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1、,第八章,荧光免疫试验 Fluoroimmunoassay,掌握：荧光的基本知识；荧光抗体染色与结果判断。熟悉：荧光物质。了解：荧光抗体的制备；荧光显微镜的基本结构；荧光免疫分析；荧光免疫技术的应用。,教学目的,第一节 荧光免疫试验的组成因素第二节 间接免疫荧光试验第三节 流式荧光免疫试验第四节 其他与荧光检测相关的免疫试验第五节 荧光免疫试验的临床应用第六节 影响荧光免疫试验的主要因素,荧光免疫试验（fluoroimmunoassay):以荧光物质标记抗体和抗原，通过与相应抗原或抗体发生特异性结合反应，以此对待测物进行定位、定性和定量分析的检测技术，具有高度特异性、敏感性和直观性，是最早出现
2、的免疫标记技术。,荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。,第一节 荧光免疫试验的组成要素,吸收能量,激发态,基态,荧光效率,荧光特点：1 可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；2 一旦停止供能，荧光随之瞬间消失；,(一)荧光的基本知识1.发射光谱:指固定激发光波长，在不同波长下记录到的标本发射荧光的谱图。2.激发光谱:指固定检测发射光波长，用不同波长的激发光照射标品得到的荧光的谱图。,一 荧光及荧光物质基础知识,荧光效率,吸收光的光量子数（激发光强度）,发射荧光的光量子数（荧光强度）,荧光色素本身的物理特性,激发光强度
3、及激发光波长,决定于,决定于,3.荧光物质将吸收的光能转变成荧光的百分率-荧光效率,定义:荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。,4.荧光寿命,5.荧光淬灭:荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退称为荧光淬灭。如紫外线照射、高温（20）、苯胺、酚、硝基苯、I-等。,如何避免：勿长时间照射 脉冲瞬间照射 避光保存,猝灭剂：具有荧光猝灭作用的物质,荧光淬灭,（二）荧光物质,荧光显微镜,利用一定波长的激发光对待测标本进行激发，产生一定波长的荧光，对组织细胞结构或其组分进行定性、定位和半定量分析检测。,二、荧光显微镜,隔热滤光片：位于灯室聚光器
4、前，作用阻断红外线通过而隔热。激发滤光片：位于光源和物镜之间，作用能选择性地透过紫外线可 见波长的光域，提供合适的激发光。吸收滤光片：位于物镜和目镜之间，作用阻断激发光而使发射的荧 光透过，保护眼睛。,荧光显微镜,滤光片,透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。,透射荧光显微镜光路(a),落射荧光显微镜光路(b),荧光显微镜,光路,1、抗体要求,高特异性 高亲和力 经纯化提取IgG,三、荧光素-抗体结合物,有能与蛋白质形成共价健的化学基团荧光效率高，荧光色泽与背景组织的色泽对比度高。与蛋白质结合后不影响蛋白质原有性质
5、。标记方法简单、安全无毒。与蛋白质的结合物稳定，易于保存。,2 荧光素要求,一、基本原理,特异性抗体与相应抗原反应，荧光素标记的抗抗体再与第一抗体结合。,间接荧光抗体染色法示意图,第二节 间接免疫荧光试验,间接免疫荧光法示意图,间接法：优点：敏感度高于直接法 制备一种荧光抗体可检测多种抗原 既可用于检测抗原，也可检测抗体 缺点：易出现非特异性荧光 方法较麻烦 操作时间较长 应用：自身抗体的检测,标本片上滴加特异性抗体3730min PBS洗涤 滴加二抗 3730min PBS洗涤 镜检,二、实验方法,三、注意事项,1.荧光染色时间：一小时内或28保存4小时，2.三种对照：阳对：阳性血清+荧光标
6、记物 阴对：阴性血清+荧光标记物 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物3.标本片需保持湿润，避免干燥4.滴加抗体或荧光标记物,始终保持在未知抗原标本上,-：无或仅见极微弱荧光。+：荧光较弱但清楚可见。+：荧光明亮。+：耀眼强荧光。特异荧光强度+以上判定为阳性，对照光应呈-或。根据+的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。,荧光抗体染色及结果判断,第三节 流式荧光免疫试验,流式荧光免疫试验(flow cytometry and fluorescence immunoassay):采用人工微球和流式检测方式对可溶性物质进行高通量分析的检测方法。悬浮阵列；流式微球阵列,第四节 其他与荧光检测相关的免疫试验
7、,其他荧光免疫试验,时间分辨荧光免疫测定,荧光酶免疫测定,荧光偏振免疫测定,自发荧光寿命短:1ns10ns镧系元素寿命长:10s1000s短寿命荧光完全衰变后再测定镧系元素特异荧光,（一）基本原理,时间分辨检测原理示意图,1.时间分辨,一、时间分辨荧光免疫测定,2.stokes位移:激发光谱和发射光谱的波长差。stokes位移小，相互干扰，影响结果准确性。镧系元素Stokes位移大(273nm)，激发光谱和发射光谱不重叠,时间分辨荧光免疫测定,发射光谱带较窄：613nm10nm，干扰少 激发光谱带较宽：300nm350nm，灵敏度高,3.发射光谱和激发光谱,时间分辨荧光免疫测定,4.荧光标记物
8、的相对比活性比活性：单位时间内每个标记分子可被探测到的信号量。Eu3+螯合物 反复激发 1000次/秒大大提高了荧光标记物比活性,时间分辨荧光免疫测定,结合-二酮体,Eu3+解离,酸性增强液,荧光增强,Eu3+标记抗原抗体复合物,5.信号增强,时间分辨荧光免疫测定,（二）标记物和标记方法,时间分辨荧光免疫测定,（三）方法类型,双抗体夹心法 固相抗体竞争法 固相抗原竞争法,时间分辨荧光免疫测定,（三）方法类型,时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图,灵敏度高：最小检出量10-18mol/L分析范围宽：45个数量级标记物稳定：有效使用期长测量快速，易自动化易受污染，本底增高,方法评价,时间分辨
9、荧光免疫测定,光线通过偏振滤光片后，形成一个方向的平面光称为偏振光。,偏振荧光(绿光,525nm550nm),偏振光(蓝光,485nm),荧光物质,二、荧光偏振免疫测定,抗原抗体竞争反应AgF分子小，转动速度快，偏振荧光弱 AgF-Ab分子大，转动速度慢，偏振荧光强 若待检抗原多，则AgF-Ab少，AgF多，偏振荧光弱待检抗原含量与偏振荧光强度成反比,荧光偏振免疫测定原理示意图,基本原理,方法评价,样品用量少 荧光素标记试剂稳定，使用寿命长 重复性好 快速，易自动化 适于小、中等分子物质检测 灵敏度较非均相荧光免疫测定法低,荧光偏振免疫测定,第五节 荧光免疫试验的临床应用,1.血清中自身抗体检
10、测,抗核抗体(均质型),抗核抗体(核膜型),抗核抗体(斑点型),一、间接免疫荧光试验,2.各种微生物的快速检查和鉴定,寄生虫（猴胚肾细胞内弓形虫）,细菌（藤黄微球菌),一、间接免疫荧光试验,肿瘤（人肝癌细胞）,间接免疫荧光试验,3、寄生虫感染的诊断4、白细胞分化抗原的检测5、人类白细胞抗原的检测6、肿瘤组织中肿瘤标志物的检测7、激素和酶的组织定位,（一）时间分辨荧光免疫试验,二、其他荧光免疫试验,1.内分泌学中的应用2.肿瘤学中的应用3.免疫学中的应用4.分子生物学的应用5.微生物学中的应用,（二）荧光偏振免疫试验,第六节、影响荧光免疫试验的主要因素,一、荧光素-抗体结合物二、待检标本三、其他
11、,荧光素-抗体结合物的结合比率：F/P=,一、荧光素-抗体结合物,抗体效价：双向免疫扩散试验,抗体纯度：高亲和力、单克隆抗体抗体特异性：吸收试验、抑制试验,荧光素与蛋白质结合的比率（F/P）-荧光素结合到抗体蛋白上的量是标记抗体质量鉴定的重要指标F/P值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多,组织标本：冷冻切片、石蜡切片和印片细胞标本：涂片、爬片 细菌标本：涂片、爬片,二、待检标本,（一）反应时间和温度时间：10min30min（二）荧光抗体的保存-20：保存2-3年真空干燥：长期保存,三、其他,间接免疫荧光试验,其他荧光免疫试验,荧光免疫技术,时间分辨荧光免疫测定,荧光偏振免疫测定,小 结,1 荧光效率是（）A 荧光素产生荧光的强度B 荧光素将吸收的光能转变为荧光的百分率C 物质产生荧光的效率D 特异性荧光和非特异性荧光的强度比E 荧光素接受激发光后，产生的荧光色调2 最早出现的免疫标记试验是（）A 放免 B 荧免 C 酶免 D 化学发光免疫 E 胶体金免疫,
