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1、第六章 分子生物学技术,内容,1、核酸提取与鉴定 2、印迹杂交技术3、聚合酶链反应 4、重组DNA技术 5、转基因技术与基因打靶,核酸提取与鉴定,研究对象：基因组DNA、质粒DNA、总RNA、mRNA等,第一节 核酸提取,总原则：保证核酸一级结构的完整性避免杂质污染,核酸提取的主要步骤：,破碎细胞,提取,纯化,I.材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中,核酸提取过程,一、质粒DNA,质粒(Plasmid)是游离于细菌(及个别真核细胞)染色体DNA之外、能自主复制的遗传物质多数是一种闭环DNA，大小为1-300k
2、b，能够转化细菌，是基因载体提取质粒DNA包括三个基本步骤,1培养细菌和扩增质粒,在培养基中加入抑制剂(例如氯霉素)可以抑制细菌的蛋白质合成，从而抑制细胞分裂，而质粒DNA会继续复制，拷贝数可达3000个，这一过程称为质粒扩增如果要扩增的质粒DNA携带氯霉素抗性基因(CmR)，可以用壮观霉素替代氯霉素,2收获和裂解细菌,机械法:超声波、玻璃珠等（易引起DNA断裂）化学试剂法:十二烷基硫酸钠(SDS)等（单用难以充分裂解）溶菌酶-化学试剂联合法:先用溶菌酶消化，再用化学试剂处理（最常用）,3分离纯化质粒,关键：除去染色体DNA质粒DNA特性：相对较小（仅为染色体DNA的0.1%-2%）闭环（染色
3、体DNA大量断裂并且呈线性结构）提取方法：氯化铯密度梯度分离法、碱裂解法、煮沸裂解法等,（1）氯化铯密度梯度分离法,EB分子可嵌入相邻碱基对之间，使DNA解旋开环DNA或线性DNA存在游离末端易于解旋，可结合大量EB，DNA-EB复合物含EB越多，密度越小闭环质粒DNA没有游离末端，不易解旋，结合少量EB，密度较大在饱和EB条件下，质粒DNA密度比断裂染色体DNA密度大，经氯化铯密度梯度离心，可分离提取质粒DNA,(2)碱裂解法（快速提取质粒DNA，收获率高）,溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl，10mmol/L EDTA，Ph=80)使菌悬浮EDTA整合Mg2
4、+、Ca2+以抑制脱氧核糖核酸酶(DNase)的活性溶液II（200mmol/L NaOH，1%SDS，pH=125)：裂解细菌使蛋白质、染色体DNA和质粒DNA变性溶液III(3mol/L醋酸钾，2mol/L醋酸，pH=48)使变性蛋白质与染色体DNA共沉淀闭环质粒DNA复性，留在上清液中通过离心分离提取,(3)煮沸裂解法,以溶菌酶、Triton裂解细菌，然后以沸水浴加热，不仅促进细菌裂解，还可以使蛋白质和染色体DNA、质粒DNA变性当降低温度时，闭环质粒DNA复性留在上清液中，而染色体DNA保持与细胞膜碎片结合、沉淀，可以通过离心除去在离心上清液中加入有机溶剂(例如异丙醇)便得到质粒DNA
5、粗品沉淀,二、真核生物基因组DNA,液氮冷冻组织材料，将其研成细粉用EDTA(蟹合Ca/Mg，抑制DNase活性)、去污剂(SDS能溶解膜蛋白和膜脂，裂解细胞膜和核膜，使膜脂、蛋白质与DNA分离)和蛋白酶K(丝氨酸蛋白酶，水解由脂肪族、芳香族氨基酸的竣基形成的肽键)共同裂解细胞用苯酚、氯仿/异戊醇等抽提除去蛋白质(氯仿可以除去DNA溶液中微量酚的污染，异戊醇可以防止蛋白质变性操作过程中产生气泡)经乙醇沉淀进一步纯化，可获得100-200kb的DNA片段,三、真核生物RNA,最关键的是抑制RNA酶的活性(RNase无处不在，稳定并且耐高温),提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备,塑料制品：使用灭
6、菌的一次性用品。或用0.1%二乙基焦碳酸盐（DEPC）水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用氯仿处理)玻璃用品：使用前于180的高温下干烤6h以上，或在250下干烤3h以上有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再用3H2O2室温浸泡10min，然后用0.1DEPC水冲洗，晾干,(一)总RNA提取,1、异硫氰酸胍-氯化铯密度梯度分离法利用异硫氰酸胍变性蛋白质，抑制RNase的活性，再进行密度梯度离心，能够获得高纯度的总RNA适合于从冷冻时间长、细胞核不易分离及富含RNase的组织细胞内提取RNA不适合于一般实验室应用（一次提取量有限，操作过程复杂费
7、时，需要进行密度梯度离心）,2、异硫氰酸胍-酚氯仿法,以含4mmol/L异硫氰酸胍与01mmol/L巯基乙醇的溶液裂解细胞在pH=40的条件下用酚/氯仿抽提裂解溶液最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤来制备RNA比1法简便、经济和高效，能同时处理多个标本，且RNA的完整性和纯度都很高,3、氯化锂-尿素法,利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNA酶，氯化锂选择性沉淀RNA缺点：存在DNA污染，氯化锂沉淀RNA会丢失一些小分子RNA，如5sRNA等优点：快速、简便、产量高，尤其适用于大量样品少量组织细胞的RNA提取,4热酚法,将异硫氰酸胍、巯基乙醇和SDS等联合使用，可以快速裂解细胞，解离核蛋白复合
8、物，释放RNA，并有效抑制RNase的活性用苯酚(65)、氯仿等有机溶剂抽提，离心除去蛋白质和DNA，留在水相中的RNA可以用乙醇或异丙醇反复沉淀、纯化该方法操作简便，成本较低，适合于从培养细胞和动物组织中提取RNA,(二)mRNA提取,四、核酸纯度鉴定,（一）核酸浓度检测DNA和RNA在波长260nm处有很高的吸收峰值，用标准样品测得在波长260nm处，A2601时，样品中双链DNA浓度为50 g/ml，单链DNA或RNA浓度为40 g/ml，或相当于20g/ml寡核苷酸DNA(g/l)=A26050稀释倍数/1000RNA（g/l）=A26040稀释倍数/1000,根据A260/A280，
9、A260/A230的比值判断核酸样品的纯度1纯度较高的DNA，A260/A2801.8 18，说明可能含有RNA，或DNA部分降解18，说明可能含有苯酚或蛋白质等2纯度较高的RNA，18，说明可能含有蛋白质等 20，说明可能有RNA降解3纯度较高的核酸，A260/A23020如果比值太小，说明可能含有蛋白质、肽、苯酚或异硫氰酸盐等,（二）核酸纯度检测,第二节 核酸电泳,根据电泳支持介质分：琼脂糖凝胶电泳：多用于鉴定较大核酸片段（0.160kb），特别是分子量测定聚丙烯酰胺凝胶电泳：用于分析RNA或Mr小于1000bp的DNA片段，特别是DNA测序,一、琼脂糖凝胶电泳,考虑因素：1凝胶浓度大的D
10、NA片段要用低浓度的琼脂糖凝胶。2DNA大小迁移率与分子量的对数值呈线性关系3DNA构型(大小相同而构型不同的DNA)质粒DNA存在三种构型(迁移率不一样,IIIIII)I型：闭环DNA(cccDNA)，所含的两股DNA均成环II型：开环DNA(ocDNA)，一股成环，另一股开链III型：线性DNA(LDNA)，两股DNA均开链,用途,可以间接分析DNA样品的含量和分子量：荧光强度与DNA含量成正比(与已知含量和分子量的参照DNA平行电泳)可以分析DNA样品纯度:蛋白质与DNA结合，在加样孔内形成荧光亮点;RNA则在DNA区带前方形成云雾状亮带可以分析RNA:控制变性条件是分析RNA的关键确定
11、RNA在进行变性凝胶电泳过程中是否发生降解：用28S(约4700nt)和18S(约1900nt)两种rRNA作为参照：两条区带的亮度比值应为28S:18S=2:1,large,moderate,small,基因组DNA抽提结果电泳图,总RNA抽提结果电泳图,mRNA,琼脂糖凝胶电泳装置,二、聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成常用的催化聚合方法有两种：化学聚合和光聚合。化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵（AP）以及加速剂四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺
12、催化过硫酸铵产生自由基。凝胶孔径大小由聚合链的长度及交联度所决定,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测核酸非变性电泳聚丙烯酰胺凝胶用于分离纯化双链DNA片段变性聚丙烯酰胺凝胶用于分离和纯化单链DNA片段的。其转载DNA样品量也比琼脂糖凝胶大，分辨力也高于琼脂糖凝胶电泳，相差1bp的DNA片段也能分开，但其操作复杂。,聚丙烯酰胺凝胶,聚丙烯酰胺凝胶制胶装置,第三节 DNA测序,Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学降解法都是用待测序DNA制备四组标识DNA片段，每组片段具有以下特征:5端序列相同，3端序列不同3端所对应的碱基相同，因而分析该组片段的长度可以确定这种碱基在待测序DNA链中的位
13、置一种碱基在待测序DNA链中有多少个，相应片段组所含的DNA片段就有多少种，所以在待测序DNA链中的这种碱基全都可以定位分析四组DNA片段的长度,一、Sanger双脱氧链终止法,二、Maxam-Gilbert化学降解法,三、DNA测序自动化,思考题,1、提取质粒DNA包括哪三个基本步骤？2、如何用紫外吸收法分析核酸浓度和纯度3、核酸电泳的种类（根据电泳支持介质分）及各自特点4、DNA测序的两种基本方法及共同步骤，Sanger双脱氧链终止法的关键试剂,印迹杂交技术,分子生物学常用的分析技术之一,DNA印迹法、RNA印迹法和蛋白质印迹法（免疫印迹法）,第一节 核酸分子杂交,核酸杂交技术是在DNA变
14、性和复性原理的基础上建立起来的一种分子生物学技术,一、变性（denaturation）,在某些理化因素的作用下，维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA双螺旋结构松散，变成单链的过程称为核酸的变性核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，但并不涉及共价键的断裂,DNA解链曲线,DNA变性的本质是氢键的断裂,核酸的变性因素,变性方法热变性、酸碱变性、化学变性剂（乙醇、尿素和甲酰胺）增色效应（hyperchromic effect）由于DNA变性而引起的光吸收增加的现象,使双链DNA解链度达到50%所需的温度称为解链温度(Tm)、变性温度、熔点 DNA的解链温度一般在82-95，与DNA的分子大
15、小和碱基组成、溶液的pH值和离子强度（+）等有关,二、复性,DNA复性：缓慢降温可以使热变性DNA重新形成互补双链结构DNA的最适复性温度通常比解链温度低20-25复性导致DNA的紫外吸收降低，称为减色效应 检测DNA紫外吸收的变化可以分析其变性和复性,不是简单的逆变性过程，受多种因素影响:,DNA浓度越高，两股互补链相遇的可能性就越大，因而复性越快序列简单的DNA(例如重复序列)复性快，序列复杂的DNA(例如单一序列)复性慢，因而可以通过测定复性速度分析DNA序列的复杂性DNA片段越大，寻找完全互补序列的难度就越大，因而复性越慢DNA溶液的离子强度越高，两股互补链重新结合的速度就越快，因而复
16、性越快,三、杂交与核酸分子杂交技术,杂交定义不同来源的、序列互补的单链RNA、DNA，或DNA和RNA，根据碱基互补原则，借助氢键连接为双链分子的过程。核酸杂交类型单链DNA与单链DNA杂交（DNA-DNA）单链DNA与单链RNA杂交（DNA-RNA）单链RNA与单链RNA杂交（RNA-RNA）,核酸分子杂交技术,定义：将已知序列的单链核酸片段进行标记后，再与另一种未知序列的待测核酸样品进行杂交，从中鉴定互补序列，以分析该样品中是否存在特定基因序列、基因序列是否存在变异，或研究目的基因的表达情况探针(Probe)：是带有标记物且序列已知、用于鉴定互补序列的单链核酸片段,根据杂交体系的不同，核酸
17、分子杂交可以分为：,1、液相杂交：待测核酸和标记的探针都游离于溶液中，在一定条件下进行杂交优点：速度快、效率高，操作简便缺点：难以有效避免待测核酸的复性 杂交之后也不易将未杂交的多余探针完全除去，误差较大2、固相杂交：将待测核酸先固定在固相支持物上，然后与溶液中的游离探针进行杂交，形成的杂交体结合在固相支持物上优点：既可以避免待测核酸的复性，又可以通过漂洗除去末杂交的多余探针，而且结合在固相支持物上的杂交体的检测也很方便印迹杂交技术中的核酸分子杂交就是以固相杂交为基础的,第二节 探针与标记,合适的探针具备以下条件:具有高度特异性，只与待测核酸杂交。因此，通常首选编码序列制备探针为单链核酸，用双
18、链核酸制备的探针使用前要先变性解链带有标记物，标记物灵敏度高而稳定，检测方便,一、探针种类,1基因组DNA探针（最常用的DNA探针）多为某一基因的全部序列或部分序列2RNA探针杂交效率高、稳定性高、敏感性和均一性强非特异性杂交较少、低本底 3cDNA探针 不含内含子等非编码序列，特异性高，研究基因表达不易制备4寡核苷酸探针 根据已知核酸序列人工合成的DNA探针;分析点突变5锁式探针 一种特别设计的DNA探针，中间为连接序列6实时定量PCR探针,二、探针标记物,(一)放射性同位素标记物(32P、2H和32S)极高的灵敏度和特异性放射性污染,半衰期短,昂贵(二)非放射性标记物(生物素、地高辛和荧光
19、素等)实验周期短;稳定性好,标记探针可以长时间存放备用;无放射性污染灵敏度和特异性有时不理想,三、探针标记法,1、体内标记：将放射性化合物加入培养基，由细胞吸收之后经过合成代谢掺入新合成的核酸分子2、体外标记（最常用）：化学法和酶促法化学法：利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的基团进行交联，将标记物直接结合到探针分子上。简便快速、标记均匀酶促法：先用标记物标记核苷酸，再通过酶促反应将标记核苷酸掺入探针分子，或将标记基团从核苷酸转移到探针分子,(一)切口平移标记法,(二)随机引物标记法,末端标记法,(三)聚合酶链反应标记法一种标记dNTP和三种普通dNTP为底物，短链探针(四)末端标记法T4
20、多核苷酸激酶、末端转移酶、Klenow片段和T4 DNA聚合酶,四、探针纯化,1乙醇沉淀法 DNA片段可以被无水乙醇沉淀操作简便，首选方法2凝胶过滤法 利用凝胶的分子筛特性凝胶填料是Sephadex G-50和Bio-Gel P-60,第三节 固相支持物与印迹,一、固相支持物：硝酸纤维素膜、尼龙膜、聚偏乙烯二氟(PVDF)膜和活化滤纸1硝酸纤维素膜 结合量大、本底较低、操作简便结合力不强，碱性、真空烘烤破裂变脆2尼龙膜 韧性较强，不易破裂中性尼龙膜和正电荷修饰尼龙膜,二、印迹方法,第四节 常用核酸印迹杂交技术,常用的核酸分子杂交技术多为固相杂交根据操作方法的不同分为印迹杂交：将凝胶电泳的高分辨
21、率与核酸分子杂交的高灵敏度相结合，包括DNA印迹法和RNA印迹法等原位杂交：包括组织原位杂交法及菌落杂交法、噬菌斑杂交法等,核酸分子杂交（固相杂交）操作程序,制备待测核酸样品,分离、变性、转移、固化DNA片段,杂交,加入标记核酸探针,检测杂交信号,标记核酸探针,预杂交,制备核酸探针,漂洗去除未参与杂交的标记探针,一、DNA印迹法,1.样品制备；2.电泳分离；3.变性；4印迹；5固定；6预杂交；7.杂交；8洗膜；9分析,放射自显影照片,二、RNA印迹法,RNA印迹法分析的待测核酸是RNA与DNA印迹法基本一致，所不同的是:为了保持RNA呈单链状态进行电泳，以使RNA按分子大小分离，需要先用变性剂
22、将RNA样品完全变性，再电泳分离 RNA样品只能用甲醛、乙二醛、二甲基亚砜(DMSO)等变性，不能用碱变性，因为碱会导致RNA降解。RNA印迹法可以用于定性或定量分析组织细胞内的总RNA或某一特定RNA，特别是分析mRNA的大小和含量，从而研究基因表达。避免RNase污染，包括抑制内源性RNase的活性,三、斑点杂交法和狭缝杂交法,将粗制或纯化的DNA或RNA样品变性之后直接点于固相膜表面，经过固定、预杂交之后与过量探针进行杂交分析印迹:圆斑(dot),短线(slot)用于检测DNA样品的同源性、细胞内特定基因的拷贝数和基因表达情况优点:用样量少，操作简便，不电泳和转移，在同一张固相膜上可以分
23、析多个样品缺点:特异性不高,不能分析样品的分子量,斑点杂交和狭缝杂交,制备样品点样固定（可用斑点杂交仪或直接点样）优点：简便、快速、灵敏、样本用量少缺点：特异性不高，有一定比例的假阳性,四、组织原位杂交(in situ hybridization),把组织切片进行适当处理，增加细胞膜的通透性，然后置于含探针的杂交液中，使探针进入细胞内，与DNA或RNA杂交以cDNA为探针检测与其互补的mRNA在细菌或其他真核细胞中的位置，称为RNA原位杂交，是分析基因表达的常用方法不需提取核酸，保持组织和细胞的形态，分析待测核酸的组织、细胞、亚细胞甚至染色体定位分析特定基因表达情况、病原体的存在部位和方式荧光
24、原位杂交(FISH)是用荧光素标记探针进行的原位杂交灵敏、稳定、安全、直观多色荧光原位杂交可以同时分析多种靶序列,荧光标记探针检测精子,五、菌落杂交和噬菌斑杂交,六、等位基因特异性寡核苷酸杂交(ASOH),ASOH：最早检测已知点突变，目前广泛采用的基因诊断方法关键：设计一对ASO，长度15-20nt，只有一个碱基不同，对应突变位点（正常探针，突变探针）诊断遗传病，例如诊断苯丙酮酸尿症(PKU)，根据某个突变位点(例如Arg243Gln)设计一对探针:,用两种探针分别和待测DNA杂交，显性纯合子只与正常探针杂交，杂合子与正常和突变探针都杂交，隐性纯合子只与突变探针杂交，因此根据杂交结果可以判断
25、待测个体的基因型苯丙酮酸尿症患者基因型是隐性纯合子,第五节 影响杂交的因素,核酸分子杂交的效果取决于杂交的特异性和杂交的效率1核酸分子大（）小和浓度（正相关）发生碰撞才可能杂交2探针种类和浓度：单链探针杂交效率会随着浓度的增加而提高，双链探针与此相反3杂交温度：最适杂交温度(比解链温度低20-25时)；特异性4离子强度和甲酰胺浓度：最适杂交温度5.杂交时间：控制在20小时左右6杂交促进剂:250nt探针杂交用惰性多聚体(硫酸葡聚糖/PEG)7.非特异性杂交：预杂交，即用封闭物（变性的非特异性DNA、高分子化合物）封闭非特异性杂交位点,第六节 蛋白质印迹法,蛋白质印迹法可以用于定性和半定量分析混
26、合物中的蛋白质综合了聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高和固相免疫分析特异性高、灵敏度高等优点,一、基本内容,二、注意事项,1选用合适的聚丙烯酰胺凝胶浓度2印迹时，应选用小孔径的固相膜，以免小分子量蛋白质透过固相膜丢失3蛋白质印迹法检测信号的强弱受多种因素的影响，所以一般只用于半定量分析即测定目的蛋白的相对含量，确定该目的蛋白是否存在，比较其在不同细胞内的含量不同目的蛋白用不同抗体检测时，分析结果没有可比性,三种印迹技术的比较,第七节 生物芯片,定义：也称为生物微阵列，是指通过微电子、微加工技术，用生物大分子(例如核酸、蛋白质)或细胞等在数平方厘米大小的固相介质表面构建的微型分析系统，用以对生物组分进行
27、快速、高效、灵敏的分析与处理种类：基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片、微流控芯片和芯片实验室 固相支持物（基片）：硅芯片、玻璃片、聚丙烯膜和尼龙膜等特点：高通量、集成化、标准化和微型化,一、基因芯片（gene chip）DNA芯片、DNA微阵列、寡核苷酸微阵列,定义:是在固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接将大量DNA探针以点涂的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可得出样品的信号（即基因序列或表达的信息）基本原理依然是基于核酸分子杂交，属于固相杂交不同：探针固相化、集成化并且不标记;而待测样品游离于液相并且被标记,基因芯片发展历史,Southern&Nor
28、thern Blot,Dot Blot,Macroarray,Microarray,(一)基本原理和基本操作,基因芯片技术是以斑点杂交为基础建立的高通量检测DNA的技术基本操作分为四个步骤芯片制作样品制备分子杂交检测分析,1芯片制作,一个复杂而精密的过程，需要专门的仪器(1)原位合成法:光引导原位合成法分子印章法(2)微量点样法:喷墨打印（微孔）接触打印（点样针）,2样品制备待测样品（Cy3）；对照样品（Cy5）3.分子杂交探针含量远多于待测DNA含量（杂交信号强弱与待测DNA含量成正比）优化杂交条件：离子强度、温度、时间4、检测分析以扫描仪对荧光信号进行检测和分析，通过陈列上DNA探针的原始
29、序列将靶DNA的信息反映出来,DNA芯片技术流程,大规模基因芯片的应用,(二)应用,基因芯片技术的主要用途是进行DNA测序和研究基因表达在这两种用途的基础上，基因芯片技术已经应用于基因组研究(包括杂交测序、基因组文库作图、基因表达谱测定、多态性分析和突变检测等)、基因诊断、药物筛选、卫生监督、法医学鉴定和环境检测等,二、蛋白质芯片,基本原理：在保证蛋白质的理化性质和生物活性的前提下，将各种蛋白质有序地固定在基片上制成检测芯片用途：研究生物分子相互作用，包括蛋白质-蛋白质/核酸/脂类/小分子/蛋白激酶相互作用、抗原-抗体相互作用、底物-酶相互作用、受体-配体相互作用等。基础研究、临床诊断、靶点确
30、证、新药开发，特别是检测基因表达(研究功能基因组，寻找和识别疾病相关蛋白，从而发现新的药物靶点，建立新的诊断、评价和预后指标),三、组织芯片,近年来发展起来的以形态学为基础的分子生物学新技术。它是将数十到上千种微小组织切片整齐排列在一张基片上制成的高通量微阵列，可以进行荧光原位杂交(FISH)或免疫组化分析一次可以检测一种基因在多种组织中的表达，是传统的核酸原位杂交或免疫组化分析的集成组织芯片技术使科技工作者有可能同时对数十到上千种正常组织样品、疾病组织样品以及不同发展阶段的疾病组织样品进行一种或多种特定基因及相关表达产物的研究,思考题,1、变性、复性、核酸分子杂交技术、探针、基因芯片2、印迹
31、杂交技术的主要种类及基本操作3、原位杂交的类型4、生物芯片的特点及种类,聚 合 酶 链 反 应,第一节 PCR基本原理,高温变性低温复性适温延伸,高温变性：94左右，目的基因解链为单链，以作为扩增的模板；低温复性：5560，一对特异性引物分别与模板3端互补结合；适温延伸：72，延伸反应；每一循环使DNA分子扩增一倍，n次循环后，理论上DNA分子可扩增为2n。,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,聚合酶链反应的原理,第二节 PCR特点,特异性强灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=
32、10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU，细菌为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，14 小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA,第三节PCR体系组成和反应条件优化,一、体系组成DNA聚合酶引物（Primer）dNTP（原料）目的DNA模板 缓冲液（Buffer）,(一)DNA聚合酶,(二)引物,引物设计原则:1引物长度 15-30nt2引物组成 G/C含量以40%-60%为宜3引物结构 碱基随机分布、二级结构、引物二聚体，3端不应有三个连续的G/C，5端可以修饰4引物特异性 与其他序
33、列的同源性一般70%5引物浓度 非特异性扩增，引物二聚体6引物质量 纯化,3,限制性内切酶的识别序列启动子序列定点突变探针标记,引物设计,引物设计常用软件主要有：Primer Premier 5.0 Oligo 6primer 3The Primer GeneratorNet Primer,(三)dNTP,1应当根据目的DNA的长度和组成确定dNTP的浓度 2四种dNTP要等摩尔浓度配制 3dNTP的质量也与扩增效率有密切关系,(四)模板,DNA或RNA（先逆转录合成cDNA）来源:根据科学研究或临床检验的需要，可以是临床标本(血液、尿液、羊水、分泌物等)、药物标本(动植物细胞、组织等)、法医
34、标本(犯罪现场的血渍、精斑、毛发等)、病原体标本(病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体、立克次体等)、考古标本(骨骸、毛发等)无论何种来源的标本，都应该进行预处理,(五)缓冲溶液,维持DNA聚合酶的活性和稳定性1、pH=722、50mmol/L KCl可以促进引物退火，但浓度过高会抑制酶25mmol/L(NH4)2SO4，SO4对金属离子有一定的结合力。3、小牛血清白蛋白或明胶可以维持酶活性，能保证PCR的稳定性4、甲酰胺或二甲基亚砜有利于松解发夹结构等二级结构，促进引物退火5、Mg2+:影响酶活性及变性解链、引物退火、扩增效率、扩增特异性等,二、条件优化,(一)反应温度和反应时间1变性温度和时间
35、 9530秒或97 15秒2退火温度和时间 退火温度应当低于引物Tm值3-5，通常为50-65，20-40秒钟3延伸温度和时间 TaqDNA聚合酶的最适温度为75-80，72，1min(二)循环次数循环次数决定PCR扩增效率一般控制在30-40次酶活性下降、dNTP浓度下降等，会使反应进入平台期,三、产物分析,(一)电泳分析(二)酶切分析既能对PCR产物进行鉴定，又能对靶基因进行分型(三)杂交分析检测PCR产物特异性，是否存在变异(四)序列分析检测PCR产物特异性最可靠的方法,第四节 常用 PCR技术,一、逆转录PCR(RT-PCR)一步法:逆转录和PCR在同一个反应体系中进行 两步法:逆转录
36、和PCR在两个反应体系中分开进行引物很关键。oligo(dT)引物 特异性引物 随机引物 逆转录PCR可以与DNA印迹法联合，分析扩增产物，从而分析样品中的RNA含量，研究基因表达逆转录PCR灵敏度较低，属于半定量分析,二、实时定量PCR(Q-PCR),对荧光信号的实时检测来跟踪PCR进程，标准曲线定量分析起始模板水平1实时定量PCR探针 特异性荧光探针：荧光报告/淬灭基团 EB或SG作为荧光探针2实时定量PCR应用与逆转录联合可以定量分析mRNA以研究基因表达基础研究与临床诊断 3实时定量PCR特点 PCR高效性、核酸分子杂交特异性、荧光技术高灵敏度和可计量性、TaqDNA聚合酶的外切酶活性
37、封闭条件，没有污染，自动化程度高，多重反应,定量原理,确定初始模板的浓度初始 DNA量越多,荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少（Ct值）Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量,循环阈值（Ct）与初始模板含量,初始模板量越多，C(t)值越小C(t)与初始模板浓度的对数值成线性关系,荧光定量实时PCR与普通PCR的比较,灵敏度高 灵敏的荧光检测较电泳检测灵敏度高特异性高 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性定量准确 全程监控，准确的算法进行定量无需跑胶，自动化程度高,4通道实时荧光定量PCR仪,荧光定量PCR仪是一
38、种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。,荧光定量 PCR仪,三、修饰引物PCR,对特定DNA序列进行定向克隆、定点诱变、体外转录等研究时，需要其末端带有限制位点、突变序列、启动子等DNA元件，为此可以在PCR引物的5端加接这些元件进行扩增，这就是修饰引物PCR例如:在引物5，端加接限制位点，就可以用限制酶切割扩增产物，形成黏端，从而与有互补黏端的载体DNA重组，这就是克隆PCR克隆PCR克隆效率较高，并且如果给两个引物加接不同的限制位点，可以进行定向克隆,四、等位基因特异性PCR,等位基因特异性PCR(AS-PCR)用于检测点突变原理:同时设计一个正常引
39、物对和一个突变引物对下游引物完全一样，上游引物3末端的碱基不同两个PCR体系，各加入一个引物对等位基因特异性PCR用于鉴定单核苷酸多态性(SNP),五、PCR-RFLP,聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术(PCR-RFLP)是PCR技术与RF分析的联合，即先用PCR将包含待测多态性位点的DNA片段扩增出来，然后用识别该位点的限制酶切割，电泳分析其RFLP，判断是否存在突变PCR-RFLP可以极大地提高RFLP分析的灵敏度和特异性，是检测突变的较为简便的方法,六、PCR-单链构象多态性(SSCP),七、随机扩增多态性DNA（RAPD）,八、扩增片段长度多态性（AFLP）,九、长距离PCR
40、(LD-PCR),思考题,1、PCR基本原理2、PCR反应体系及反应条件的优化,重组DNA技术,DNA克隆（重组DNA技术的核心）：从染色体中分离某一DNA片段，与DNA载体连接成重组DNA，导入细胞进行复制，并随细胞分裂而扩增，最终获得该DNA片段的大量拷贝。重组DNA技术(recombinant DNA technology)：也称为基因工程(genetic engineering），是制备DNA克隆所采用的技术和相关工作的统称。,分,切,接,转,筛,表,第一节 工具酶,第二节 载 体,将目的DNA片段连接到一种特定的、可以自我复制的DNA分子上，这种DNA分子就是重组DNA技术的载体(v
41、ector)载体的化学本质是DNA载体不但能与目的DNA重组，导入宿主细胞，还能利用自身的调控元件，使目的DNA在宿主细胞内复制或表达，并据此分为克隆载体和表达载体,常用的载体,以原核细胞为宿主的质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、黏粒载体和细菌人工染色体;以真核细胞为宿主的病毒载体和酵母人工染色体;可以转化不同宿主细胞的穿梭载体,第三节 基本过程,CaCl2法将快速生长期大肠杆菌置于经0预处理的低渗CaCl2溶液中，细胞膨胀，膜通透性改变，易与外源DNA相粘附。将该体系转移到42下做短暂的热刺激，外源DNA就可能被细胞吸收。将经过转化后的细胞置于选择性培养基上，筛选阳性克隆。转化效率可达到51
42、062107个转化子/g超螺旋质粒DNA。,第四节 目的基因表达,一、大肠杆菌表达系统,大肠杆菌表达系统是建立最早、研究最详尽、应用最广泛、发展最成熟的原核细胞表达系统表达真核生物基因，需要考虑因素 目的基因结构 表达载体选择 目的基因表达形式 宿主细胞和诱导条件 蛋白质翻译后修饰 包涵体形成 表达产物稳定性,二、酵母表达系统,酵母表达真核生物基因有其优势应用时考虑因素目的基因结构表达形式及信号肤选择启动子选择目的基因拷贝数诱导条件表达产物稳定性等因素,三、哺乳动物细胞表达系统,最大优点：转录后加工和翻译后修饰系统完善、精确，因而表达产物的结构、性质、活性最接近天然产物缺点：营养要求复杂 培养
43、条件苛刻 生长速度缓慢 污染风险较大,思考题,重组DNA技术基本过程,转基因技术与基因打靶技术,转基因技术（transgenic technology）,定义：是把一种生物的特定基因作为外源基因（转基因）整合到另一种没有该基因的生物的基因组中，使其获得新的形状并稳定遗传给子代的基因操作技术特点：分子及细胞水平的操作，组织和整体水平的表达。目的：培育新种，获取人类所需的生物产品，或进行基因功能的研究。,1、转基因动物的基本步骤是：将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中使目的基因整合到基因组中然后将此受精卵或着床前的目的胚胎细胞再植入受体细胞输卵管（或子
44、宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物人们可以通过分析转基因和动物表型的关系揭示外源基因的功能，也可通过转入外源基因培养优良的动物品种。,X,1-cell pronuclear stagemouse embryo.,PMS+HCGto superovulate,Pregnant Foster Mother,Oviduct Transfer,+,+,2-cell stage embryo,Holding Pipette,Injection Pipette,显微注射法 是将外源DNA在显微镜操作系统的辅助下，通过玻璃微管直接将外源DNA注入哺乳动物受精卵的原核内，使外源基因整合到基因组上，制
45、备转基因动物,2、转基因植物基本方法 转基因植物的技术路线为：1.选择及获得外源目的基因，将目的基因克隆到表达载体上：2.受体细胞的培养，如培养愈伤组织，悬浮细胞，无菌属层；3.选用适当的转基因方法将目的基因导入受体细胞，可用纯化的表达载体直接转化，也可用载体转化农杆菌，再一农杆菌转化受体细胞；4.将转化细胞进行适当培养；5.筛选阳性转化细胞；6.培植阳性转化植株；7.转基因植株的鉴定。转基因植物在医学上的应用 1.生产药用蛋白。因为植物是真核生物，该蛋白利于人体消化，且成本低，产量高。2.新的疫苗来源，特别适合作为口服疫苗。3.产生单抗，作为肿瘤化疗药物。,3、基因打靶技术（gene tar
46、geting technology）,定义：在转基因技术基础上建立的一项基因操作技术，基本内容是通过同源重组定点改造生物体某一内源基因，可导致基因删除、基因插入、基因转换、基因突变等，从而在活体内研究基因、应用基因。,基因敲除的基本程序（一）打靶载体的构建 含目的基因（待敲除基因）的同源片段（二）打靶载体导入ES细胞 一般多采用显微注射法将打靶载体导入ES细胞。（三）基因敲除ES细胞注入胚泡 与原胚泡中的细胞共同组成胚泡内细胞团（四）胚泡植入假孕小鼠的子宫中 敲除ES细胞+正常ES细胞（五）嵌合体的杂交育种 基因敲除的纯系小鼠（纯合子）,基因打靶在医学中的应用 基因打靶技术最大的优势是能修饰和
47、改造动物基因组结构并在动物的整体水平得以表现和遗传。（一）基因打靶与遗传病 通过基因打靶建立基因缺陷型的遗传小鼠模型（基因敲除小鼠），研究遗传病的发生机制、分子基础及诊断的主要动物模型。（二）基因打靶与肿瘤研究 利用基因敲除或敲入小鼠模型，可研究肿瘤相关基因在什么情况下可导致组织细胞恶性生长，从而研究肿瘤发生、转移及转归的分子机制。（三）基因打靶与生物制药 有公司利用基因打靶技术将小鼠的免疫球蛋白基因从其基因组中除掉，然后将人的免疫球蛋白基因敲入到小鼠的基因组中，这种带有人免疫球蛋白基因的小鼠可以产生人源性抗体。人源性抗体将成为治疗多种疾病的有效药物，其社会和经济价值是无法估量的。,思考题,转基因技术（transgenic technology）基因打靶技术（gene targeting technology）,
