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1、第三章 FACSComp 3.1FACSComp简 介FACSComp是BD公司自动设置仪器的应用软件，它不仅可通过标准微球（CaliBRITE beads）来监测仪器的工作状态，还可以为人类外周血淋巴细胞免疫分群的应用提供常规的、自动化的仪器设置。流式细胞仪包含了一些灵敏的光电元件，为了保证实验结果的一致性，最好每天用CaliBRITE beads来运行FACSComp软件。新的FACSComp4.1版本在原版本的基础上又发展了HLA-B27的调试，并能支持自动进样系统。3.1.1FACSComp运行条件硬件l BD公司生产的FACSCalibur、FACSort或FACScan系列流式细胞
2、仪，若做四色，则必须具备配有FL4荧光探测器的FACSCalibur或FACSort；l FACSComp在Power Macintosh和Quadra 650上都能运行；l FACSComp可以支持自动进样系统，但要求LoaderManager3.2或更高的版本存在。软件l Power Macintosh AcqLibPPC 3.0.1或更高BDPACDriver1.0.2； BDPACInit 1.0.2或更高； BDPAC 1.0.2； l Quadra 650 BDMAC 3.0 l Macintosh系统软件7.5.3，7.6.1或8.1；l 对于HLA-B27的调试，需HLA-B2
3、7软件3.2或更高的版本；l 对于FACS Loader，需LoaderManager3.2或更高的版本；试剂l CaliBRITE BeadsCaliBRITE beads是已知光散射和荧光强度的标准塑料微球，大小在5-6 um 左右。BD公司生产的beads包括下列5种： 无荧光标记的beads FITC-标记的beads PE-标记的beads PerCP-标记的beads APC-标记的beads每一种beads都有一个相应的6位编码（lot ID），例如，12493N。其中最 后一位代码决定了下列值：1FSC和SSC的最小separation values（unlabeled bea
4、d的后缀）2FL1，FL2和FL3的最小separation values（FITC，PE，PerCP- bead的后缀）3FL4 PMT的靶值（APC-bead的后缀）4FL4的最小separation values（PerCP，APC-bead的后缀）l 鞘液用鞘液稀释CaliBRITE beads制成新鲜悬液。l HLA-B27试剂盒如你准备做HLA-B27的调试，需用HLA-B27试剂盒中的calibration beads制备悬液，其中beads lot ID的后缀决定了FL1的靶值而HLA-B27 reagent lot ID的后缀决定了样本分析时marker所在的位置。3.1.2
5、FACSComp的文件类型FACSComp软件可以生成下列类型的文件：l Summary Report File无论是对于Lyse/Wash Assay还是Lyse/No Wash Assay，都会生成两个Summary Report File：a text file文本文件和a pict file图象文件。本文件包括每一个参数的channel separation，灵敏度测试的结果，以及当前的FACSComp的仪器设置。Summary Report File的保存位置是：BD File：FACSComp File：DDMMYY folder。l HLA-B27 Summary Report
6、FileHLA-B27调试后同样生成两个Summary Report File：文本文件和图象文件，文本文件包括调节FL1和FSC之后仪器的设置。保存位置是：BD File：FACSComp File：DDMMYY folder。l Calibration FileFACSComp每一次运行结束都会生成一个新的calibration file，这个文件包括所有的仪器设置以及灵敏度测试的总的结果（TRUE代表所有的参数都通过，FALSE代表一个或几个参数不通过）。这个新生成的文件会自动覆盖原有的文件，因此每一次只会有一个Calib File和一个Calib File.LNW存在。保存位置是：BD
7、 File：Instrument Settings File。Lyse/Wash calibration file中仪器的设置可应用于SimuSET，Retic-COUNT；而Lyse/No Wash calibration file中仪器的设置可应用于MultiSET，TriTEST，ProCOUNT和FASTIMMUNE。l HLA-B27 Calibration File在进行HLA-B27调试之前，必须通过一次成功的Lyse/Wash Assay，而每一次调试结束后，都会生成一个新的HLA-B27 calibration file。保存位置是：BD File：Instrument Se
8、ttings File。l LeucoCOUNT Calibration FileFACSComp可以对Lyse/No Wash的设置加以修饰生成LeucoCOUNT calibration file，因此，若要保存LeucoCOUNT Calib File，必须通过一次成功的Lyse/No Wash Assay，并且在参量设定时选择LeucoCOUNT。保存位置是：BD File：Instrument Settings File。l Target FileTarget file是文本文件，包括了CaliBRITE beads的靶值，这些靶值可以通过选择FACSComp Menu下的Edit
9、Target Values进行编辑，但是除非有BD公司的正式通知，否则不要改动这些靶值。保存位置是：BD Application：FACSComp Folder。HLA-B27同样可以生成Target File，但是这个文件却是不能编辑的。l Target Value Log FileTarget Value Log File记录了每一次编辑Target Values的操作人、日期以及每一个值。文件可以按照时间的顺序记录100次，因此对于观察TargetValues的变化提供了一个极好的历史记录。该文件不能打开及查看，但可以在FACSComp中打印。保存位置是：BD Application：F
10、ACSComp Folder。l Levey-Jennings Summary Report Database FileLJ Data File包存了30次或60次FACSComp的Summary Report中所有的数据。你可以根据这些数据来监控一段时间内仪器的工作状态是否稳定。保存位置是：BD Application：FACSComp Folder。l Optimization FileOptimization File保存了优化后的仪器设置，FACSComp为保存优化的仪器设置提供了5个不同的文件，你可以从Optimization 视窗直接进入这些文件及相对应的图中。3.2FACSCom
11、p的功能l 光电倍增管（PMT）电压的调节光电倍增管可以有多种电压设置，而电压设置的不同将影响到它的探测灵敏度，增大电压也就意味着信号的放大和channel值的增高。FACSComp首先根据FSC的强度设一个上限和一个下限来减小双联体（两个bead粘在一起）和碎片的影响，然后根据unlabeled-beads所对应的Target Value来调节SSC、FL1、FL2和FL3 PMT的电压，使它们的平均值在Target Value2的范围内。由于FL4几乎探测不到Unlabeledbeads的自发荧光，因此FL4 PMT的电压必须通过APC beads所对应的靶值来调节。FSC探测器是一个光电
12、二极管，没有可连续变化的电压，因此也不存在FSC的target channel 。软件还设定了阈值，例如，对于Lyse/Wash Assay设定FSC的阈值为52；对于Lyse/No Wash Assay，设定FL3的阈值为300，然而，这些阈值在FACSComp运行过程中不会用到，并且是可以改变的。l 荧光补偿的调节应用于流式细胞仪上的大多数荧光染料的发射波谱都会发生叠加，光学滤镜可以最大限度地减小这些信号的叠加，但却不能消除。FACSComp可以用FITC-、PE-、PerCP-、APC-以及unlabeled-beads的混合物来调节荧光之间的补偿，而这补偿是通过调节电路来实现的。FL1
13、-%FL2 从FL1探测器中减去PE的信号FL2-%FL1 从FL2探测器中减去FITC的信号FL3-%FL2 从FL3探测器中减去PE的信号FL3-%FL4 从FL3探测器中减去由488nm激光器激发的APC的信号FL4-%FL3 从FL4探测器中减去由635nm激光器激发的PerCP的信号* 由于PerCP的信号不会被FL2收集，因此FL2-%FL3是不需要的。l 灵敏度的测试仪器设置的调节完成后，FACSComp将检测仪器的灵敏度。荧光灵敏度测试FACSComp获取10000个粒子，分别计算labeled-beads和unlabeled beads在FL1、FL2、FL3上的荧光强度平均
14、值之间的separation，而FL4的灵敏度，则是计算PerCP-和APC-beads在FL4上的荧光强度平均值之间的separation。侧向散射光灵敏度测试仪器在FSC参数上产生一个电子测试脉冲，FACSComp获取10000个粒子，计算背景噪音和SSC信号的平均值之间的separation。前向散射光灵敏度测试这时仪器的电子测试脉冲关闭，FACSComp通过降低FSC的域值来搜索FSC的噪音；一旦找到噪音水平，FACSComp就以此为阈值获取10000个粒子，并计算域值和FSC信号的平均值之间的separation。任何一个参数的灵敏度测试的结果只有两个：通过或不通过。而对于每一个特定
15、的参数，其信号与噪音之间，或荧光标记与未标记之间，或PerCP与APC之间的最小的separation value是已经由每个bead lot ID最后一位标记确定的，如果FACSComp计算出来的separation大于或等于这个最小separation，则这个参数的灵敏度测试也就通过了。l 时间延迟的校准（对于双激光，配有FL4 PMT）如果您的仪器是配有双激光并带有FL4 PMT， 当unlabeled baeds 管中APC-beads 被机器检测后FACSComp将自动进行时间延迟的调校，这保证了仪器能够同时处理由不同的激光器产生的信号。l HLA-B27的校准在进行HLA-B27抗
16、原检测之前，您必须使用HLA-B27调试微球来调节仪器，包括调节FL1和FSC。而HLA-B27调试能够进行的前提条件是您的软件中必须保存有一次成功的至少是两色的Lyse/Wash Calib File。l LeucoCOUNTLeucoCOUNT是一个计数leucoreduced血制品中残余白细胞个数的方法。4.1版本的FACSComp为您提供了一个在Lyse/No Wash Assay成功的基础之上，自动保存LeucoCOUNT calibration file的选择。l 优化由于塑料微球和细胞有着不同的光学性质，通过运行FACSComp所得到的仪器的设置对于生物样本不一定是最合适的，因此
17、，有必要用正常人的样本来调节仪器，使其最佳化。您可以在FACSComp中进行优化，或者在您每一次跑样本前，用CellQuest来做优化。3.3FACSComp的运行3.3.1 CaliBRITE Beads的准备l 充分混合装有CaliBRITE Beads的小瓶；l 将瓶口垂直向下挤一滴unlabeled-beads到装有1ml鞘液的试管中，混匀，在试管壁上标上unlabeled； * 注意：若是配有双激光做四色，则须在unlabeled管中再加一滴APC-beadsl 在另一个装有3ml鞘液的试管中依次加入unlabeled-、FITC-、PE-、PerCP-、和APC-beads（若做四
18、色）各一滴，混匀，在管壁上标上mixed； * 注意：PerCP不很稳定，最好在上机前加入l 避光放置，准备上机。3.3.2软件环境的设置l 确定计算机和主机之间已连接好，先开主机，再开计算机；l 从Apple Menu下进入FACSComp；首先出现的是Sign In视窗l 在SignIn视窗中填入下列信息：操作者、机构、实验室主任，但只有操作者是必须填入的，计算机将保存这些信息；l 单击Accept，进入Set Up视窗；l 在Assay Selection下选择你需要的Assay：Lyse/Wash、Lyse/No Wash或HLA-B27 Calib； FACSComp可提供三种不同并
19、可连续进行的Assay： 1.Lyse/Wash 用于溶血素洗涤的样本（两色、三色或四色）； 2.Lyse/No-Wash 用于溶血处理后免洗的样本（三色或四色）； 3.HLA-B27 用于做HLA-B27抗原检测的样本，它必须在Lyse/Wash 检测成功的基础之上并用HLA-B27调试微球才可进行l 在CaliBRITE Beads Lot Ids中根据每一种beads所对应的编码输入Lot ID； * 若你选择了HLA-B27 Calib，请输入HLA-B27 CaliBRITE Beads Lot ID Reagent Lot ID；l 在Automatic Saving Option
20、s中，你可以选择自动保存或不保存Summary Report，若自动保存，软件会根据它的命名原则给予这份Report一个文件名，并保存在特定的位置，你可以通过单击Location来更改文件名以及保存的位置；l 若你已知你通常所用的阈值（和Gain），你可以在Lyse/Wash Settings或Lyse/No Wash Settings中输入，但是这些值对FACSComp的运行没有任何意义。它将被保存在Calib File或Calib File.LNW中，当您下载Calib File Settings时一起被下载；l 设定参量；FACSComp允许您在优化、输出数据、打印报告、自动进样、保存L
21、eucoCOUNT calibration file、选择LJ数据输出等参量都上进行设定。从FACSComp菜单中选择Preferences，出现一个标题为Preferences的对话框，在对话框的最左边单击任何一个参量的图标，根据您的需要进行设定： Optimization 允许您改变文件名和点图的X、Y轴的参数 Export 允许您选择输出数据的形式 Print 允许您选择是否在每一次Assay结束后打印Summary Report LJ Data 允许您选择保存30或60次的Summary Report的结果到输出文件中，或者不保存 Loader允许您选择是否用自动进样系统 LeucoC
22、OUNT 软件会在成功的Lyse/No Wash Assay的基础上，自动保存LeucoCOUNT calibration file设定完成后，单击Save键保存所有的设定l 在Set Up视窗的右下角单击Run，出现PMT视窗，这时你已准备好测试了3.3.3Beads的检测l 将功能键放在RUN的位置，流速设成HI，将混匀的标有unlabeled的试管放在支撑架上；l 单击Start，开始调节PMT；FACSComp先获取5000个beads，在单个beads群的位置设一个gate，然后开始自动调节PMT的电压。对于双激光配有FL4 PMT的仪器，软件会检查unlabeled试管中是否含有A
23、PC-beads，如没有，第二根激光器将被关闭，软件只会调节FL1、FL2或FL3的PMT；如有APC-beads，且在Set Up时APC-beads Lot ID也已经输入，则软件将会调节FL4的PMT。FACSComp根据Target Value调节PMT到预期值，然后在窗口的底部出现一行信息“PMTs Set Successfully”。这时软件会暂停5秒，然后自动进到下一个调节-补偿或是时间延迟的调校（如有APC-beads）。如遇到下列两个情况中的任何一个，FACSComp将进入到手动调节的模式：1流速小于400粒子/每秒2PMT自动调节的时间长于75秒单击Manual键，出现Ta
24、rget Value窗口，根据TargetValue调节Detectors/Amps，使得SSC的PMT在Target Value5的范围内，而荧光的PMT在Target Value2的范围内。l 如软件在unlabeled试管中测到APC-beads，则在PMT调节完后，马上进行时间延迟的调校；如果调试成功，会出现“Time Delay Calibration was successful”，然后直接进入补偿视窗；如果调试不成功，你有5秒钟的时间决定是再试一次，还是重复开始的PMT调节，或是继续到下一步调节补偿；若你在5秒内还没有决定，软件自动进到补偿的视窗。如果你在时间调校失败的基础上继续
25、补偿的调节，那么你所得到的FL3-%FL4和FL4-%FL3的值会有较大的变化。l 将unlabeled试管从支撑架上取下，换上混匀的标有mixed试管；l 单击Start开始调节补偿；FACSComp自动调节补偿，直到获得target mean difference（或target mean for FL4）。 注意事项： 标有不同荧光的beads群在垂直或水平方向上的线形度可能不是很好，比如说，FL3-%FL2显得有些不够补偿，软件之所以这样设置是因为这种补偿条件更适合于细胞； 在补偿的值设定后，荧光道数的平均差可能出现轻微变动，这是一种正常现象； FL3-%FL4和FL4-%FL3的值在
26、两次FACSComp中有可能出现相当大的变化，这是因为每一次时间延迟的设置有可能不一样，尽管如此，每一次FACSComp所提供的补偿的值都是合适的。如遇到下列两个情况中的任何一个，FACSComp将进入到手动调节的模式：1.流速小于400粒子/每秒；2.补偿自动调节的时间长于75秒3.补偿的值超过50%单击Manual键，出现Target Value窗口，根据target mean difference 调节Compensation，使得mean difference在Target Value2的范围内。l 补偿调试成功后，FACSComp自动前进到灵敏度调试，单击Start键，开始调试灵敏度
27、；灵敏度的调试包括三个部分：荧光、侧向角散射光、前向角散射光l 调试完成后，软件计算结果，并将所有的结果都Calib File或Calib File.LNW中，同时给出一份Summary Report；l 从支撑架上移走装有beads的试管，换上蒸馏水，并将功能键换成STAND BY；l 单击 Next Assay 进行下一个Assay，如这是最后一个Assay，这个键会 换成Set Up，单击此键可直接进入Set Up； Optimization进入优化窗口；Quit键，退出FACSComp。若你在设定打印参量时选择的是Print After Each Assay，软件开始自动打印Summa
28、ry Report，或者，你也可以在File menu下选择Print来打印Summary Report。Stop Run 终止程序3.3.4Optimization在您准备获取样本之前，请务必选用合适的样本来调节一下您的仪器，使得仪器的设置对于您的样本来说是处于一个最佳的状态，这就是所谓的优化（Optimization）。您可以用CellQuest来实现您的优化，也可以在FACSComp中进行。FACSComp为您提供了5个文件来保存优化后仪器的设置，每一个文件都有其相应的文件名及优化窗口，分别是：Optimization 1：Save File Name = MultiTEST.optOp
29、timization 2：Save File Name = TriTEST.optOptimization 3：Save File Name = SimulTEST.optOptimization 4：Save File Name = ProCOUNT.optOptimization 5：Save File Name = FastImmune.opt您可根据需要选择文件名及优化窗口，选用合适的样本，对仪器作出适当的调节，例如，您可在Optimization 1窗口中选用CD3/CD8/CD45/CD4标记的细胞来调节FL3的阈值和SSC gain；您可在Optimization2窗口中选用CD
30、4/CD8/CD3标记的细胞来调节FL3的阈值和SSC gain；您可在Optimization 3窗口中选用CD3/CD19标记的细胞来调节FSC和SSC gain、FSC的阈值、FL1和FL2之间的补偿；您可在Optimization 4窗口中选用nucleic acid dye/CD34/CD45标记的细胞来调节FSC和SSC gain、FL1的阈值。总之，您必须在确保PMT的电压、阈值以及补偿都是最合适的情况之下才能进行获取。3.4Troubleshooting 症 状 原 因 解 决 办 法不能自动调节PMT流速小于400粒子/秒将流速设到HI；加多一滴beads到试管中；混匀bea
31、dsCaliBRITE beads太旧重新准备beads悬液；启用新的beads流动室中有气泡按PRIME排除气泡压力不稳定检查鞘液罐有无加压；检查鞘液罐有无裂缝；检查液流系统有无渗漏FL4 PMT电压变化超过100在unlabeled试管中错加了PerCP而不是APC重新准备unlabeled-beads和APC-beads悬液，重新运行软件APC-beads Lot ID输错了输入正确的APC-beads Lot ID检测不到APC beads没有APC beads滴加APC beads滴加beads时没有混匀在滴加beads之前先混匀红色激光器没有工作确定在 BDMAC 或BDPAC c
32、ontrol panel中选择了FL4软件没有在单个beads上设门鞘液用错了请选用BD的鞘液或自制的PBS鞘液中有颗粒更换鞘液的滤器；鞘液在使用之前请先过滤细菌污染了进行月维护；更换鞘液的滤器；准备新鲜的beads时间延迟调校失败APC beads的流速太低了确定流速设定在HI；增加一滴APC beads信号超出范围： 鞘液容器的盖子没有拧紧； APC Lot ID输错了； FL4 PMT的设置不对； FSC的信号小于150 channel； 液流中有气泡 将盖子拧紧； 输入正确的APC Lot ID； 手动调节FL4 PMT； 与BDIS联系； 按PRIME排除气泡时间延迟调节完后，FL4
33、 PMT平均道数的变化大于5重复PMT的调节不能自动调节补偿，或补偿大于50%流速小于400粒子/秒将流速设到HI；加多一滴beads到试管中；混匀beads使用了错误的混合beads使用正确的混合beads细菌污染进行月维护；更换鞘液的滤器；准备新鲜的beads流动室中有气泡按PRIME排除气泡压力不稳定检查鞘液罐有无加压；检查鞘液罐有无裂缝；检查液流系统有无渗漏FL3-%FL4和（或）FL4-%FL3的补偿大于50%鞘液的流速改变了（鞘液桶的盖子松动或渗漏）拧紧盖子，检查有无渗漏，重新进行PMT和时间延迟的调节混合beads放置时间太长重新配置新的混合beads，在运行一次FACSComp不能成功进行灵敏度的测试Separation失败输入正确的beads Lot IDCaliBRITE beads太旧重新准备beads悬液；启用新的beads细菌污染进行月维护；更换鞘液的滤器；准备新鲜的beads使用了错误的混合beads使用正确的混合beads错误的测试脉冲（仅对于FACScan）用正确的测试脉冲重试流动室中有气泡按PRIME排除气泡压力不稳定检查鞘液罐有无加压；检查鞘液罐有无裂缝；检查液流系统有无渗漏
