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1、第六章,酶工程制药,酶工程是酶学和工程学相互渗透结合发展而形成的一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。,一、酶工程简介,二、酶的来源,大多数生物都是有用酶的来源，但只有有限数量的植物和动物是经济的酶源，多数酶是从微生物获得的。植物和动物来源的酶一般是食品工业的重要用酶。,1.植物来源的酶 木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、麦芽淀粉水解酶、大豆脂肪氧合酶等。,2.动物酶来源的酶 猪胰蛋白酶和胃脂肪酶等。,3.微生物来源的酶 微生物是酶制剂的重要来源，这是因为微生物具备如下优势：微生物繁殖速度快 细菌在合适的条件下20
2、30 min就可以繁殖一代，其生长速度为农作物的500倍，为家畜的l 000倍。,3.微生物来源的酶 微生物种类繁多，酶的品种全 在不同环境下生存的微生物有不同的代谢途径，可以产生适应不同环境的酶分子，如高温酶、中温酶和低温酶，耐高盐酶，耐酸、碱酶等。微生物培养方法简单 微生物培养所用的原料大多为农副产品，来源丰富，机械化程度高，易于大批量生产。连续发酵生产可以提供经济有效的酶制剂产品。,3.微生物来源的酶 利用微生物可以生产一些极端酶 由于酶在应用过程中常出现不稳定现象，尤其在高温、强酸、强碱和高渗等极端条件下更易失活，因此限制了酶在工业上的应用。利用嗜极菌生产的极端酶可克服这一缺陷。第一个
3、极端酶嗜热DNA聚合酶已成功地应用于PCR技术。,三、酶在医药领域的应用,在疾病诊断方面的应用在疾病治疗方面的应用在药物生产方面的应用在分析检测方面的应用,酶在医药领域的用途很广，随着酶分子修饰和酶固定化等酶技术的发展，将不断扩大酶在医药方面的应用。,1.在疾病诊断方面的应用,酶学诊断方法是可靠、简便又快捷的诊断方法。包括两个方面：（1）根据体内原有酶活力的变化来诊断某些疾病；（2）利用酶来测定体内某些物质的含量，从而诊断某些疾病。（1）根据体液内酶活力变化诊断疾病 一般健康人体液内所含有的某些酶的量是恒定在某一范围的，若出现某些疾病，则体液内的某种或某些酶的活力将会发生相应的变化。故此，可以
4、根据体液内某些酶的活力变化情况，而诊断出某些疾病。,血清酶对某些疾病的诊断,酶具有专一性强、催化效率高等特点，可以利用酶来测定体液中某些物质的含量，从而诊断某些疾病。例如：利用尿酸酶测定血液中尿酸的含量，从而诊断痛风病。固定化尿酸酶巳在临床诊断中使用。,（2）用酶测定体液中某些物质的量诊断疾病,2.在疾病治疗方面的应用,酶作为药物可以治疗多种疾病。而且具有疗效显著、副作用小的特点，应用日益广泛。,（1）蛋白酶 可用于治疗多种疾病，是在临床上使用最早，最广的药用酶之一。蛋白酶可作为消化剂，用于治疗消化不良和食欲不振。使用时往往与淀粉酶，脂肪酶等制成复合制剂，以增加疗效。作为消化剂使用时，蛋白酶一
5、般制成片剂，以口服方式给药。,蛋白酶可作为消炎剂，治疗各种炎症有很好的疗效。蛋白酶之所以有消炎作用，是由于它能分解一些蛋白质和多肽，使炎症部位的坏死组织溶解，增加组织的通透性，抑制浮肿，促进病灶附近组织积液的排出并抑制肉芽的形成。给药方式可以口服、局部外敷或肌肉注射等。,蛋白酶经静脉注射，可治疗高血压。这是由于蛋白酶催化运动迟缓素原及胰血管舒张素原水解部分肽段而生成运动迟缓素和胰血管舒张素，使血压下降。蛋白酶注射入人体后，可能引起抗原反应。通过酶分子修饰技术，可使抗原性降低或消除。另外，蛋白酶在使用时还可能产生某些局部过敏反应，要引起注意。目前临床上使用的蛋白酶大部分来自动物和植物，如胃蛋白酶
6、和菠萝蛋白酶等,（2）溶菌酶 溶菌酶也是一种应用广泛的药用酶，具有抗菌、消炎、镇痛等作用。溶菌酶作用于细菌的细胞壁，可使病原菌，腐败性细菌等溶解死灭，对抗生素有耐药性的细菌同样起溶菌作用，具有显著疗效而对人体的副作用很小，是一种较为理想的药用酶。溶菌酶与抗生素联合使用，可显著提高抗生素的疗效。,（3）用酶制造各种药物,酶在药物制造方面的应用是利用酶的催化作用将前体物质转变为药物。现已有不少药物包括一些贵重药物都是由酶法生产的。例如：,用青霉素酰化酶合成各种新型的内酰胺抗生素，包括青霉素和头孢霉素；用酪氨酸酶生产多巴(DOPA)；用蛋白酶生产各种氨基酸和蛋白质水解液；用核糖核酸酶生产核苷酸类物质
7、；用核苷磷酸化酶生产阿拉伯糖腺嘌呤核苷(阿糖腺苷)；用多核苷酸磷酸化酶生产聚肌苷酸聚胞苷酸(聚肌胞)；用蛋白酶和羧肽酶将猪胰岛素转化为人胰岛素。,（4）酶在分析检测方面的应用,利用酶催化作用的高度专一性对物质进行检测，巳成为物质分析检测的重要手段。,单酶反应检测多酶偶联反应检测酶标记免疫反应检测,单酶反应检测,L谷氨酸脱羧酶 L-谷氨酸脱羧酶专一地催化L-谷氨酸脱羧生成-氨基丁酸和二氧化碳，生成的CO2可以用气体检测法测定。该酶巳广泛地用于L-谷氨酸的定量分析。可使用游离酶、固定化酶或酶电极。检测CO2可以用华勃氏呼吸仪或CO2电极等。,利用单一种酶与底物反应，然后用各种方法测出反应前后物质的
8、变化，从而确定底物的量。这是最简单的酶法检测技术。使用的酶可以是游离酶，也可以是固定化酶或单酶电极等。,脲酶 脲酶能专一地催化尿素水解生成氨和CO2。通过气体检测或者使用氨电极、CO2电极、NH4+电极等，测出氨或CO2的量，就可确定尿素的量。葡萄糖氧化酶 该酶催化葡萄糖与氧反应生成葡萄糖酸和H2O2。通过测定酸的生成或氧的减少来确定葡萄糖的量，也可用pH电极、氧电极等测出葡萄糖的量。该酶巳广泛用于食品，发酵工业和临床诊断等方面。,多酶偶联反应检测,多酶偶联反应检测是利用两种或两种以上的酶的联合作用，使底物通过两步或多步反应，转化为易于检测的产物，从而测定被测物质的量。多酶偶联反应检测可克服单
9、酶检测易出现的其他物质干扰，或检测的灵敏度不高等缺点，使酶法检测易于进行并达到较理想的结果。,葡萄糖氧化酶与过氧化物酶偶联,通过这两种酶的联合作用以检测葡萄糖的含量。使用时先将葡萄糖氧化酶，过氧化物酶与还原型邻联甲苯胺一起用明胶共固定在滤纸条上制成酶试纸。测试时将酶试纸与样品溶液接触，在1060s的时间内试纸即显色。从颜色的深浅判定样品液中葡萄糖的含量。,葡萄糖氧化酶催化葡萄糖与氧反应生成葡萄糖酸和H2O2，生成的H2O2在过氧化物酶的作用下分解为水和原子氧，新生态的原子氧将无色的还原型邻联苯甲胺氧化成蓝色物质。颜色的深浅与样品中葡萄糖浓度成正比。随着样品中葡萄糖浓度的增加，酶试纸的颜色由粉红
10、一紫红一紫色一蓝色，不断加深。其反应过程如下：,此酶试纸已在临床中用以测定血液或尿液中的葡萄糖含量，以诊断糖尿病。,酶偶联法检测葡萄糖原理：,酶标记免疫反应检测,用于测定样品液中抗体或抗原含量的技术。先将适宜的酶与抗原或抗体结合在一起。若要测定样品中抗原含量，就将酶与欲测定抗原的对应抗体结合，制成酶标抗体，反之，若要测定抗体，则需先制成酶标抗原。然后其与样品液中待测抗原（或抗体）通过免疫反应结合在一起，形成酶抗体抗原复合物，测定复合物中酶的含量就可得出欲测抗原或抗体的量。常用于酶标免疫测定的酶有碱性磷酸酶和过氧化氢酶等。,碱性磷酸酶 将碱性磷酸酶与抗体(或抗原)结合，制成碱性磷酸酶标记抗体(或
11、碱性磷酸酶标记抗原)。该酶标记抗体(或酶标抗原)与样品液中的对应抗原(或抗体)，通过免疫反应结合成碱性磷酸酶抗体抗原复合物。将该复合物与硝基酚磷酸(NPP)反应。碱性磷酸酶催化NPP水解生成硝基酚和磷酸。硝基酚呈黄色，黄色的深浅与碱性磷酸酶的含量呈正比。故此，通过分光光度计测定420nm波长下的光吸收率，就可测出复合物中碱性磷酸酶的量，从而计算出欲测抗原(或抗体)的含量。,酶标免疫测定技术还可以应用于某些具有亲和力的生物分子对之间的测定。如用酶标抗胰岛素蛋白测定胰岛素的含量，酶标抗生物素蛋白测定生物素含量等。这类检测的原理与酶标免疫测定相类似，但由于不是抗体抗原间的免疫结合，只是分子对之间的亲
12、和结合，故称为酶标亲和检测。,第二节 酶和细胞的固定化,指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。,一、固定化酶的制备,固定化酶的定义,固定化酶的特点 具有生物催化剂的功能，又有固相催化剂的功能。可多次使用反应后，酶底物产物易分开，产物中无残留酶，易纯化，产品质量高。反应条件易控制。酶的利用效率高。比水溶性酶更适合于多酶反应。,酶和细胞固定化方法 载体结合法 交联法 包埋法 网格型 微囊型物理吸附法 离子结合法 共价结合法 热处理（细胞）,酶的固定化方法与制备技术,酶和细胞固定化模式,酶和细胞的固定化载体
13、,（1）吸附载体（2）包埋载体（3）交联载体,固定化酶制备技术（1）吸附法制备固定化酶技术（2）包埋法制备固定化酶技术 界面沉降法 界面聚合法（3）交联法制备固定化酶技术（4）共价结合法制备固定化酶技术,固定化细胞的定义 将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。,二、固定化细胞的制备,固定化细胞的特点,抗污染能力强。,固定化细胞的制备技术 载体结合法 是将细胞悬液直接与水不溶性的载体相结合的固定化方法。包埋法 将细胞定位于凝胶网格内的技术。交联法 用多功能试剂对细胞进行交联的固定化方法。无载体法 靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞
14、的技术。,固定化方法的选择固定化酶应用的安全性固定化酶在操作中的稳定性固定化的成本载体的选择书227页表62,三、固定化方法与载体的选择依据,固定化酶的形状颗粒状固定化酶纤维状固定化酶膜状固定化酶管状固定化酶,四、固定化酶的形状与性质,固定化酶的性质酶活力的变化酶稳定性的变化 操作稳定性 贮藏稳定性 热稳定性 对蛋白酶的稳定性,酶学特性的变化 底物专一性 最适pH 最适温度 米氏常数 最大反应速度,第三节 固定化酶和固定化细胞反应器,一、反应器的类型和特点,特点：连续进料、连续出料。,特点：反应后随即放料。,特点：底物以恒定流速通 过反应床。,循环反应器 部分反应液流出和新加入底物流入液混合，
15、在进入反应床进行循环。,加正压在膜两边产生压差的方法 产生负压,膜式酶反应器,原理 加压膜技术在酶反应器中的应用。与一般过滤一样，主要依赖于被分离物质分子量的大小、形状和性质不同，在一定的压力差（外源N2或真空泵压）下，使小分子能够通过具有一定孔径的特制薄膜，限额以上的大分子被膜阻留，使不同大小的分子得以分离。,类型,反渗透 操作压达5002000磅/英寸2，膜的平均孔径最小，一般为10-3 m以下，用于分离小分子溶质。超滤 操作压为5100磅/英寸2，膜的平均孔径为10-3m10-2m，用于分离较大分子溶质。微孔过滤 操作压5磅/英寸2，膜的平均孔径为0.05m14m，用于分离大颗粒。,膜式
16、酶反应器,超滤(A)与反渗透(B)示意图,超滤(A)与微孔过滤(B)示意图,膜式酶反应器,各种反应器的示意图,根据固定化酶的形状来选择 根据底物的物理性质来选择 根据反应的动力学特性来选择 根据外界环境对酶的稳定性的影响来选择 根据操作要求及反应器费用来选择,二、反应器的选择依据,第四节 酶的化学修饰,细胞外稳定性差 经不起温度、酸碱、有机溶剂及时间的考验，易变性失活。酶活性不够高具有抗原性 作为异体蛋白在体内难于吸收、易引起免疫反应和被识别降解。,限制酶大规模应用的原因,通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共价结构发生改变称为酶的化学修饰。只要选择合适的修饰剂和修饰条件，在保持酶活性的基础上，
17、能够在较大范围内改变酶的性质，创造天然酶所不具备的优良特性，甚至创造出新的活性。,1.概念,一、酶化学修饰概述,2.酶化学修饰的目的,人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围。提高酶的生物活性（酶活力）。增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）产生新的催化能力,1.酶的表面化学修饰（1）大分子修饰（大分子结合修饰）利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。是目前应用最广的酶分子修饰方法。修饰剂：聚乙二醇、右旋糖酐、肝素、蔗糖聚合物等。,二、酶化学修饰的方法,应用：如：PEG超氧化物歧化酶（SOD）PE
18、G溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等）PEG天门冬酰胺酶（ASNase）消除了抗原性 延长了酶在体内的半衰期又如：用右旋糖酐修饰-淀粉酶，淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶，提高了酶的热稳定性。,（2）小分子修饰（酶蛋白侧链基团修饰）,通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。,（3）交联修饰（交联法）用双功能基团试剂(如戊二醛)，与酶分子内不同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加稳定。,（4）固定化修饰（共价偶联法）通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生改变，使酶的最适pH、最适温度和稳定性发生改变。,2.酶分子内部修饰（1）非催化
19、活性基团的修饰 经常被修饰的残基可以是亲核的(Ser、Cys、Met、Thr、Lys、His)，也可以是亲电的(Tyr、Trp)。对这类非催化残基的修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力。,（2）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）蛋白主链修饰采用酶法（用专一性较强的蛋白酶或肽酶为修饰剂）。例如：用蛋白酶对ATP酶有限水解，切除其十几个残基后，酶活力提高了5.5倍。,通过选择性修饰侧链成分来实现氨基酸的取代，这种将一种氨基酸侧链转化为另一种新的氨基酸侧链的方法叫化学突变法。,（3）催化活性基团的修饰,如果辅因子与酶是非共价结合的，则可将辅因子共价结合于酶分子上。引入新的具有强反应的辅
20、因子金属酶的金属取代 酶分子中的金属离子取代可以改变酶的专一性、稳定性及其抑制作用。,（4）与辅因子相关的修饰,（5）肽链伸展后的修饰,为了有效地修饰酶分子内部的区域，可以先用脲、盐酸胍处理酶，使其肽链充分伸展，为修饰酶分于内部疏水基团提供可能性。然后，让修饰后伸展肽链在适当条件下，重新折叠成具有某种催化活性的构象。至今，尚未有成功的先例。,三、修饰酶的特性,热稳定性提高抗原性消除对各类失活因子的能力提高体内的半衰期延长最适pH改变酶学性质改变对组织分布能力改变改变,第五节 酶的分子工程,2.人工模拟酶,3.抗体酶,1.固定化酶,根据酶的作用原理，摸拟酶的活性中心和催化机理，用化学方法制备结构
21、较简单、高效、高选择性、稳定性能好的新型催化剂,可以是无机化合物、有机化合物或小肽。,人工模拟酶,酶模型是人工合成的一类具有酶的某些属性的有机化合物。虽然它的分子比较小，结构比较简单，但是含有酶所具有的主要活性基团以及与酶的活性中心相似的空间结构，能够模拟酶的某些关键性功能。目前研究得比较多的主要是水解酶和单加氧酶模型。,人工模拟酶-benzyme,环糊精,催化侧链,催化侧链连接到环糊精上，可模拟胰凝乳蛋白酶,-环糊精的分子结构,当模板分子(印迹分子)与聚合物单体接触时会形成多重作用点，通过聚合过程这种作用就会被记忆下来，当模板分子除去后，聚合物中就形成了与模板分子空间构型相匹配的具有多重作用
22、点的空穴，这样的空穴将对模板分子及其类似物具有选择识别特性。,分子印迹技术,分子印迹示意图,抗体酶,抗体酶(abzyme)又称催化抗体(catalytic antibody)一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。它是利用现代生物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。,抗体酶的特性,抗体与酶相似，都是蛋白质分子，酶与底物的结合及抗体与抗原的结合都是高度专一性的，但这两种结合的基本区别在于酶与高能的过渡态分子结合，而抗体则与抗原（基态分子）相结合。利用抗体能与抗原特异结合的原理可用过渡态类似物作为半抗原来诱发抗体，这样产生的抗体便能
23、特异地识别反应过程中真正的过渡分子，从而降低反应的活化能，达到催化反应的目的。,B.酯的羧基碳原子受到亲核攻击形成四面体过渡态,C.设计的磷酸酯类似物,作为抗原去免疫实验动物,磷酸酯类似物(半抗原),对酯水解反应有催化作用的单克隆抗体,免疫,免疫反应,诱导法制备具有酯酶活性的抗体,抗体酶用于肿瘤治疗,目前正在发展一种称为抗体介导前药治疗（ADEPT）技术，即将能水解前药释放出肿瘤细胞毒剂的酶和肿瘤专一性抗体相偶联，这样酶就会通过和肿瘤结合的抗体而存在于细胞的表面。前药(prodrug)是指由具有生物活性的药物经化学修饰后转变为体外无活性的化合物。这种化合物在体内经酶或非酶作用，脱去保护基，释放出母体药物而发挥治疗作用。,静脉给药后，当药物扩散至肿瘤细胞的表面或附近，抗体酶就会将前药迅速水解释放出抗肿瘤药物，从而提高肿瘤细胞局部药物浓度，增强对肿瘤的杀伤力，达到提高肿瘤化疗效果的目的。前药只能被抗体酶水解而不能被内源性酶水解，抗原还要尽量减少免疫原性。,抗体酶的研究，为人们提供了一条合理途径去设计适合于市场需要的蛋白质，即人为地设计制作酶。它是酶工程的一个全新领域。构建有别于天然功能酶的新酶类，是酶工程研究的又一前沿领地。,抗体酶应用前景,作 业,p257 思考题：2、3、4、6 术语解释（讲解过的）,
