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1、MTT检测细胞活性的操作方法一、MTT是什么MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-（4,5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3,5-di-phenytetrazoliumromide,汉语化学名为 3-（4， 5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四 氮唑漠盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。二、MTT法用来做什么简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT主要有两个用途1. 药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定;2. 细胞增殖及细胞活性测定。三、为何MTT可以用来做上述工作检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不
2、溶性的蓝紫色 结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚飒（DMSO）能溶解 细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结 晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值OD值），来判断活细胞数量，OD值越 大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。四、实验所需材料1. MTT溶液的配制通常MTT配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。的包装昌0mg这样的小次性、在50ml离心管（没有的话，S装入.1对平TTg勺，个人建20mlP入20ml PBS，从中先H的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离
3、心管，然中的MTT不残留于，分装避光（避光袋或是黑。将MTT完全混匀后，包住）用天版法：500-1000ul 混匀。可以重复 m滤膜过滤以除 度。按细胞培去溶液养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。1.2对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。注意事项：1. 在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感MTT 一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内（个人曾做过4度避光保存4周 的MTT溶液，效果仍然不错）有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期
4、保存，避免反复冻 融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色 时就绝对不能再用。MTT有致癌性，用的时候小心，有条件最好带那种透明的簿膜手套.2. MTT甲瓒溶解液2.1二甲基亚飒DMSO,可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体 毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳 定。2.2三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml用双蒸水溶解配成100ml溶液， 该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，
5、将SDS结晶全部溶解后再使用。五、MTT法实验步骤1.胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10X 104/mlo对于初学者而言，要使细胞达到5-10X104/ml往往不知从何处着手，我在这里向大家提 供一个简单的方法以初步确定细胞数量。以一般细胞培养常用的625px2为例，1）细胞密度在长到约80%90% （下图所示为80%90%密度时细胞的大致状态），消化 离心收集后，将上清去掉，加入3ml培养基使其混匀。2）另取一支新的15ml无菌离心管（为下一步接种96孔板用），装入约9ml培养基.3）从第一步准备的3ml细胞悬液中取1ml,加入上管，混匀后细胞计数
6、，此时一般为或 小于5-10X104/ml，该浓度相当于细胞计数板4个大格内每大格平均5-10个细胞（见下图）; 如果不够该浓度，再根据计数的结果滴加细胞悬液，每滴按50ul计算。4）细胞数量因实验目的不同应做相应调整，如一般细胞增殖实验每孔2000个就可以（相 当于细胞悬液密度为2X104/ml），细胞毒性实验每孔500010000个（相当于细胞悬液密度为5X104/ml）o此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。比如: 生长较快的细胞密度可略小。2.将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100ul,这样待测细胞的密度为5000 10000/孔 （边缘孔用无菌PBS填充）。混
7、匀后欠，以确保接因难以反83.将接种好的培养板放入培养6加6至关重多次M孔之1）,加 常在前 议设6个，否则勺药物，原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常上午加药.一般5-7个梯度，每孔100ul，设3-5个复孔.、” 人。下图可做为96孔板的的参考步局。 1对于加药，有人直接将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。但本人认为应尽量在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉（可以用排 枪吸走）再加入100ul含不同浓度药物的培养基，这样能保证药物浓度的准确。另外，需注 意的是，如果用这种方法，不要把96孔板的培养液全部吸走后再加药，应该吸完一部
8、分后 立即加样，避免由于96孔板干燥引起细胞死亡。4.5%CO2, 37孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。下图为一典型的 药物梯度为细胞的毒性作用。5. 每孔加入10ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能 够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。6. 终止培养，准备溶解结晶。溶解结晶的方法有两种，第一种，用DMSO溶解1）MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把Formazan 结晶移走。有人直接用移液器将上清移走，也有人建议先铺几张滤纸在桌面，然后将96孔 板轻轻倒
9、置，这样上清便被滤纸吸走，以减少结果的损失。个人认为，这两种方法都有可能 导致结晶的损失，从而引起结果的不准确。采用哪种方法，可以自己摸索一下再决定。2）每孔加入150ul二甲基亚飒，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联 免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。另一种方法，用三联溶解液（见上面MTT甲瓒溶解液）1）MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。这种方法细胞上清可以不用去掉，直接在每 孔加入100ul溶解液。（该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之 前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。）2）放入培养箱中继续孵育46小时，镜下观
10、察，待结晶全部溶解后570nm测吸光度。 通常37r孵育4小时左右，紫色结晶会全部溶解。如果紫色结晶较小较少，溶解的时间会 短一些。如果紫色结晶较大较多，溶解的时间会长一些。在实际的操作过程中，往往为了等待46小时，使得实验者在下班以后或者晚上来测 OD值，给实验者带来了很大的不方便。个人曾经摸索，加入溶解液后过夜再测对OD值基 本无影响，但要注意的是一定要避光，不过培养箱关闭后本身就是闭光的，所以加入溶解液 后放入培养箱中，第二天上班时再测OD值就可以了。7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚飒），对照孔（细胞、相同浓度的药物 溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚飒）。六、MTT结果分析关于如何计算IC501、改良寇式法:lgIC50=Xm-I（P-（3-Pm-Pn）/4）Xm:lg最大剂量I:lg（最大剂量/相临剂量）P:阳性反应率之和Pm:最大阳性反应率
