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1、第五章 DNA的生物合成,第一节 原核生物的DNA复制第二节 真核生物的DNA复制第三节 DNA的损伤修复第四节 DNA的重组,DNA具有储存、传递（包括复制、转录、翻译）和接受（反转录）遗传信息的功能。DNA的生物合成包括DNA的复制、损伤修复和重组。DNA复制是保持DNA分子的忠实拷贝过程，具有高度的忠实性，DNA修复和重组是影响遗传信息本身结构的调整过程，保持遗传信息的完整性。,第一节 原核生物的DNA复制,复制（replication）是以亲代的DNA为模板合成出相同DNA分子的过程，也是遗传信息从亲代向子代的传递过程，因此与细胞的增殖有关。染色体外的遗传因子，包括细菌的质粒、真核生物
2、的细胞器及细胞内共生生物的DNA。它们的复制方式或受染色体复制的控制，与染色体复制同步；或不受染色体复制的控制，在细胞周期中随时都可以进行。如果病毒DNA整合到宿主染色体中，则该DNA作为宿主染色体的一部分而被复制。,一.DNA的半保留复制,（一）概念DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。这种复制方式称为半保留复制。,半保留复制,亲代,第一代,第二代,（二）半保留复制的实验证据 1958年Mesels
3、on和Stahl用同位素15N标记大肠杆菌DNA，首先证明了DNA的半保留复制。,新链,旧链,（三）DNA的半保留复制的生物学意义：,按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性.遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。,子链继承母链遗传信息的几种可能方式,全保留式 半保留式 混合式,（四）复制的起点和方向,1.概念 复制子(replicon)：基因组能独立进行复制的单位。习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子.起点(origin)：也称原点，控制复制起始，是含有100200个碱基对的一段DNA。细胞内存在着能识
4、别起点的特殊蛋白质(大肠杆菌中称为Dna A蛋白)。,终点(terminus)：终止复制的序列位点.复制叉(replication fork)：复制开始后由于DNA双链解开，在两股单链上进行复制，形成在显微镜下可看到的叉状结构。,A.环状双链DNA及复制起始点B.复制中的两个复制叉C.复制接近终止点(termination,ter),原核生物：只有一个复制子真核生物：多个复制子，多个起点，形成多个“复制眼”或“复制泡”,2.起始点和方向 1）原核生物和真核生物复制都是在DNA分子特定的位置起始的，如大肠杆菌起始点有固定的保守顺序GATC和TTATCCACA，多次出现，可被酶识别。,2）方向：大
5、多是双向、对称复制,也有单向或不对称的。3）速度：原核复制叉移动快(约1000个核苷酸/s);真核生物复制叉移动慢(约50个核苷酸/s)。典型动物细胞所含DNA是细菌中的50倍左右，但两者DNA的复制时间差异不很大（大肠杆菌40min，真核通常几小时），因为真核生物为多复制子。,复制起始点、复制子与复制叉（动画演示）,二.DNA聚合酶(DNA polymerase,DNA-pol),(一)DNA聚合酶的反应特点DNA聚合酶是一种催化依赖模板的以脱氧核苷三磷酸为前体合成DNA的酶。1956 年 Arthur kornberg 等首先从大肠杆菌中发现DNA聚合酶，其后在不同的生物中都找到有这种酶。
6、,DNA聚合酶的反应特点：4种dNTP底物：(dATP dGTP dCTP dTTP)；接受模板指导:解开成单链的DNA母链；需引物提供3-OH；新链生长方向：53；产物DNA性质与模板相同。,此外,DNA复制过程中还需其它酶和蛋白质因子.,*引物(primer)是一和模板链互补的线性片段,其上带有能与核苷酸相结合的游离3-OH.引物通常是寡聚RNA.,（二）大肠杆菌DNA聚合酶 有五种，即DNA聚合酶、和。1.大肠杆菌DNA聚合酶 pol 也称Kornberg酶,是各种DNA聚合酶中研究的最透彻的，它的一些特点代表了DNA聚合酶的基本特点：1）pol 的性质 分子量：103 000，单链，球
7、形，活性部位含 Zn2,每个细胞有400个酶分子。,323个氨基酸,小片段,5 核酸外切酶活性,大片段/Klenow 片段,604个氨基酸,DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性,N 端,C 端,DNA-pol,Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。,2）功能：53聚合酶活性（大片段上）；酶与模板结合后构象改变，识别碱基，正确配对后才发挥聚合作用；（错误率10-5）3 5外切酶活性（大片段上）；仅对短的单链DNA起作用，主要是对新生DNA链进行校对，防止“错配”；（错误率5*10-2）53外切酶活性（小片段上）。仅作用于双链DNA，可切除由紫外线照射形成的嘧啶二聚
8、体，也可切除冈崎片段5端RNA引物。,2）功能：53聚合酶的选择作用和3 5外切酶的校对作用使DNA复制过程受到双重核对，大大减少了错误率。可见，DNA pol是1个多功能酶。但它不是DNA合成的主要酶，持续合成能力（指DNA聚合酶解离前所能加上的核苷酸的平均数目）较低。故其功能主要是：对复制中的错误进行校读，对DNA损伤进行修复，以及在DNA复制时RNA引物的切除及其空隙的填补。,2.大肠杆菌DNA聚合酶 pol 1）多亚基，聚合酶亚基(单链)分子量为88 000,每个细胞有100个酶分子 2）功能：53聚合酶活性；35外切酶活性。（该酶无53外切酶活性;且活性低，表明该酶仍不是主要的复制酶
9、，可能是一种修复酶。一般在无DNA聚合酶和酶时，该酶才起作用，具体功能仍不清楚）目前认为该酶主要参与DNA损伤的修复。,3.大肠杆菌DNA聚合酶 pol 真正的DNA复制酶，1971年发现 1）pol 是真正起复制作用的酶，由10种亚基组成不对称二聚体,含Zn2+，、组成核心酶 2）功能：53聚合酶活性（亚基）；35外切酶活性（亚基）。该酶在原核细胞中主要负责DNA链的延伸，是复制延长中真正起催化作用的酶。(该酶无53外切酶活性),E.coli DNA 聚合酶不对称二聚体,可滑动的 夹持器亚基,催化亚基,35外切酶亚基,前导链 合成,后随链 合成,夹持器装置,催化亚基,亚基保持核心酶 的二聚体
10、结构,酶的各个亚基的作用见表5-1.,亚基具有53方向合成DNA的催化活性亚基具有35外切酶活性，起校对功能，可提高聚合酶复制DNA的保真性 亚基可能起组建的作用亚基犹如夹子，功能是识别引物、夹住DNA 分子向前滑动 亚基起着促使核心酶二聚化的作用其余的亚基构成-复合物，主要功能是帮助 亚基夹住DNA（也称夹子装置器），并有 增强核心酶活性的作用,DNA 聚合酶 pol pol pol 亚基数目 1 4 105 3 聚合酶活性+3 5 外切酶活性+5 3 外切酶活性+-聚合速度(核苷酸/分)1 0001 200 2 400 15 000-60 000 持续合成能力 3200 1 500 500
11、 000分子数/细胞 400 100 1020功能 切除引物,修复 修复 复制,表 大肠杆菌3种DNA聚合酶性质比较,4）大肠杆菌DNA聚合酶 和1999年发现DNA聚合酶 和，参与DNA的错误倾向修复。当DNA受到严重损伤时，正常的DNA聚合酶在该处不能形成正确的碱基配对而停止修复，此时诱导产生这两种酶，能在损伤部位继续复制，但修复的准确性较差，会造成较高的突变率，这虽然会杀死许多细胞，但至少可以克服复制障碍，使少数突变的细胞得以存活，从而延续种系。,（三）与DNA的复制过程有关的其他酶和蛋白质因子（以大肠杆菌为例）,除DNA聚合酶外，还需要20多种不同的酶和蛋白质因子的参与，整个复合物统称
12、为DNA复制酶系统(DNA replicase system)或者复制体(replisome)。解旋酶（helicase）：DNA复制时，解旋酶沿着DNA母链滑动使之解旋，同时打开双链之间的氢键，这一过程所消耗的化学能通过ATP水解提供。,（三）与DNA的复制过程有关的其他酶和蛋白质因子（以大肠杆菌为例）,拓扑异构酶（topoisomerase）：用于消除螺旋状DNA解旋时产生的拓扑应力。拓扑异构酶I主要集中在活性转录区，与转录有关；拓扑异构酶II分布在染色质骨架蛋白和核基质部位，同复制有关。单链DNA结合蛋白（single strand DNA binding protein,SSB）引物酶
13、（primase）：促使引物合成。DNA连接酶（DNA ligase）,可分为三个阶段：合成的起始，延伸，终止。（一）起始（以大肠杆菌为例，图5-9）至少有9种酶或蛋白质参与复制的起始。起始位点是245bp构成的高度保守序列，有两个关键序列，一个由13bp组成的3次重复片段和一个由9bp组成的4次重复片段。合成起始阶段的关键部分是DnaA蛋白（只与负超螺旋的DNA相结合）。原核生物的SSB与DNA的结合有明显的协同效应。,三、双链DNA复制的分子机制,图5-9.大肠杆菌起始点oriC的复制引发模型A.约20个各带1个ATP 的DnaA蛋白 结合于 9bp序列，使DNA围 绕着复合物卷成一圈B.
14、三个富含A=T的 13bp重复序列被变性C.在DnaC蛋白 的帮助 下DnaB蛋白进一步 使DNA解螺旋，以 备引物和DNA的合成,3组13个碱基对重复,DnaA,+ATP,4组9个碱基对重复,oriC,HU+,ATP,DnaB,DnaC,+ATP,DnaB解旋酶,引发与复制,A,C,B,表5-3大肠杆菌复制起始点引发DNA复制所需的蛋白质,（二）延伸,DNA的两条链都能作为模板。由于DNA分子的一条链的走向为35，另一条链为53；而所有已知DNA聚合酶的合成方向都是53。为了解决这个矛盾，1968年，日本学者Okazaki等提出了DNA的不连续复制模型，认为：沿35模板链合成的子链是连续合成
15、，而沿53方向合成的子链是分段合成，由许多DNA片段连接起来的。,1、冈崎片段和半不连续复制,以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链是35走向，在其上DNA能以53 方向连续合成，称为前导链（leading strand）；另一条模板链是53走向，在其上DNA也是从53 方向合成，但是与复制叉移动的方向正好相反，所以随着复制叉的移动，形成许多不连续的片段，最后连成一条完整的DNA链，该链成为滞后链或后随链（lagging strand）。,冈崎片段(Okazaki fragment)：在不连续的后随链DNA合成中形成的DNA短片段，在原核生物为10002000核苷酸，真核生物约100200核
16、苷酸。1968年冈崎发现。,DNA的半不连续复制:DNA双链复制时，一条链是连续合成的(前导链,leading strand)，另一条链是不连续合成的(滞后链或后随链,lagging strand)，这种前导链的连续复制和后随链的不连续复制方式称DNA的半不连续复制。,领头链(leading strand),后随链(lagging strand),DNA的半不连续复制,DNA的双向复制,5,5,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,3,2、DNA半不连续复制中的RNA引物（1）前导链和滞后链的合成都需要RNA引物。（2）引物合成酶(Dna G)：是以DNA为模板的RNA聚合酶（合成方
17、向53），与DNA聚合酶不同的是，它不需要引物，只需要DNA模板，就可以在其上合成新的RNA链。(3)引物RNA的起始和终止的位置受解链酶、引发酶、模板顺序及其二级结构的影响。（4）DNA聚合酶切除前导链及冈崎片段的引物后,填补空缺，由DNA连接酶将切口连接。,RNA引物的合成称作“引发”。后随链的合成需多次引发作用，而发动前导链的合成只需一次引发。前导链的引物一般比冈崎片段的引物略长一些，前者大约为1060核苷酸，后者通常为510核苷酸。成熟的DNA是不含RNA的，RNA引物最终被DNA所置换。,3、DNA连接酶（ligase）,催化两段DNA之间的连接:,3,5,5,3,5,3,5,3,H
18、O,P,DNA ligase,NAD,ATP,NMN,AMP+PPi,+,DNA连接酶（1967年发现）：若双链DNA中一条链有切口,一端是3-OH，另一端是5-磷酸基，连接酶可催化这两端形成磷酸二酯键，而使切口连接。但它不能将两条游离的DNA单链连接起来。磷酸基必需通过腺苷化激活。大肠杆菌和其它细菌的DNA连接酶需要NAD+提供能量;在高等生物和噬菌体中，则要ATP提供能量。,4.母本DNA双链的分离(1)DNA解链酶(解螺旋酶,Dna B)：通过水解ATP将复制叉前方的DNA双链打开。每解开一对碱基需要水解2个ATP分子。(2)单链结合蛋白(SSB)：稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保
19、护单链不被核酸酶降解。(3)DNA旋转酶或拓扑异构酶:兼有内切酶和连接酶活性,可迅速使DNA两条链断开又接上,消除解链酶产生的拓扑张力。当引入负超螺旋时需要由ATP提供能量,同复制有关。,（三）终止,复制的最后，大肠杆菌染色体的两个复制叉在终止区域相遇，这个区域含有20个碱基对序列，叫做Ter序列（Terminus，终止的意思）。该序列排列在染色体上造成一种陷阱，即复制叉到此就停止不再向前进行。Ter序列的功能是结合一种叫做Tus的蛋白质(terminus utilization substance,即终止利用物质).Tus-Ter复合体能够阻止单方向前进的复制叉，该复合体只能对一个复制叉起作
20、用。,（三）终止,当一个复制叉遇到Tus-Ter复合体时，复制停止；另一复制叉在遇到已停止的复制叉时复制也随之停止。最后的数百个位于这些大的蛋白质复合体之间的碱基对尚没被复制。其后两条亲代母链解开，通过修复方式填补空缺，形成了两个交联在一起的环状染色体。这种拓扑互联环称为连环体（catenane）,大肠杆菌的交联DNA环的分离需要拓扑异构酶IV（一种II型拓扑异构酶），分离开的染色体在细胞分裂时分别进入子细胞。包括真核生物的DNA病毒在内的其他环状染色体复制的终止机制都与此类似。,细菌复制终止区含有多个约20bp的终止子(terminator)位点，E.coli 有7个终止子位点。,总结:原核
21、生物DNA的复制过程:(以大肠杆菌为例)起始-RNA引物的合成 DNA链的延伸 终止,B.RNA引物的合成 引发体先与DNA起始部位双链结合，通过引物合成酶形成前导链引物后，再沿53模板链与复制叉同向移动，在移动中断断续续形成冈崎片段的 RNA 引物。,A.双链的解开 DNA旋转酶(拓扑异构酶)、DNA解链酶、单链结合蛋白协同作用,C.DNA链的延伸 在DNA pol 的催化下，以四种dNTP为底物，在RNA引物的3 端以磷酸二酯键连接上脱氧核苷酸并释放出焦磷酸。DNA链的延伸同时进行领头链和后随链的合成。,dATP,dGTP,dTTP,dCTP,dTTP,dGTP,dATP,dCTP,OH
22、3,3,前导链的延长：DNA pol 全酶二聚体的一个亚基与前导链的模板结合而发挥催化作用，与复制叉同向。,滞后链的延长滞后链上合成的冈崎片段是多种酶共同作用的结果。DnaB解旋酶和DnaG引物酶组成了一个复制的功能单元，称为引发体(primosome)。DNA聚合酶以其一套核心部分（核心聚合酶）连续合成前导链，同时，另一套核心聚合酶在滞后链环上从一个冈崎片段滑动到另一个冈崎片段。,当冈崎片段合成到一定长度，其3-OH遇到上一个冈崎片段时即停止合成，DNA聚合酶III的核心部分与滑动夹(及完成的冈崎片段）分离，然后再俘获新的滑动夹，新的冈崎片段的合成开始。一旦冈崎片段合成完成，通过DNA聚合酶
23、I去除其RNA引物，以前一个冈崎片段的3-羟基为引物，催化合成DNA取而代之，并形成一个切口，这个切口由DNA连接酶连接封闭。,合成过程中复制复合物本身并没有不断移动，而是靠与质膜结合的DNA移动通过固定的复合物来实现。这个合成的过程是相当快速的，新DNA的每条链(前导链和滞后链)大约每秒添加1000个核苷酸。,DNA聚合酶催化领头链和随从链同时合成,D.复制终止 细菌环状染色体的两个复制叉向前推移，在终止区相遇而停止复制，复制体解体。这样,以两条亲代DNA链为模板，各自形成一条新的DNA互补链，结果形成了两个DNA双股螺旋分子。,复制的保真性(fidelity)主要依赖 3 种机制：,聚合酶
24、对碱基的选择；3 5方向的外切核酸酶活性起校正作用;复制后错配现象的特异性修复机制。,5.DNA聚合酶的“校对”(proofreading)作用,大肠杆菌DNA复制错配率约10-910-10。其染色体中有4.5106bp，平均每1 00010 000个细胞经过一次分裂才会插入一个不正确的碱基。,小结维持DNA复制准确性的因素：内因:按碱基配对原则 DNA聚合酶的作用 对碱基的识别作用-选择正确的碱基掺入到引物末端；对底物的识别作用-先识别引物最后一个碱基是否正确,后识别掺入的dNTP是否正确；校正阅读-3 5外切酶的作用；RNA引物最终被切除,提高了复制准确性；复制完成后对错配碱基进行修复的酶
25、系统。外因：四种dNTP要平衡；Mn2+和Mg2+的比例、浓度（酶活）,DNA复制的分子机制的基本特点,复制的结果是半保留复制，复制的过程是半不连续复制。复制以复制单位进行，起始于特定的位点（复制起点）。复制可以是单向，也可以是双向，后者更为常见。复制时，DNA的两条链都从5端向3端延伸。前导链是连续合成，而后续链是不连续合成。DNA的合成始于RNA引物的合成，因此前导链只有一次RNA合成，滞后链的冈崎片断每个都有RNA引物的合成。RNA引物随后由DNA片段替换，相邻的DNA片段连接形成一条完整的DNA链。DNA聚合酶的校对功能和细胞的错误修复功能维持DNA分子的准确性和忠实性。,第二节 真核
26、生物的DNA复制,真核生物中的DNA分子通常比大肠杆菌等原核生物大；真核生物的DNA通常都与组蛋白构成核小体，以染色质的形式存在于细胞核中；真核生物DNA复制的冈崎片段长约200bp左右，相当于一个核小体DNA的碱基对长度。,一、真核生物的DNA聚合酶,DNA-pol 现认为其功能只是合成引物DNA-pol 在复制延长中起催化作用DNA-pol 校对、修复、填补(类似E.coli DNA pol I)DNA-pol 线粒体DNA合成DNA-pol 核DNA修复与原核生物的DNA聚合酶相似：均以4种脱氧核苷三磷酸为底物，需Mg2+激活，有模板和含有游离3-OH引物存在，新链向53方向延伸。,48
27、,4,细胞核染色体的复制由DNA聚合酶、和共同完成。聚合酶 合成引物，聚合酶是主要的复制酶，聚合酶可能相当于细菌DNA聚合酶，是修复酶，也有报道它参与前导链的合成。DNA聚合酶与另一种称为增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）的复制因子相结合，构成真核生物的复制复合体，该因子由四个相对分子量为29 000的亚基组成一个环状的同源四聚体。PCNA相当于大肠杆菌DNA聚合酶的亚基，它形成的环状夹子稳定DNA聚合酶和DNA的相互作用，极大增加聚合酶的持续合成能力。现也有报道一些新发现的DNA聚合酶如DNA聚合酶、和Rev1,他们主要参与DNA
28、的损伤修复，因此保真性较低。,在真核生物的DNA复制中，复制蛋白-A（replication protein A,RPA）是真核生物的单链DNA结合蛋白，相当于大肠杆菌的SSB蛋白。复制因子-C（replication factor C,RFC）由一个大亚基（145kD）和四个小亚基（40，38，37和36kD）组成，具有DNA依赖的ATP酶活性，是夹子装置器（clamp loader），相当于大肠杆菌的复合体，帮助PCNA因子在DNA双链的装卸。此外，它还促进复制体的装配。,二、染色质复制,也可以分为起始、延伸和终止三个阶段。也是DNA聚合酶和多种蛋白的协调作用的结果。在复制叉上有一个DNA
29、聚合酶，以合成引物；DNA聚合酶和DNA聚合酶，分别合成前导链和滞后链。,1.起始复合体(origin recognition complex,ORC),ORC以一种依赖ATP的方式结合到起始位点，并作为其它起始因子的装配骨架。ORC所结合的DNA序列变化非常大。ORC的定位与起始的选择涉及到许多精细调控途径，也受ORC-染色质上游和下游许多调节因子的作用，但是目前仍不清楚ORC是如何发现这些序列。,1.起始复合体(origin recognition complex,ORC),真核生物合成DNA时，首先构建前起始复合体。在G1期ORC先结合到DNA上，然后核复合体相关蛋白（nucleolar
30、 complex-associated proteins NOC）、CDC6（cell division cycle，细胞分裂周期蛋白）和CDT1（CDC10 dependent transcript,CDC10依赖性转录因子），以及MCM27(minichromosome maintenance protein,微小染色体维持蛋白)复合体等依次结合上来，在结合MCM后，CDC6和CDT1从复制前起始复合体脱落，形成一个有效复制前起始复合体。,1.起始复合体(origin recognition complex,ORC),在G1/S转换时，CDC45、TOPBP1(topoisomerase
31、II binding protein1,拓扑异构酶II结合蛋白1）和MCM810协助GINS(go ichi ni san，pol辅助因子）复合物的加载，DNA解螺旋，DNA聚合酶的结合，使复制前起始复合体转变成复制起始复合体。,图5-15.真核细胞核DNA复制的模型（A）起始前复合物的组成。（B）起始复合物的组成。（C）DNA复制叉的组成。,2.复制,复制起始复合体形成后，MCM27，CDC45和GINS 使双螺旋DNA解旋。GINS促进pol的聚合作用，前导链合成主要由pol来完成。在滞后链上，RPA稳定ssDNA，pol先合成一个10个核苷酸的RNA引物，继之在引物的3端合成2030个脱
32、氧核苷酸的DNA片段，然后被pol替代，由其完成冈崎片段的合成。RFC 协助PCNA（增殖细胞核抗原）加载到pol上，增加pol的持续合成能力，而MCM810在此过程中准确地作用尚不清（图5-15，C）。,2.复制,在滞后链的合成中，相邻冈崎片段的连接是在核酸酶、FEN1（flap endonuclease1,侧翼核酸内切酶）、DNA聚合酶等共同作用下完成。RNA引物被RNase H1、成熟因子-1(maturation factor，MF）等核酸酶水解，然后由DNA聚合酶填补缺口，DNA连接酶连接切口，图5-16提供了目前大家比较公认的三个滞后链连接模型。,在DNA合成时究竟是酶在移动还是D
33、NA在移动？最近研究表明DNA聚合酶在合成DNA时为固定状态，原核生物的DNA聚合酶固定在细胞膜上，真核生物固定在核基质上。所有参与DNA复制的酶和蛋白质，也包括固定DNA聚合酶的蛋白质都固定在同一位置，从而构成复制体。DNA复制过程中复制子与复制体结合，形成复制簇。新合成的DNA从复制体向外滑出，同时亲代DNA通过固定点向内移动。在此过程中亲本链形成的环逐渐收缩，复制链形成的环不断增大。这样DNA进入复制体被复制，进去的是母链，出来的是子链（图5-18）。,图5-18.复制子簇内DNA复制模型,复制链,复制起点,亲本链,复制体,真核生物中DNA的复制特点,1、真核生物染色体有多个复制起点，多
34、复制眼，呈双向复制，多复制子。2、冈崎片段长约200bp。3、真核生物DNA复制速度比原核慢。4、真核生物染色体在全部复制完之前起点不再重新开始复制；而在快速生长的原核中，起点可以连续发动复制。真核生物快速生长时，往往采用更多的复制起点。,真核生物中DNA的复制特点,5、真核生物有多种DNA聚合酶。6、真核生物线性染色体两端有端粒结构，防止染色体间的末端连接。由端粒酶负责新合成链5端RNA引物切除后的填补，亦保持端粒的一定长度。7、真核生物的染色体以核小体为结构单位，在其复制时，组成核小体的组蛋白是全保留式的复制。8、真核生物DNA的复制要复杂的多，目前仍有许多未解之谜。,端粒(telomer
35、e)是真核生物线性染色体的两个末端所具有的特殊结构,其共同特点是一条链上富含 T、G 短序列的多次重复,而其互补链上富含A、C。,三、端粒的复制,端粒主要有两大生理功能：,（1）维持染色体结构的完整性，防止染色体被核酸酶降解及染色体间相互融和。（2）防止染色体结构基因在复制时丢失，解决了末端复制的难题。DNA复制时，DNA聚合酶必须在RNA引物基础上从5向3方向延伸，而5端RNA引物去除后因无引物的存在而不能复制，结果每复制一次染色体末端将丢失一段序列。端粒的存在使每次丢失的仅为端粒的一部分，从而保护了染色体内部的结构基因。另外，有些研究还显示，端粒与核运动有关，可能对同源染色体的配对重组有重
36、要意义。,线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶(telomerase)的催化下，进行延长反应。,端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。,端粒酶的爬行模型（动画演示）,母链藉非标准碱基配对回折,DNA聚合酶,端粒合成完成,进一步加工,四、DNA复制的调控,就目前所知，起始阶段是DNA复制中唯一的一个可以受调节的阶段，由于受到调节而使得真核细胞在一个细胞周期中发生一次复制。调节的机制尚未了解清楚。,原核生物的调控,原核生物DNA的甲基化以及与细胞质膜的相互作用可以影响复制的起始时间。Dam甲基化酶可
37、以使oriC DNA甲基化，甲基化发生在回文序列GATC中腺嘌呤的N6位（Dam代表腺嘌呤甲基化的缩写）。大肠杆菌的oriC区域有很多GATC序列片段，这一片段在大肠杆菌染色体中的平均频率是每256个碱基对中有1个，而在oriC区域的245个碱基对中就有11个这样的片段。,原核生物的调控,复制完成后，DNA是半甲基化，即oriC区域的母链是甲基化，而新合成的链没有甲基化。oriC的半甲基化序列会在质膜上滞留一段时间（机制尚不清楚）。当oriC从质膜上释放出来，在它再次与DnaA结合并引发DNA复制之前，它必须由甲基化酶将其甲基化。复制起始的调节可能也涉及到由DnaA蛋白质引起的ATP的缓慢水解
38、，因为这种调节使DnaA蛋白质在活化态（与ATP结合）和非活化态（与ADP结合）间发生循环变化。,真核生物的调控（远比原核生物更为复杂）,真核生物的细胞有多条染色体，每一条染色体上有多个复制起点，所以是多复制子。它们的复制是由时间控制，并不是所有起点都是同一时间被激活的，而是有先有后。复制时间与染色质结构、DNA甲基化及转录活性有关。通常活性区先复制，异染色质区晚复制。复制是双向的，相邻两复制起点形成的复制叉相遇后借助拓扑异构酶而使子代分子分开。,真核生物的调控（远比原核生物更为复杂）,真核生物似乎没有复制终止子。染色体复制在一个细胞周期中只发生一次，所有基因既无丢失，也不会过剩。这一机制被认
39、为是复制许可因子（replication licensing factor）所控制。该因子为复制起始所必需，但一旦复制起始后它即被灭活或者降解。由于复制许可因子不能通过核膜，只能经过有丝分裂在重建核结构时才能进入核内并作用于染色体的复制起点，这使其仅在有丝分裂后期才能与复制起点相互作用。真核生物的复制起始是受多种因子的调控，这些因子的磷酸化和去磷酸化直接影响着复制的起始。,第三节 DNA的损伤修复 DNA的损伤：DNA在复制时产生错配、病毒基因整合，某些理化因子如紫外线、电离辐射和化学诱变等，破坏DNA的双螺旋结构，从而影响DNA的复制，并使DNA的转录和翻译也跟着变化，因而表现出异常的特征（
40、生物突变）。,引发突变的因素,物理因素 紫外线(ultra violet,UV)、各种辐射,化学因素,目 录,突变分子的改变类型,错配(mismatch)缺失(deletion)插入(insertion)重排(rearrangement),DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。,（一）错配,镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基,正常成人Hb(HbA)亚基,（二）缺失、插入和框移,缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。,插入：原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。,框移突变是指三联体密码的阅读方式改变，造成肽链氨基酸排列顺序发生改变。,缺失
41、或插入都可导致框移突变。,缺失引起框移突变,（三）重排,DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。,由基因重排引起的两种地中海贫血基因型,目 录,DNA损伤的修复,修复(repairing)是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复为原有的天然状态。,错配修复切除修复(direct repairing)直接修复(excision repairing)重组修复(recombination repairing)SOS修复,修复的主要类型,一、错配修复（mismatch repair）,原核生物：依赖于模板链所提供的信息，可提高复制的忠实性102103。修复系统须首先识别模板和新合成的链；链的识别是依
42、赖于Dam甲基化酶的作用，酶使DNA的5-GATC序列中腺嘌呤的N6位甲基化。在DNA复制后的一段时间，模板甲基化而新链不甲基化，未被甲基化的GATC序列就是新合成链与模板链的区分点。复制错配发生在GATC序列半甲基化的附近，就依据已甲基化的模板的信息去修复。这种甲基指导的错配修复系统中可以有效修复错配达1 000个碱基对。,MutH和MutS蛋白对(5)GATC和错配核苷酸具有特异的识别功能。MutL蛋白与MutS蛋白结合形成一个复合物，再附着到错配碱基对上，MutH蛋白继之与MutL和MutL-MutS复合物结合。错配碱基对带着两边的DNA穿过MutL-MutS复合物，形成了一个DNA环。
43、一旦遇到半甲基化GATC序列，MutH的位点专一性核酸内切酶活性被激活，在GATC序列中靠5端的G处切断非甲基化链。一个由型解螺旋酶和几个外切核酸酶组成的复合物从切点到错配点降解未甲基化的DNA链。,如果错配位置距GATC序列较远，前面的过程同前所述，在GATC序列中靠5端的G处切断非甲基化链后，后面的过程决定于错配位点相对于切点的位置。,错配修复在能量消耗方面特别大。错配位置可能会距GATC序列达1 000个碱基对。裂解和替换这么长的链需要大量dNTP，而目的只是为了修复一个错配的碱基对。这说明遗传信息的稳定传递是需要很大的代价，维持基因的完整是细胞的重要作用。真核生物：真核细胞DNA错配修
44、复的详细机制还不清楚，但与细菌的甲基化调控体系不同。,二、切除修复(excision repair),所谓切除修复，即在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除掉，并以完整的那一条链为模板，合成出切去的部分，然后使DNA恢复正常结构的过程。参与切除修复的酶主要有：特异的核酸内切酶、外切酶、聚合酶和连接酶。切除修复主要有两种类型：碱基切除修复（base-excision repair）核苷酸切除修复(nucleotide-excision repair),（一）碱基切除修复,细胞中有一类DNA糖苷酶(DNA glycosylase)，识别一些常见的DNA损伤(如脱氨基的胞嘧啶和腺嘌呤)，通
45、过断裂N-糖苷键切除受到影响的碱基，从而在DNA中产生无嘌呤(apurinic)或无嘧啶(apyrimidinic)位点，常称为AP位点(AP site)。每种DNA糖苷酶专一作用于一种类型的损伤。例如，细胞中的尿嘧啶糖苷酶，它能去除DNA中由胞嘧啶自发脱氨基所产生的尿嘧啶，以及DNA复制过程中误掺的少量脱氧尿苷酸。缺乏这种酶的变异细胞，GC突变为AT的比例很高。这种糖苷酶并不能作用于RNA的尿嘧啶和DNA的胸腺嘧啶。从胞嘧啶脱氨基产物（尿嘧啶）中识别胸腺嘧啶的能力可能是DNA进化为含胸腺嘧啶而不含尿嘧啶的原因之一。,（二）核苷酸切除修复,通常单个碱基缺陷通过碱基切除修复，如果DNA损伤造成D
46、NA螺旋状结构扭曲，可通过核苷酸切除修复方式修复。多亚基组成的核苷酸切除酶水解损伤部位两侧磷酸二酯键。在大肠杆菌和其他原核生物中，酶系统水解3端的第5个磷酸二酯键以及5端的第8个磷酸二酯键，根据损伤是1或2个碱基而产生一个含有12或13个核苷酸的片段。人类和其他真核细胞，酶水解3端第6个磷酸二酯键和5端的第22个磷酸二酯键，产生含有2729个核苷酸的片段。经双重断裂后，切除的寡核苷酸链从双螺旋中释放出来，留下的缺口在大肠杆菌由DNA聚合酶I填补，在人体内由DNA聚合酶填补。切口由DNA连接酶连接。,在大肠杆菌中，关键的酶复合物是由uvr基因编码的ABC核苷酸切除酶（excinuclease）。
47、其活性依赖于3个亚基：UvrA、UvrB、UvrC。UvrA和UvrB形成的复合物（A2B）扫描DNA并锁定损伤部位。UvrA二聚体随即离开UvrB-DNA复合物。UvrC与UvrB结合后，UvrB水解损伤DNA的3端的第5个磷酸二酯键，形成切口。随后，由UvrC水解5端第8个磷酸二酯键，产生另一切口，UvrD解旋酶继而去除这个1213个核苷酸片段，产生的缺口立刻由DNA聚合酶和DNA连接酶填补和封闭。,ABC核苷酸切除酶可在DNA上产生两个切割点，核苷酸切除酶一词就根据该活性来命名，以与标准的核酸内切酶相区别。真核生物核苷酸切除酶的16个亚基与大肠杆菌的核苷酸切除酶亚基结构不同，但它的功能与
48、细菌中的酶极为相似。,切除酶可以识别许多种DNA损伤，包括嘧啶二聚体和其他几类碱基加合物（如因接触烟草烟雾而在DNA上生成的-苯并芘鸟嘌呤）。因此，此途径是许多类型DNA损伤的主要修补途径。切除修复不局限于某种特定原因造成的DNA损伤，而是一般的识别DNA双螺旋结构的改变，对遭到破坏而呈现不正常结构的部分加以去除和修复，以维持DNA的完整性。在核苷酸切除修复过程中，所产生的遗传缺陷会导致人类产生各种各样的疾病。,三、直接修复,许多类型的损伤修复不必将碱基或者核苷酸切除，因而称为直接修复（direct repair）。最典型的例子是环丁烷嘧啶二聚体的光复活修复，该反应由DNA光复活酶（photo
49、reactivating enzyme）也称DNA光解酶（DNA photolyase）引发。,（一）光修复 400nm左右的光激活光复活酶，专一分解紫外光照射引起的同一条链上的TT（或CC，CT）二聚体,光修复酶(photolyase),UV,（二）直接修复的另一种方式的例子是O6-甲基鸟嘌呤的修复，烷化剂诱导O6-甲基鸟嘌呤的形成是一种常见和诱变率高的DNA损伤。在复制的过程中，它倾向于与胸腺嘧啶而不是胞嘧啶配对，因此就会导致从GC到AT的突变（图5-25）。,O6-甲基鸟嘌呤的直接修复由O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶引发，此酶催化O6-甲基鸟嘌呤上的甲基转移到酶自身的半胱氨酸残基上。
50、酶在接受这个甲基后，会使蛋白质永久甲基化，从而失去活性。严格说来，这种甲基转移酶并不是一种酶，因为单个甲基的转移即将其失活，所催化的反应是一种自杀性抑制剂类型。要修复一个损伤的甲基就要消耗一个蛋白质分子，这又一次说明保持细胞DNA完整性的重要地位。同时失活的甲基化酶作为一种蛋白质起到转录激活因子的功能，增强了其自身基因和其它几种修复酶基因的表达，这充分反应生物体功能的高效性和协同性。,此外，DNA单链断裂也是损伤的一种常见形式，修复这类损伤是直接通过重新形成3,5 磷酸二酯键来完成。因此，只需要DNA连接酶的参与，由ATP或NAD+提供能量。,四、重组修复,上述介绍到的修复途径通常仅对双链DN
