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1、第八章 蛋白质和氨基酸的测定(p114)第一节 概述,蛋白质是含氮的有机化合物，分子量很大。主要由C、H、O、N、S五种元素组成。某些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。蛋白质是生命的物质基础，人体11%13%总热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同。动物蛋白和豆类蛋白是优良的蛋白质资源。蛋白质是食品的最重要质量指标，其含量与分解产物直接影响食品的色、香、味。一般蛋白质含氮量为16%，即1份氮相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质换算系数。,氨基酸是构成蛋白质的最基本物质，构成蛋白质的氨基酸主要是其中20种，二在构成蛋白质的氨基酸中，亮氨酸、异亮
2、氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸等8种氨基酸在人体中不能合成，必须依靠食品供给，故被称为必须氨基酸。蛋白质的测定方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质含量。,食品和其原料中蛋白质含量的测定，最常用的方法是凯氏定氮法：它是测定总有机氮的最准确和操作较简便的方法之一。该法是通过测出样品中的总含氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的氮，所以只能称为粗蛋白的含量（但马铃薯等非蛋白氮多的要单测）。目前，测定蛋白质和氨基酸含量的方法很多，如：双缩脲反应、染料
3、结合反应、酚试剂法等。国外：红外分析仪。氨基酸总量：酸碱滴定法测定。各种氨基酸的分离与定量色谱技术。有多种氨基酸分析仪。,第二节 蛋白质的定性测定,一、蛋白质的一般显色反应（一）氨基黑法：氨基黑10B是酸性染料，其磺基与蛋白质反应构成复合盐，是最常用的蛋白质染料。经点样后的层析纸经电泳或层析后，浸入氨基黑10B乙酸甲醇溶液中染色10min，染色后，用10乙酸甲醇溶液洗涤5-7次，待背景变成浅蓝色后干燥。若欲进行洗脱，用0.1mol/L氢氧化钠浸泡30min，于595nm波长下比色测定。氨基黑10B乙酸甲醇溶液：13g氨基黑10B溶解于100ml冰乙酸和900ml甲醇中，充分摇匀，放置过夜，过滤
4、后可反复使用几次。聚丙烯酰胺凝胶电泳后染色：凝胶薄层的直接染色：本法优点是灵敏度较高，缺点是花费时间长，不同蛋白质染色强度不同。,（二）溴酚蓝法：经电泳或层析后滤纸或凝胶于0.1溴酚蓝固定染色液（1g溴酚蓝，100g氯化汞溶于50乙醇水溶液中，用50乙醇稀释至1000ml）中浸泡1520min，在30乙醇：5乙酸水溶液中漂洗过夜。如欲洗脱，可用0.1mol/L氢氧化钠。此法缺点是灵敏度低，某些低分子质量的蛋白质可能染不上色。,（三）考马斯亮蓝法：该染料和蛋白质是通过范得华力结合的。考马斯亮蓝含有较多的疏水基团，和蛋白质的疏水区有较大的亲和力，而和凝胶基质的亲和力不如氨基黑，所以用考马斯亮蓝染色
5、时漂洗较容易。经电泳后滤纸或乙酸纤维膜在200g/L磺基水杨酸溶液中浸1min，取出后放入2.5g/L考马斯亮蓝R250染色液中浸5min，在蒸馏水或7乙酸中洗四次，每次5min，于90放置15min。聚丙烯酰胺凝胶处理：凝胶用10三氯乙酸固定，在10三氯乙酸1考马斯亮蓝R250（191）中室温染色0.5h，用10三氯乙酸脱底色。考 马斯亮蓝灵敏度比氨基黑高5倍，尤其适用于SDS电泳的微量蛋白质的染色。在549nm处有最大吸收峰，蛋白质在1-10g呈线性关系。,（四）酸性品红法：经电泳后滤纸置于0.2酸性品红溶液中（2g酸性品红溶解于500ml甲醇，400ml蒸馏水和100ml冰乙酸中）加热染
6、色15min；取出后浸入乙酸甲醇溶液（500ml甲醇，400ml蒸馏水和100ml冰乙酸）15min；然后浸入10乙酸溶液，每次20min，至背景无色为止。如欲进行比色，可用0.1mol/L氢氧化钠浸泡2h，在波长570nm处比色。（五）氨基萘酚磺酸法：聚丙烯酰胺凝胶电泳后，把凝胶暴露在空气中几分钟，或在2mol/LHCl中浸一下使表层蛋白变性，再在0.003氨基萘酚磺酸的0.1mol/L磷酸盐缓冲液（Ph6.8）中染3min，在紫外光下可显黄绿色荧光。这样的染色可保留凝胶内部的酶和抗体的活性。如不需保留活性，可先在3mol/LHCl中浸2min以上使蛋白质充分变性，在染色。,二、复合蛋白质的
7、显色反应（一）糖蛋白的显色：1、过碘酸Schiff氏试剂显色法：试剂：过碘酸液；还原液；亚硫酸品红液；亚硫酸盐冲洗液等。显色步骤：将含有样品的滤纸浸在70乙醇中，片刻后吹干，在高碘酸液中浸5min，用70乙醇洗1次，在还原液中浸5-8min，再用70乙醇洗1次，在亚硫酸品红液中浸24-25min，用亚硫酸盐冲洗液洗3次，并用乙醇脱水后，放在玻璃板上吹干。显色结果：在黑灰色的底板上呈现紫红色。,2、甲苯胺蓝显色法：试剂：试剂甲：1.2g过碘酸溶解在30ml蒸馏水中，加15ml0.5mol/L乙酸钠和100ml96乙醇。现配现用。试剂乙：100ml甲醇加20ml冰乙酸及80ml蒸馏水。试剂丙：溴水
8、，试剂丁：10g/L甲苯胺蓝水溶液，试剂戊：40g/L钼酸铵溶液。显色步骤：将点有样品的滤纸依次在试剂甲中浸15min，试剂丙溴水中浸15min，用自来水漂洗，再在试剂丁中浸30min，自来水漂洗至没有蓝色染料渗出（30-40min）后，再依次在试剂戊中浸3min，试剂乙中浸15min，丙酮中浸2min后在空气中干燥。显色结果：糖蛋白部分染成蓝色，背景带有红紫色。,3、阿尔新蓝显色法：聚丙烯酰胺凝胶在12.5三氯乙酸中固定30min后，再用蒸馏水轻轻漂洗。放入1过碘酸液（在3乙酸中）中氧化50min。用蒸馏水反复洗涤去除多余的过碘酸盐，再放入0.5偏重亚硫酸钾中还原剩余的过碘酸盐30min，再
9、用蒸馏水洗涤，浸在0.5阿尔新蓝（在3乙酸中）溶液中染4h。,（二）脂蛋白的显色：1、苏丹黑显色法：将0.1g苏丹黑B溶解于煮沸的100ml60的乙醇溶液中，制备成饱和溶液，冷却后过滤两次，备用。显色时将点有样品的滤纸浸于上述溶液中，3h后取出，用50乙醇溶液洗涤两次，每次15min，空气干燥。聚丙烯酰胺凝胶电泳中预染法：加苏丹黑B到无水乙醇中成饱和液，并振摇使乙酰化。用前过滤。按样品液的1/10量加入样品液中染色1h或4过夜，染色后的样品再进行电泳。,2、油红O显色法：0.04g油红O溶解于100ml60乙醇中，30放置过夜（16h）使充分饱和后，在30下滤去多余的染料，澄清液即可用于染色。
10、将滤纸浸入染料液中，在30下染色18h后，用水冲洗，使背景变浅，在空气中干燥。脂蛋白为红色，背景为桃红色。本法在30以下显色时，会引起染料沉淀。,第三节 蛋白质的定量测定,一般说来，动物性食品的蛋白质含量高于植物性食品。例如牛肉中蛋白质含量为 20.0%左右，猪肉 9.5%，兔肉 21%，鸡肉 20%，牛乳 3.5%，带鱼 18.0%，大豆 40%，面粉 9.9%，菠菜 2.4%，黄瓜 1.0%，苹果 1.4%。测定食品中的蛋白质的含量，对于评价食品的营养价值，合理开发利用食品资源、提高产品质量、优化食品配方、指导经济核算及生产过程控制均具有极其重要的意义。一些蛋白质的含氮量一般为 15%17
11、.6%，有的上下浮动，可以测出总氮 N。,一、凯氏定氮法 凯式定氮法可用于所有动植物食品的蛋白质含量测定，但因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故结果称为粗蛋白质含量。由Kieldhl于1833年提出，经过长时间的改进，迄今已演变为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法，书中只介绍前三种。,（一）常量凯氏定氮法：1、原理：样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。然后加碱蒸馏，使氨蒸出。用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含
12、量。用H3BO3吸收后再以标准HCl溶液滴定。根据标准酸消耗量可以计算出蛋白质的含量。也可以用过量的标准H2SO4或标准HCl溶液吸收后再以标准NaOH滴定过量的酸。整个过程分三步：消化、蒸馏、吸收与滴定。,（1）样品消化：总反应式：2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用浓硫酸（98%），浓硫酸具有脱水性，使有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮；浓硫酸又具有氧化性，将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原为二氧化硫。二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。在消化反应中，为加速蛋白
13、质的分解，缩短消化时间，常加入下列物质：硫酸钾：作为增温剂，加入硫酸钾可以提高溶液沸点而加快有机物分解。纯硫酸沸点 340，至400以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。硫酸铜：硫酸铜起催化剂的作用。还可以指示消化终点的到达，以及下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。氧化剂：如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速度。,（2）蒸馏：消化液+40%氢氧化钠加热蒸馏，放出氨气。（3）吸收与滴定：用4%硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红溴甲基酚绿混合指示剂）国标用亚甲基兰+甲基红。指示剂：红色绿色红色（酸）（碱
14、）（酸）用过量的 H2SO4 或 HCl 标准溶液吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。,2、仪器 此法可用于各类食品中蛋白质含量测定，是国家标准方法（GB/T5009.5-1985）。3、试剂4、操作方法取样：固体样品0.2-2g，半固态样2-5g，液体样品10-20ml。消化剂：硫酸铜0.5g，硫酸钾10g，浓硫酸20ml。消化结束：液体变蓝绿色透明后，再继续加热微沸30min。蒸馏：以奈氏试剂检查，如无红棕色物生成，表示蒸馏完毕，即可停止加热。以奈氏试剂Nessler试剂，K2（HgI4）检验NH4+离子，遇铵根，离子析出黄色或红棕色沉淀。配制：方法1：3.5 g
15、 KI+1.3 g HgCl2 溶于70 毫升水。加30毫升4 mol/L氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液，必要时过滤，并存于玻璃瓶中盖紧口。方法2：溶解11.5 g HgI2+KI 10 g于适量少许水，后加水稀释至50 ml,静置后，取其澄清液，弃去沉淀，储存于棕色瓶中。,5、结果计算：式中：cHCl标准溶液的浓度，mol/L;V1滴定样品吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，ml；V2滴定空白吸收液时消耗盐酸标准溶液体积，ml；m样品质量，g；F氮换算为蛋白质的系数；M 1/2N2摩尔质量，14.01g/moL。,6、说明及注意事项：所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以
16、免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。样品中若含脂肪较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30过氧化氢 23 m1 后再继续加热消化。,若取样量较大，如干试样超过5 g 可按每克试样5 m1的比例增加硫酸用量。般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品如含赖氨酸、组
17、氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。蒸馏装置不能漏气。蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氢氧化铜在7090时发黑。硼酸吸收液的温度不应超过40，否则对氨的吸收作用减弱而造成损失，此时可置于冷水浴中使用。蒸 馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。,（二）微量凯氏定氮法：1、原理：同常量凯氏定氮法。2、仪器3、试剂4、操作方法：与常量法不同点：加入硼酸量
18、有50 ml 10 ml；滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L；可用微量滴定管。取样量较少。样品消化步骤同常量法。滴定：馏出液用0.01000mol/LHCl标准溶液滴定至微红色为终点。同时做一空白试验。,5、结果计算6、说明：蒸馏前给水蒸气发生器内装水至2/3容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升以使其始终保持酸性，这样可以避免水中的氨被蒸出而影响测定结果。20g/L硼酸吸收液每次用量为25ml，用前加入甲基红溴甲酚绿混合指示剂两滴。在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断气，否则将发生倒吸。加碱要足量，操作要迅速；漏斗应采用水封措施，以免氨由此逸出损失。,（三
19、）自动凯氏定氮法：是指将常量凯氏定氮装置组装成具有自动操作功能的一套装置，其原理与试剂与常量法相同，操作方法如下：称取0.50-1.00g样品，置于消化瓶内，加入硫酸铜和硫酸钾制成的片剂两片，加入浓硫酸10ml，将消化瓶置于红外线消化炉中，用连接管密封住消化瓶，开启抽气装置，开启消化炉电源，30min后8个样品消化完毕，消化液完全澄清并呈绿色。取出消化瓶，移装于自动凯氏定氮仪中，连接开启加水电钮，加碱电钮、自动蒸馏滴定电钮，开启电源，约经12min后由数显装置即可给出样品总氮百分含量，并记录样品总氮百分比。根据换算系数F即可得出样品中蛋白质含量。开启排废液电钮和加水电钮，排出废液并对消化瓶进行
20、清洗1次。,二、双缩脲法（一）原理：当脲（尿素，NH2CONH2）加热至150160时，两分子缩和成双缩脲。NH2CONH2+NH2CONH2NH2CONHCONH2+NH3 双缩脲能和硫酸铜的碱性溶液生成紫色络和物，这种反应叫双缩脲反应（缩二脲反应）。由于蛋白质分子中含有肽键 CONH，与双缩脲结构相似。故也能出现此反应而生成紫红色配合物，在一定条件下，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，据此可用吸光度法来测定蛋白质含量，该配合物的最大吸收波长为 560nm。注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化,（二）方法特点及应用范围：本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白
21、质含量时常用此法。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。（三）仪器：分光光度计，离心机（4000 r/min）。（四）试剂：碱性硫酸铜溶液；四氯化碳。（五）操作方法：采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线。样品测定：准确称取样品适量（使蛋白质含量在40-110mg之间）于50ml纳氏比色管中，加1ml四氯化碳，按上述步骤显色后，在相同条件下测定吸光度A。用测得的A值在标准曲线上即可查得蛋白质毫克数，进而由此求得样品中的蛋白质含量。（六）结果计算：蛋白质含量m100/m1（mg/100g）式中：m由标准曲线上查得的蛋白质质量，mg；m1样品质量，g。,（七）说明及注意事项
22、：蛋白质种类不同，对发色程度影响不大。标准曲线制作完整后，无需每次再作标准曲线。含脂肪高的样品应预先用醚脱脂。样品中有不溶性成分存在时，会给比色测得带来不便，此时可预先将蛋白质抽出后再进行测得。当肽链中含脯氨酸时，若有多量糖类共存，则显色不好，会使测得值偏低。碱性硫酸铜溶液由0.1mol氢氧化钾、5g酒石酸钾钠，1.6g硫酸铜溶于水后加水至1000ml配成。,三、紫外吸收法（一）A280nm光吸收法：1、原理：蛋白质及其降解产物（胨、肽和氨基酸）的芳香环残基【NHCH（R）CO】在紫外区内对一定波长的光具有选择吸收作用，在波长（280 nm）下，光吸收程度与蛋白质浓度（38mg/mL）成直线关
23、系，因此，通过测定蛋白质的吸光度，并参照事先用凯式定氮法测定蛋白质含量的标准样所做的标准曲线，即可求出样品蛋白质含量。,2、适用范围：本法操作简单迅速，常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。3、仪器4、试剂5、操作方法：制作标准曲线：样品的测定：准确称取试样1.00g，如前处理，吸取的每毫升样品溶液中含有3-8mg的蛋白质。按标准曲线绘制的操作条件测定其吸光度，从标准曲线上查得蛋白质的含量。6、结果计算：蛋白质含量m100（）式中：m由标准曲线上查得的蛋白质质量，mg；m1测定样品溶液所相当于样品的质量，mg。,7、说明及注意事项：测定牛奶样品时的操作：准确吸取混合均
24、匀的样品0.2ml于25ml纳氏比色管中，用95-97的冰乙酸稀释至标线，摇匀，以95-97的冰乙酸为参比液，用1cm比色皿于280nm处测定吸光度，并用标准曲线确定样品蛋白质含量。测定糕点时，应将表皮的颜色去掉。温度对蛋白质水解有影响，操作温度应控制在20-30。,（二）肽键紫外光测定法：蛋白质溶液在238nm下均有光吸收，其吸收强弱与肽键多少成正比，根据这一性质，可测定样品在238nm下的吸收值，与蛋白质标准溶液作对照，求出蛋白质含量。本法比280nm吸收法灵敏。在50-500mg/L蛋白质范围内呈良好的线性关系。A260nm和A280nm比值法：1、原理：凡是有共轭双键的物质，均具有紫外
25、吸收值。因此，若样品中含有核酸，则嘌呤、嘧啶类碱基对蛋白质的测定产生干扰，应加以校正。核酸在260nm处的紫外吸收值大于280nm处的，但蛋白质刚好相反。利用此性质，通过计算可以适当校正核酸对测定蛋白质浓度的干扰。,2、测定：取一定量的样品稀释液，分别测定样品的A260nm和A280nm，计算A280nm/A260nm的比值后，从表10-2中查出校正因子F值，同时可查出该样品中混杂的核酸质量分数。将F值代入，由下列公式可直接计算该样品的蛋白质含量：蛋白质含量FA280nmn/d（mg/ml）式中：A280nm该样品液在280nm波长下的吸收值；d石英杯的厚度，cm；n样品的稀释倍数。,A215
26、nm和A225nm的吸收差法：3、样品测定：取一定量的样品液，以蒸馏水调零，分别测定A215nm和A225nm，并求出差值A215nmA225nm，与蛋白质标准溶液吸收差值作对照，求出样品蛋白质含量。本法在20-100mg/L蛋白质范围内呈良好的线性关系。,四、福林酚比色法（一）原理：蛋白质与福林（Folin）酚试剂反应，产生蓝色复合物。作用机理主要是蛋白质中的肽键与碱性酮盐产生双缩脲反应，同时也由于蛋白质中存在的酪氨酸与色氨酸同磷钼酸磷钨酸试剂反应产生颜色。呈色强度与蛋白质含量成正比，是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。（二）试剂：福林酚试剂甲，福林酚试剂乙，牛血清蛋白标准溶液（10
27、0g/ml）。,（三）操作方法：吸取一定量的样品稀释液，加入试剂甲3.0ml，置于25水浴中保温10min，再加入试剂乙0.3ml，立即混匀，保温30min，以介质溶液调零，测定A750nm值，与蛋白质标准溶液作对照，求出样品中的蛋白质含量。本法在060mg/L蛋白质范围呈良好线性关系。（四）说明：福林酚法灵敏度高，酚类和柠檬酸对该法均有干扰。,五、考马斯亮蓝染料比色法（一）原理：考马斯亮蓝G250是一种蛋白质染料，与蛋白质通过范得华引力结合，使蛋白质染色，在620nm处有最大吸收值，可用于蛋白质的定量测定。此法简单迅速，适合大量样品的测定，灵敏度与福林酚法相似。但不受酚类、游离氨基酸和小分子
28、的影响。（二）试剂：牛血清蛋白标准溶液；染料试剂：称取考马斯亮蓝G-25060mg，溶于100ml,3过氯酸溶于中，过滤，储于棕色瓶中。（三）操作方法：吸取样品液2ml，加染料试剂2ml，混匀，以介质溶于调零，测定A620nm，与蛋白质标准溶液对照，求出蛋白质含量。本法在0-100mg/L蛋白质范围呈良好的线性关系。,六、水杨酸比色法（一）原理：样品中的蛋白质经硫酸消化而转化成铵盐溶液后，在一定的酸度和温度条件下可与水杨酸钠和次氯酸钠作用生成蓝色化合物，可以在波长660nm处比色测定，求出样品含氮量，进而计算出蛋白质含量。（二）仪器（三）试剂（四）操作方法：绘制标准曲线：样品处理：取样0.20
29、-1.00g，加入15ml浓硫酸，0.5g硫酸铜和4.5g无水硫酸钠，消化。样品测定：取一定量消化液定容，比色。,（五）结果计算：总氮量（mK）100/（m110001000）式中：m从标准曲线上查得的样液含氮量，g；K样品溶液稀释倍数；m1样品质量，g。（四）说明：应在样品消化当天进行比色测定；温度对显色影响很大，应严格控制温度；此法结果与凯氏定氮基本一致；试剂配制必须标准。,七、红外光谱法（一）原理：食品中不同的功能基团吸收不同频率的辐射。对于蛋白质和多肽，多肽键在中红外波段（6.47m）和近红外波段（3300-3500nm，2028-2220nm，1560-1670nm）的特征吸收可用于
30、测定食品中的蛋白质含量。（二）应用：红外牛乳分析仪采用中红外光谱法测定牛乳蛋白质含量，近红外光谱仪也广泛应用于食品蛋白质分析。,八、4,4-二羧基-2,2联喹啉（BCA）法（一）原理：二价铜离子在碱性条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和独特的BCA试剂（含有BCA）相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个一价铜离子，形成浅紫色的反应复合物。反应形成颜色的深浅与一定范围内蛋白质浓度成正比。（二）方法：蛋白质溶液和含有BCA钠盐、碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜、pH11.25的BCA试剂一步混合；在37保温30min或室温下放置2h，或60保温30min。温度的选择取决于灵敏度的
31、要求。较高的温度导致较深的颜色反应；在562nm处比色测定，并作空白试验；用BSA（牛血清蛋白）作标准曲线。（三）应用：BCA法已经应用于蛋白质的分离和纯化中。此法对测定复杂食品体系中蛋白质的适用性还未见报道。,优点：灵敏度与福林酚法相似，微量BCA法的灵敏度（0.5-10g）稍高于福林酚法；一步混合的操作更简单；所用试剂比福林酚法简单；非离子型表面活性剂和缓冲液不对反应产生干扰；中等浓度的变性剂（4mol/L盐酸胍或3mol/L尿素）不对反应产生干扰缺点：反应产生的颜色不稳定，需要仔细控制比色时间；还原糖对此反应产生的干扰比对福林酚法更大；不同蛋白质反应引起的颜色变化与福林酚法相似；比色的吸
32、光度与蛋白质浓度不成线性关系。,九、比浊法（一）原理：低浓度（310）的三氯乙酸、磺基水杨酸和乙酸中的铁氰化钾能使提取的蛋白沉淀形成蛋白质颗粒的悬浊液。其浊度可由辐射光传送过程中的衰减而确定，辐射光传送过程中的衰减是由于蛋白质颗粒的散射造成的，辐射光衰减的程度与溶液中的蛋白质浓度成正比。,（二）操作方法：测定小麦蛋白质的常规方法为磺基水杨酸法，具体如下：小麦面粉用0.05mol/L氢氧化钠溶液萃取；将溶于碱性溶液的蛋白质从原料中离心分离；磺基水杨酸和蛋白质溶液混合；在540nm处测定其浊度，并扣去空白；蛋白质的含量可根据凯氏定氮法校正过的标准曲线来计算。,（三）应用：比浊法已经用于测定小麦面粉
33、和玉米的蛋白质含量。优点：快速、可在15min内完成；测定结果不包括除了核酸外的非蛋白质含量。缺点：不同的蛋白质沉淀速度不同；浊度随酸试剂浓度的不同而变化；核酸也能被酸试剂沉淀。,十、杜马斯法（燃烧法）（一）原理：样品在高温下（700-800）燃烧，释放的氮气由带热导检测器（TCD）的气相色谱仪测定。测得的氮含量转换成样品中的蛋白质含量。（二）操作方法：样品（100-500mg）称量后置于样品盒中，放入具有自动装置的燃烧反应器中，释放的氮气由内置的气相色谱仪测定。（三）应用：燃烧法适用于所有种类的食品，AOAC方法992.15和992.23分别用于肉类和谷物食品。,优点：是凯氏定氮法的一个替代
34、法；不需要任何有害化合物；可在3min内完成；最先进的自动化仪器可在无人看管的状态下分析多达150个样品。缺点：需要的仪器昂贵；非蛋白氮也包括在内。,第四节 蛋白质的末端测定,一、N末端测定丹磺酰化法（一）原理：蛋白质的氨基与丹磺酰氯（DNS-Cl）反应，生成DNS-蛋白质，经水解可生成DNS氨基酸。通过分析DNS氨基酸，可确定蛋白质的N末端氨基酸。（二）仪器和试剂,（三）操作方法：1、氨基酸的丹磺酰化：采用层析法得到各种DNS-氨基酸的标准图谱。2、蛋白质样品N-末端氨基酸的DNS化：取样0.5mg，置于具塞玻璃试管中，用少量水溶解后，加入0.5mL，0.2mol/L碳算清钠溶液。再加入0.
35、5mlDNS-Cl丙酮溶液，用三乙胺调至pH9.0-9.5，塞好塞子，于40烘箱中反应2h，或室温放置2-4h，生成DNS-蛋白质。,3、DNS-蛋白质水解：DNS化反应结束后，真空蒸去丙酮，加入0.5ml，6mol/L盐酸溶解DNS-蛋白质。全部移入水解管，抽真空封管，于110烘箱中水解18-24h。开管后蒸去盐酸，加少量水，在蒸干。重复2-3次，除尽盐酸。4、DNS-氨基酸的抽提：将上述水解产物加0.5ml水，用1mol/LHCl调至pH2-3。加入0.5ml乙酸乙酯抽提，除去乙酸乙酯，于干燥器中备用。5、DNS-氨基酸的层析与检测：将抽提的DNS-氨基酸和标准DNS-氨基酸分别进行聚酰胺
36、薄膜层析。将图谱用360nm或280nm波长的紫外灯检测，进行比较。,二、蛋白质及多肽C-末端测定及顺序分析（羧肽酶法）（一）原理：一般先进行末端基测定，然后进行顺序分析。通常C末端基测定要比N末端基的测定困难。目前普遍采用羧肽酶法进行C-末端基测定及C-端氨基酸顺序分析。羧肽酶是一类外肽酶，这些酶与蛋白质或多肽作用时，能从C-末端氨基酸残基开始顺序降解，并逐个释放出游离C端氨基酸。,蛋白质或多肽在羧肽酶作用下，被逐步降解及释放的氨基酸种类和数目随时间而发生变化，将经过一定间隔时间反应的样品分别取出，进行酸化失活处理后可用自动分析仪或HPLC仪进行快速测定，根据不同时间取样的分析结果便能初步确
37、定C-末端基为何种氨基酸。若以酶作用时间为横坐标，对所释放的各氨基酸量（mol/L）为纵坐标作图，然后根据氨基酸释放的动力学曲线即可进一步判断和确定肽链C端的氨基酸顺序。肽链C端的氨基酸顺序测定的关键在于测出第一个释放的为何种氨基酸，一般最好采用两种以上C末端测定方法进行比较和验证才可靠。,（二）试剂：羧肽酶Y；牛胰核糖核酸酶A；降解缓冲液。（三）操作步骤：1、酶液和样品溶液的制备：2、样品酶解：3、氨基酸分析：取上清液用自动氨基酸分析仪进行氨基酸定性或定量分析。,（四）实验结果：1、动力曲线绘制：依据自动氨基酸分析仪测定所提供的数据，以酶解时间为横坐标，对不同时间所释放的各种氨基酸相应的量（
38、mol/L）为纵坐标作图，绘制出氨基酸释放的动力学曲线图。2、C末端分析结果：根据上述氨基酸释放的动力学曲线分析，判断和确定被测定蛋白质的C-末端为何种氨基酸，并写出其C末端氨基酸排列顺序。,第五节 氨基酸的定性测定,一、氨基酸的一般显色反应（一）茚三酮法：常用法：将点有样品的层析或电泳完毕的滤纸充分除尽溶剂，用5g/L茚三酮无水丙酮溶液喷雾，充分吹干，置65烘箱中约30min（温度不宜过高，避免空气中氮，以免背泛红色），氨基酸斑点呈紫红色。,（二）吲哚醌法：1、原理：各种氨基酸与吲哚醌试剂能显示不同颜色，因此可借此辨认氨基酸。氨对吲哚鲲显色没有妨碍，但其灵敏度较茚三酮法稍差，显色不稳定，颜色
39、只有在绝对干燥的环境中才能保存。2、试剂：显色剂；底色退色剂。3、显色步骤：,（三）邻苯二甲醛法：邻苯二甲醛法是目前纸上层析、硅胶薄层层析荧光显色氨基酸最灵敏的方法之一，也可用于氨基酸溶液定量，并推广应用于乙内酰苯硫脲氨基酸、多肽和蛋白质的检出和定量。1、原理：邻苯二甲醛在2-巯基乙醇存在下，在碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最合适的激发光和发射光波长分别为340nm和455nm。2、试剂：邻苯二甲醛显色液，巯基乙醇，三乙胺，丙酮，石油醚等。3、显色步骤：将含有氨基酸样品的滤纸浸入邻苯二甲醛显色液中1min，冷风吹干，在温度18以下，湿度5090之间显色0.5h，于紫外灯下观察荧光点。4
40、、说明：显色时必须有一定的湿度，以便氨基酸溶解。,二、个别氨基酸的显色反应（一）精氨酸的显色坂口（Sakaguchi）反应：1、第一种方法：试剂：5g尿素溶解于100ml，0.1g/L萘酚乙醇中，使用前，每100ml加约5gKOH；试剂：0.7ml溴水溶解于100ml，5NaOH中。显色步骤：在点有样品的滤纸上喷试剂后，在空气中吹几分钟，再喷试剂精氨酸或含精氨酸的多肽显红色。此试剂对含精氨酸的蛋白质也适用。2、第二种方法：试剂：1g/L8-羟基喹啉的丙酮溶液；试剂：0.02ml溴水溶解于100ml，5NaOH中。显色步骤：将点有样品的滤纸烘干后，喷上试剂，吹干后，再喷试剂。精氨酸或其他胍类物质
41、显橘红色。,（二）胱氨酸和半胱氨酸的显色：试剂：1.5g亚硝基铁氰化钠溶于5ml，2mol/L硫酸溶液中，家95ml甲醇。使用时在每100ml上述溶液中加10ml28氨水，过滤除去沉淀，清液仅能保持1d。试剂：2g氰化钠溶于5ml水中，然后加95ml甲醇。显色步骤：半胱氨酸显色：在滤纸上喷试剂的清液，5min后半胱氨酸显红色。胱氨酸显色：先将滤纸浸入试剂，迅速取出，稍等片刻再喷试剂的清液，5min后胱氨酸显红色。,（三）甘氨酸的显色：试剂：0.1g邻苯二甲醛溶于100ml77乙醇中。显色步骤：点有样品的滤纸喷上试剂，甘氨酸显墨绿色，在汞灯（365nm）下显巧克力棕色。吲哚醌显色后，再用此试剂仍
42、有效。（四）脯氨酸的显色：试剂：1g吲哚醌和1.5g乙酸锌、5ml蒸馏水混合，再加入95ml异丙醇。显色步骤：层析滤纸除尽溶剂，喷上试剂，80-85烘箱内放置30min，脯氨酸显蓝色，再以30温水漂洗除去多余的试剂后，背景为白色或浅黄色。,（五）丝氨酸和羟赖氨酸的显色：试剂：0.0345mol/L过碘酸钠；试剂：15g乙酸铵加0.3ml冰乙酸，加1ml乙酰丙酮，用甲醇稀释到100ml。显色步骤：点有样品的滤纸吹干，先喷试剂，快干时喷试剂，室温放置2h，紫外灯下照射0.5h，丝氨酸和羟赖氨酸呈黄色斑点，在紫外线下都有荧光。,（六）羟脯氨酸的显色：试剂：1g吲哚醌溶于100ml乙醇和10ml冰乙酸
43、。试剂：1g对二甲基氨基苯甲醛溶于100ml丙酮，浓盐酸（91）混合液中。显色步骤：将待鉴定的溶于点于小方块纸上，干后先点上试剂，热风吹干。这时纯羟脯氨酸呈墨绿色，春脯氨酸呈深蓝色；然后再点上试剂吹干，如溶液中含有羟脯氨酸即转变为玫瑰红色。,（七）色氨酸的显色：1、第一种方法：试剂：1g对二甲氨基苯甲醛加90ml丙酮、10ml浓盐酸。新鲜配制。显色：点有样品的滤纸干燥后，喷上试剂，在室温下放置几分钟后，色氨酸显蓝色或紫红色。2、第二种方法：试剂：10ml35的甲醛加10ml25盐酸、20ml无水乙醇。显色：点有样品的滤纸喷上试剂后，100烘5min，色氨酸在波长紫外光下呈现荧光（黄橙带绿色）。
44、,（八）酪氨酸的显色：试剂：0.1亚硝基萘酚的95乙醇溶液。试剂：10硝酸水溶液。显色：点有样品的滤纸喷上试剂后，吹干，再喷试剂，然后在100烘3min，酪氨酸或含酪氨酸的多肽在浅灰绿色的背景上显红色，0.5h后转变为橘红色。（九）酪氨酸和组氨酸的显色pauly反应：试剂：4.5g对氨基苯磺酸与45ml，12mol/L盐酸共热溶解，以蒸馏水稀释至500ml。试剂：10碳酸钠水溶液。显色：点有样品的滤纸上喷试剂，片刻后再喷试剂。组氨酸及含组氨酸的多肽显橘红色；酪氨酸及含酪氨酸的多肽显浅红色。,第六节 氨基酸定量测定,一、氨基酸的一般定量测定（一）甲醛滴定法：1、原理：氨基酸具有酸性羧基（-COO
45、H）和碱性 的氨基（-NH2），它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐，加入甲醛 溶液时，-NH2与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定-COOH，并用间接的方法测定氨基酸总量。2、方法特点及应用：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况等。（适于食品中游离氨基酸的测定）。3、试剂,4、操作方法：吸取含氨基酸约20mg的样品溶液于100ml容量瓶中，加入至标线，混匀后吸取20.0ml置于200ml烧杯中，加入60ml，开动磁力搅拌器，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液体积，供计算总酸含量。加入10.0m
46、l甲醛溶液，混匀。再用上述氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液体积。同时取80ml蒸馏水置于另一个200ml洁净烧瓶中，先用氢氧化钠标准溶液调至Ph8.2，再加入10.0ml中性甲醛溶液，用0.05mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至Ph9.2，作为试剂空白实验。,5、结果计算：式中：V1样品稀释液在加入甲醛后滴定至终点（Ph9.2）所消耗氢氧化钠标准溶液的体积，ml；V2空白实验加入甲醛后滴定至终点所消耗的氢氧化钠标准溶液的体积，ml；c氢氧化钠标准溶液浓度，mol/L；m测定用样品溶液相当于样品的质量，g；0.0141/2N2的毫摩尔质量，g/mmol。6、说明及注意
47、事项：此法适用于测定食品中的游离氨基酸；混浊和色深样液可不经处理直接测定。,（二）电位滴定法1、原理 根据氨基酸的两性作用，加入甲醛以固定氨基的碱性，使羧基显示出酸性，将酸度计的玻璃电极及甘汞电极同时插入被测液中构成原电池，用氢氧化钠标准溶液滴定，依据酸度计指示的pH判断滴定终点。,（三）茚三酮比色法：1、原理：氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（除脯氨酸外均有此反应），可用吸光光度法测定。该蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸含量成正比，其最大吸收波长为570nm。故据此可以测定样品中氨基酸含量。,2、仪器3、试剂4、操作方法：绘制标准曲线：样品测定：吸取澄清的样品溶液1-4ml，
48、按标准曲线制作步骤，在相同条件下测定吸光值A,据标准曲线查得氨基酸质量（g）。5、结果计算：氨基酸含量m100/(m1-1000)（mg/100g）式中：m从标准曲线上查得的氨基酸含量，g；m1测定的样品溶液相当于样品的质量，g。,6、说明及注意事项：样品处理：取样5-10g或吸取样液5-10ml，置于烧杯中，加入50ml蒸馏水和5g活性炭，加热煮沸，过滤。用30-40ml热水洗涤活性炭，收集滤液于100ml容量瓶中，加水至标线，摇匀备用。茚三酮易氧化变色，使用前需进行纯化处理。,（四）非水溶液滴定法：1、原理：氨基酸的非水溶液滴定法是氨基酸在冰乙酸中用高氯酸的标准溶液滴定其含量。氨基酸有氨基
49、和羧基，在水中呈现中性，假如在冰醋酸中就显示出碱性，因此可以用高氯酸等强酸进行滴定。本法适合于氨基酸成品的含量测定。允许测定的范围是几十毫克的氨基酸。2、试剂,3、操作方法：直接法（适用于能溶解于冰乙酸的氨基酸）：精确称取氨基酸样品50mg左右，溶解于20ml冰乙酸中，加2滴甲基紫指示剂，用0.100mol/L高氯酸标准溶液滴定（用10ml体积的微量滴定管），终点为紫色刚消失，呈现蓝色。空白管为不含氨基酸的冰乙酸液，滴定至同样的终点颜色。回滴法（适用于不易溶解于冰乙酸而能溶解于高氯酸的氨基酸）：精确称取氨基酸样品30-40mg，溶解于5ml，0.1mol/L高氯酸标准溶液中，加2滴甲基紫指示剂
50、，剩余的酸以乙酸钠溶液滴定，颜色变化由黄，经过绿、蓝至初次出现不退的紫色为终点。,4、说明：不易溶解于冰乙酸的氨基酸，但能溶于高氯酸可以用回滴法测定的氨基酸有：赖氨酸、丝氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。谷氨酸和天冬氨酸在高氯酸溶液中也不能溶解，可以将样品溶解于2ml加酸中，再加20ml冰乙酸，直接用标准的高氯酸溶液滴定。,（五）邻苯二甲醛法（OPA法）：邻苯二甲醛在2-巯基乙醇存在下，于碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最合适的激发光和发射光波长分别为340nm和455nm。本法可用于游离氨基酸的测定，灵敏度较茚三酮法高100倍以上。不足之处：邻苯二甲醛与脯氨酸不产生荧光，与半胱氨酸荧光值太低。,
