1 仪器设置不对； 1.检查所有的仪器设置 是否与调试报告一致；2 红细胞裂解不完全； 2.确定所有的处理步骤是 否与说明书建议的一致；3 用错试剂； 3.检查所用试剂是否正确，并重新制备样本；4 仪器故障 4.重新调试仪器CD3+阳性群与CD3-阴性群细胞无法明确区分，可能原因：1. 样本制备时出错； 1.重新制备样本；2. 血样染色前或染色后放置时间太长2.取得新鲜血样重新染色；3. 试剂过期或使用不当； 3.检查试剂有无过期， 并确定试剂的保存及使用符合规定4.仪器
25、设置不对 4. 检查所有的仪器设置是否与调试报告一致；对照品结果出错 1.没有实施调试步骤； 1.重新调试仪器； 2.样本制备过程出错； 2.重新制备新鲜样本；3.调试微球及试剂批号的后缀输入 3.重新输入正确的后缀, 附录1。 组织相容性抗原和疾病的关系疾病HLA基因型相对危险因子Group 1：关节疾病强直性脊柱炎B27874Reiters综合征B27370沙门氏菌感染后的关节炎B27297志贺氏菌感染后的关节炎B27207耶尔森氏菌感染后的关节炎B27176前葡萄膜炎B27146淋病双球菌感染后的关节炎B27140淀粉样风湿性关节炎B2782类风湿性关节炎DR447Psoriatic 关
26、节炎B2747Group 2：内分泌疾病糖尿病型DR3, DR47.9Congenial adrenal hyperplasiaB4715.4Grave disease（甲状腺毒症）DR33.7Addisons疾病（肾上腺）DR36.3亚急性甲状腺炎B3513.7Group 3：腹腔疾病Gluten-sensitive enterpathy and celiac dseaseDR310.8Group 4：神经性疾病多发性硬化症DR24.1Optic neurutusDR22.4Group 5：皮肤疾病Psoriasis vulgarisCw613.3Dermatitis Herpetiform
27、isDR315.4Pemphigus(Jews)DR414.4Group 6：全身系统性疾病BehetB56.3自发性血色素沉积A38.2自发性血色素沉积B144.7重症肌无力DR32.5干燥综合征DR39.7Goodpasture综合征DR215.9红斑狼疮DR35.8Immunoglobulin A nephropathyDR44.0Hashimotos疾病DR53.2Pernicious anemiaDR55.4附录2。强直性脊柱炎-一个常见但易被忽略的疾病 强直性脊柱炎（Ankyloasing Spondylitis，AS）好发于二十至四十的成年人, 在高加索人群中的发病率为0.5-1
28、.0%, 男女比例为8:1, 在台湾人中的发病率为0.2%,男女比例为5:1. 症状及病理异常:典型症状为:慢性下背痛, 晨间脊柱僵硬及运动范围受限.于休息时更明显,尤以晨间为最(通常大约一小时),严重时病人在半夜因疼痛及僵硬感而醒. 运动过后则减轻. 诊断可经由详细的病史询问, 物理学检查, 及X光检查, 必要时抽血检查病人HLA-B27基因, 而诊断强直性脊柱炎. 治疗1. 病人教育: 强直性脊柱炎的病程通常是慢性的,且反反复复, 因此充分配合追踪及治疗是最基本的. 病人睡姿宜平躺或趴睡, 枕头宜低, 床板宜硬, 铺约5厘米后的软垫.2. 遗传咨询: 据统计,所有HLA-B27(+)的人,
29、 有2-10%终将发展成AS;若父亲为AS病人, 则孩子得AS的可能性约为10%.3. 运动及物理治疗: 运动对AS病人是非常重要的. 对减轻疼痛，保持脊柱活动范围及增进生活品质皆有帮助. 运动种类不限, 原则上只要能活动关节的运动皆可.维持正常的姿势也很重要,应避免长时间维持一个姿势不动. 多做伸展运动及伸展脊柱的运动,以预防脊柱的变形.4. 药物治疗:消炎止痛药: 目的是减轻疼痛,使病人能多做运动, 并增进生活质量. 剂量可由病人根据疼痛程度自行调整给药, 可于睡前投以加大剂量, 常用药为Indomethacin.免疫调节药: 常用Salfasalazine(Salazopyrine), 具调节免疫系统的功能.5. 手术:对脊柱严重变形的病人, 可手术改善关节功能. 病程与预后强直性脊柱炎的病程通常是慢性而反复的. 预后相当良好, 一般并不影响寿命, 90%的病人仍然可以拥有良好的生活质量.
