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1、溶血性贫血的实验室检查,什么叫溶血性贫血？hemolytic anemia-指各种原因导致红细胞生存时间缩短、破坏增多或加速，骨髓代偿造血功能不足时所发生的一类贫血。什么叫溶血性疾病？指骨髓代偿能力尚足以补偿红细胞的损耗而不出现贫血。,溶血性贫血的分类(病因和发病机制),1、RBC内在缺陷所致的溶贫（1）RBC膜缺陷：遗传球PNH（2）HB结构异常：海洋性贫血（3）RBC内酶缺陷：G-6PD缺乏症2、RBC外来因素所致的溶贫 AIHA、药物、化学因素、感染因素,溶血性贫血的分类（溶血的场所）,1、血管内溶血：RBC在循环血液中直接破坏，如血型不合输血PNH2、血管外溶血：RBC在脾脏破坏，如球
2、形RBC增多症、脾亢3、原位溶血：幼RBC在骨髓中溶血，如AL、巨幼贫,如何诊断溶血性贫血？,第一步 确定是否有溶血第二步 哪一类溶贫,一、首先确定有无溶血（一）找出RBC破坏增多的依据（1）RBC寿命缩短（2）血片见RBC碎片（3）血浆游离HB增高（血管内溶血）（4）HB尿检测（），酱油色（5）尿含铁血黄素试验（）（6）血清非结合胆红素（间接胆红素）增高（7）尿胆原增高（8）血清结合珠蛋白减低（9）血浆高铁血红素清蛋白检测（）电泳法：区带,Hb代谢示意图,珠蛋白 血红素 铁+卟啉,单核巨噬系统 脾脏,血管外溶血,RBC,血管内溶血,血浆游离Hb,肾脏,血红蛋白尿,游离胆红素,肝脏,结合珠蛋白
3、,近曲小管上皮细胞,肾阈,结合胆红素,粪胆原的肠肝循环,含铁血黄素尿 Rous 实验,胆汁,粪胆原,肠道,血液,肾脏,尿胆原,高铁血红蛋白,清蛋白/血红素蛋白,溶血性贫血筛查,红细胞寿命测定方法：51Cr标记红细胞，检测其半衰期正常红细胞半衰期2532天溶血性贫血者半衰期小于15天确定溶血性贫血的可靠方法,溶血性贫血筛查,血浆游离血红蛋白测定参考值：50mg/L(1-5mg/dl)临床意义：血管内溶血者明显升高AIHA、珠蛋白生成障碍性贫血者轻度升高血管外溶血时正常,溶血性贫血筛查,血清结合珠蛋白测定参考值：0.7-1.5g/L临床意义：各种溶血均可减低，血管内溶血减低最显著肝病、传单、先天性
4、无结合珠蛋白血症减少或消失感染、创伤、糖皮质激素治疗、服用避孕药物、肝外阻塞性黄疸可增高,溶血性贫血筛查,血浆高铁血红素清蛋白测定方法：生化法：与硫化铵形成铵血色原，经光谱仪测定558nm吸收光带电泳法：醋酸纤维膜电泳正常值：阴性临床意义：阳性者表示严重的血管内溶血,溶血性贫血筛查,含铁血黄素尿试验（Rous试验）原理：铁离子+氰化钾 铁氰化铁（蓝色）如肾小管上皮有含铁血黄素，该试验阳性正常值：阴性临床意义：阳性者表示慢性血管内溶血，如PNH,含铁血黄素,（二）显示红细胞代偿增生依据外周血网织红增多；外周血红细胞形态：大小不均，大红细胞、嗜多色细胞及有核红细胞，Howell-Jolly小体、C
5、abot环、点彩红细胞等增生性贫血骨髓象：增生明显活跃，红系显著增生，粒系相对减少，巨核系一般正常,二、哪一类溶血性贫血？,（一）红细胞膜缺陷的检验 红细胞渗透脆性试验 红细胞孵育渗透脆性试验自身溶血试验及纠正试验,1、红细胞渗透脆性试验,原理:正常红细胞为双凹圆盘状,在低渗盐水中吸水膨胀的适应性较大(可增加70%的体积而不破裂)遗传性球形细胞增多症等红细胞的表面积/体积(S/V)的比值小,对低渗盐水的适应性小(脆性增大)本试验是测定红细胞在一系列不同浓度低渗氯化钠盐水内开始溶血和完全溶血的氯化钠浓度，检测其对不同浓度的低渗盐水溶血的抵抗力。,红细胞渗透脆性试验（erythrocyte osm
6、otic fragility test)原理：,红细胞皱缩,红细胞膨胀甚至破裂,高渗溶液,等渗溶液,正常,参考值 0.6-0.8%NaCl溶液红细胞不破裂 0.42-0.46%NaCl溶液部分红细胞破裂 0.28-0.34%NaCl溶液红细胞完全破裂,NaCl,0.6%,对低渗溶液抵抗能力减小即RBC渗透脆性增加,临床意义（1）脆性增高 开始溶血及完全溶血时氯化钠浓度较正常对照提前两管，即0.04%以上;开始溶血0.5%，完全溶血0.38%主要见于遗传性球形红细胞增多症（2）脆性减低 小细胞低色素性贫血：海洋性贫血、缺铁性贫血,2、红细胞孵育渗透脆性试验,原理 37孵育24小时，细胞内葡萄糖消
7、耗增加，ATP减少，钠离子泵出减少，细胞膨胀，脆性增高。参考值 未孵育 50%溶血44.45g/LNaCl 孵育 50%溶血4.655.9g/LNaCL 临床意义常用于轻型遗传球、遗传性非球形细胞溶血的诊断 脆性增高 遗传性球形红细胞增多症 脆性减低 缺铁性贫血、珠蛋白生成障碍性贫血、镰形细胞贫血、脾切除术后,3、自身溶血试验及纠正试验,原理 先天性非球形红细胞溶血患者红细胞内酶缺陷，葡萄糖酵解障碍，ATP不足不能维持细胞钠泵作用患者红细胞在自身血浆中孵育48h，溶血增强，可加入葡萄糖、ATP，观察溶血能否被纠正 参考值 正常人孵育后轻微溶血、溶血度3.5%加葡萄糖和加ATP后，溶血明显纠正，
8、溶血度1%,3、自身溶血试验及纠正试验,临床意义常用于遗传球、遗传性非球形细胞溶血的鉴别诊断,（二）红细胞酶缺陷的检验,定义：红细胞酶缺陷所致溶血性贫血又称红细胞酶病，指参与红细胞代谢的酶由于基因缺陷，导致活性改变而发生溶血的一组疾病内容：高铁血红蛋白还原试验氰化物-抗坏血酸试验变性珠蛋白小体生成试验葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验和活性测定丙酮酸激酶荧光筛选试验和活性测定,原理,1、高铁血红蛋白还原试验,G6PD正常,NADPH还原型辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,高铁血红蛋白,亚铁血红蛋白,NADPH充足,G6PD,高铁Hb还原酶,G6P,G6-PA,NADP,NADPH,还原型美兰,氧化
9、型美兰,高铁Hb（Fe3+）为褐色,氧合HB（Fe2+）红色,结果：光电比色法，正常还原率75%，低于75%为异常，提示G6PD活力，74 31%为G-6PD缺乏的杂合子（红棕色），30%以下为显著缺陷的纯合子（为棕色 目测比色法）。,参考值高铁血红蛋白还原率75%高铁血红蛋白0.31.3g/L临床意义G6PD缺陷导致高铁血红蛋白还原率下降见于蚕豆病、伯氨喹型药物溶血性贫血,1、高铁血红蛋白还原试验,原理:6-磷酸葡萄糖 NADP GSH H202 氧合血红蛋白 6-磷酸葡萄糖酸 NADPH GSSG H20 高铁血红蛋白结果:正常人标本呈红色,G-6PD,2、氰化物-抗坏血酸试验,临床意义:
10、正常血液数小时后变成暗色纯合子G6PD缺乏者2h变色杂合子G6PD缺乏者34h变色,3、变性珠蛋白小体生成试验,又称“红细胞包涵体”、“赫恩小体”、“Heinz小体”、“海因小体”原理：G-6PD缺乏致红细胞内GSH减少，高铁血红蛋白增高，形成变性珠蛋白小体，沉着于红细胞膜上。,抗凝血+乙酰苯肼,37温育24h,充分的氧化,其Hb氧化成Heinz小体（用结晶紫、甲紫或煌焦油兰染色，油镜观察）,1.正常人 30%2.G6PD缺陷症、不稳定Hb、HbH病等常高于45%,结果：该小体为圆形或多角形色涵体，0.22um。多位于红细胞边缘，一个红细胞含120个，多为12个，以含5个以上小体的红细胞计数,
11、4、G6PD荧光斑点试验和活性测定原理:G6PD 使NADP还原成NADPH,后者在紫外线照射下发出荧光 参考值：正常人强荧光；酶活性 5 U/gHb,5、丙酮酸激酶荧光筛选试验和活性测定原理:,ADP+PK 磷酸丙酮酸 丙酮酸 NAPH 乳酸 NAD（无荧光）,参考值正常PK活性荧光在20min内消失酶活性15.14.99U/gHb临床意义PK严重缺乏（纯合子）荧光60min不消失杂合子荧光2560min消失,(三)、珠蛋白合成异常的检测,血红蛋白的结构 原卟啉 血红素Hb（四聚体）铁 2条链 珠蛋白：由4条多肽链组成 2条非链,正常人 HbA（22）97%HbA2（22）1.5-3%HbF
12、（2 2）0.5-0.8%,血红蛋白病珠蛋白肽链量的不正常(地中海贫血)血红蛋白分子结构异常(异常血红蛋白病)遗传性溶血性疾病,1.血红蛋白电泳,蛋白质的两性性质是由氨基酸的NH+与COO-决定的。等电点调节水溶液的pH，能使蛋白质的NH+与COO-数目相等呈电中性，此时蛋白质无电泳，在水中电解度小，并发生沉淀。,电泳：一个带电荷的离子或胶体颗粒在电场中可向一极移动。,原理：在一定的pH缓冲液中，缓冲液的pH大于Hb等电点，其带负电，在电场中向阳极移动；反之向阴极移动。由于各种Hb珠蛋白肽链结构不同，其等电点不同，电泳方向和速度亦不同，故可分离出不同的区带，对区带进行电泳扫描，可进行Hb定量分
13、析。,(+)H J K A G D E(-)1.HbH增多是HbH病，为-地中海贫血的一种；HbA2明显增高见于轻型地中海贫血；HbF 明显增高见于中重型地中海贫血。2.正常值：醋纤法（PH8.6）HbA 96%98%，HbA2 1.0%3.1%，HbF2%,电 泳 结 果,CA,A2,F,A,异常,正常,2.胎儿蛋白HbF（2 2）酸洗脱试验：含HbF红细胞着色原理：HbF抗酸力强临床意义：脐带血、新生儿、婴儿阳性成人小于1%地中海贫血轻者少数红细胞阳性地中海贫血重症阳性细胞增多,3.HbF定量测定（碱变性试验）:原理：碱性溶液中HbF不易变性沉淀，可测定滤液中Hb量临床意义：2岁-成人 H
14、bF4%为异常重型 地贫80-90%AL、AA、淋巴瘤等可轻度升高,4.HbA2定量测定 诊断轻型地贫的重要依据5.限制性内切酶谱分析 基因诊断,(四)、自身免疫性溶血性贫血检测,自身免疫性溶血性贫血（autoimmune hemolytic anemia,AIHA),定义：体内免疫异常，产生自身抗体、补体，结合在红细胞膜上使红细胞破坏加速病因：尚未完全阐明，可能因素：病毒感染可激活多克隆B细胞或化学物与红细胞膜相结合，改变其抗原性，导致自身抗体产生分类：可为原发性的，也可继发于结缔组织病、造血系统肿瘤、感染等 按抗体反应最适温度分为温抗体型和冷抗体型，后者又分为冷凝集素综合征和阵发性冷性血红
15、蛋白尿,1.Coombs试验（抗人球蛋白试验）,原理：不完全抗体(IgG)，无法架接两个邻近的红细胞，而只能和一个红细胞抗原相结合。抗人球蛋白抗体是完全抗体,可与多个不完全抗体的Fc段相结合,导致红细胞凝集现象,称为抗人球蛋白试验阳性。,目的：检查红细胞表面的或血清中游离的不完全 抗体，用于诊断AIHA。,直接Coombs Test(+)说明病人RBC表面上包被有不完全抗体,间接Coombs Test(+)则说明病人血清中存在着不完全抗体,Coombs血清（抗人球蛋白血清）,（1）直接试验,正常人：阴性直接反应阳性，最常见于AIHA（其他有药物诱发的溶贫、阵发性冷性Hb尿、新生儿同种免疫溶血病
16、、SLE、类风湿关节炎、恶性淋巴瘤等）。,目的：测定吸附于红细胞表面的不完全抗体,方法：,结果：,（2）间接试验,有过剩抗体时直接、间接均为阳性。AIHA分三型：C3型12%，IgG型24%，IgG+C3型60%。冷凝集素病为IgM抗体。,目的：测定血清中游离的不完全抗体,方法：,结果：,间接阳性，见于AIHA，正常人为阴性。,病人血清,正常RBC,抗 IgG,2.冷凝集素试验,原理冷凝激素是可逆性抗体：低温时可与自身红细胞、O型红细胞、患者同型红细胞发生凝集，温度升高时，凝集块又复消失参考值效价低于1:40，反应最高温度4临床意义某些AIHA很高,3.冷热双相溶血试验原理：阵发性寒冷性血红蛋
17、白尿症（PCH）患者的血清中有双相溶血素，在0-4C时，溶血素与红细胞结合，并吸附补体，但不溶血；当升温至30-37C则发生溶血参考值：阴性临床意义：阳性见于阵发性寒冷性血红蛋白尿患者,（五）、阵发性睡眠性血红蛋白尿paroxysmal noturnal hemoglobinuria,PNH为获得性红细胞膜缺陷引起的慢性血管内溶血常在睡眠时加重也可伴有发作性睡眠性血红蛋白尿和全血细胞减少,1、酸溶血试验(Ham试验)原理：PNH患者红细胞膜对补体敏感,在酸性(pH6.46.5)条件下,能被正常人新鲜血清(含补体)所溶解,产生酸溶血现象。,临床意义：正常人阴性阵发性睡眠性血红蛋白尿阳性（PNH），此试验可作为PNH的确诊试验。,2.蔗糖溶血试验（sucrose hemolysis test)原理：蔗糖溶液加强补体与红细胞结合，使蔗糖进入红细胞，导致溶血增强临床意义：敏感性最高，特异性差是PNH的筛选试验阴性常可排除PNH，阳性需再做Ham 试验。阳性率90-91%。,3.蛇毒因子溶血试验原理：蛇毒因子直接激活补体C3，旁路途径激活补体系统，攻击PNH病人红细胞临床意义：是特异性PNH试验，敏感性优于Ham试验,常用的溶血性贫血病因实验检查项目,The End,
