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1、,基因探针CHEN PU YAN,基因探针,基因探针又称核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基学院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事发明的。基因探针是指能与特定的靶分子序列发生特异性相互作用的标记分子.也就是指一段能识别(与目的序列或靶序列互补)特异性碱基序列(基因)的标记同位素等标记物的单链DNA或RNA的分子。,检测DNA的技术称为.Southern blot杂交.检测RNA的技术称为.Northern blot杂交.检测蛋白质的技术称为.Western blot杂交.还有dot blot,原位杂交技术等.,杂交类型
2、,固相杂交液相杂交,核酸分子杂交(固相杂交),Northern 杂交Southern 杂交 芯片以上方法决定杂交模板核酸性质,DNA Southern 杂交.RNA Northern 杂交,探针与核酸杂交的方法,1）斑点杂交(dot-blot)2）菌落/噬菌斑：转印筛选法3）组织/细胞(DNA或RNA)：原位杂交(in situ hybridization ISH).Southern-blot(DNA)、Northern-blot(RNA)DNA和RNA操作基本一样，只是电泳所用的胶有所不同(RNA易形成二级结构),图3-3 核酸探针杂交试验全过程示意图,Southern 凝胶转移杂交技术,R
3、NA印迹技术（Northern blotting）1979年，J.C.Alwine等人发展而来，是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似,所以叫做诺赛恩RNA印迹技术（Northern blotting）。而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进行反应,这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Western blotting）。,斑点印迹杂交和狭线印迹杂交 斑点印迹杂交（dot blotting）和狭线印迹杂交（slot blotting）
4、是在Southern印迹杂交的基础上发展的量种类式的快速检测特定核酸（DNA和RNA）分子的核酸杂交技术。由于在实验的加样过程中使用了特殊设计的加样装置，使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。这两项技术更适应与核酸样品的定量检测。,检测重组体克隆的菌落杂交技术,菌落杂交,原位杂交(in situ hybridization ISH),原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，
5、通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。,一、基因探针,1）DNA酶切片段2）用PCR 扩增出的核酸3）直接用RNA作探针4）人工合成（含标记）,1.基因探针的类型,2.基因探针的要求,1）尽量避免高度重复序列：根据目的而定。最好用cDNA(要将polyA或polyT去掉)。2）G+C含量：40-60%3）探针本身不能有4个连续互补碱基，否则本身形成二级结构。4）不主张几个连续相同碱基5）检测目的核酸时，要考虑模板出现率。（兼并性）6）探针比模板短：实际用长探针检测短模板的也可，不影响结果。,3.核酸探针杂交所用的固相载体,1
6、）芯片：种类多，用于工业生产，见各公司介绍。2）硝酸纤维膜(NC膜)：吸附单链DNA、RNA能力强，80-100 ug/cm2；也可非特异性吸附蛋白，但吸附率比核酸低。缺点：脆、易折断；不能吸附小片段DNA。3）尼龙膜：吸附DNA能力比NC膜强，也可吸附小至10bp的DNA。优点：易把模板固定在膜上；可反复使用多次。4）化学活化膜：用化学试剂把NC膜处理，可吸附极少量核酸。也可用普通滤纸。5）滤纸,核酸杂交常用几种膜的性能比较,硝酸纤维膜(NC膜),硝酸纤维膜有两种;0.22m孔经0.45m孔经,4.基因探针的标记物,1）同位素：H3、S35、P32 最常用（缺点：不能保存）2）非同位素：地高
7、辛：植物中提取。商品化地高辛标记dCTP，即合成链时，用地高辛标记dCTP。dCTP-地高辛与酶标抗地高辛抗体反应，加底物显色。生物素-亲和素：用酶标亲和素测dCTP-生物素 荧光：送生物公司标记,5.探针标记方法,1）DNA的切口平移2）随机引物法3）单链DNA探针4）RNA探针5）DNA的5或3末端标记6）寡核苷酸标记7）PCR标记,DNA的切口平移法,双链DNA分子的一条链有切口时，大肠杆菌DNA聚合酶I可把核苷酸残基加到切口处的3羟基端。且由于此酶具有5 3外切酶活性，它还可以从切口的5端除去核苷酸。5端核苷酸的去除与3端核苷酸的加入同时进行，导致切口沿着DNA链移动(切口平移)。,切
8、口平移的反应体系,探针DNA 0.5ug10切口平移缓冲液 2.5uL10dNTP（无dCTP）每种20nmolDNase I(10ng/mL)2.5uLDNA聚合酶I 2.5单位-32P dCTP 16pmol加dH2O 至25uL 1416 12h 加1uL0.5mol/L EDTA(pH8.0)终止反应,随机引物法,DNA聚合酶利用寡核苷酸作引物，沿单链模板合成DNA。如果寡核苷酸的序列不均一，它们就会在模板的许多位置上和模板杂交，因此模板上的每个核苷酸(可能要除去最靠近5端的一些核苷酸)被拷贝进产物中去的频率相同。使用-32P dNTP 作为前体，用此法可合成比活度非常高的标记DNA探
9、针。,随机引物的获得：,1）用DNA酶I消化小牛胸腺DNA或鲑精DNA 产生大量612 核苷酸的单链DNA。2）从一些厂家购买用小牛胸腺DNA制备的随机引物。如Pharmacia、Boehringer、Mannheim等。3）在自动DNA合成仪上合成一个八聚体集群，这一分子集群在八聚体的每一个位置上都含有所有4种碱基。,单链DNA探针,单链探针仅由特定核酸序列的互补双链之一组成，与传统的双链探针相比有很大的优越性。由于不存在互补链，因此可以消除由探针的两条链重退火形成无效杂交体的可能性。当用来自某一种生物中的探针去检测另一种远缘生物中可与之交叉杂交的序列时，单链探针尤为有用。由DNA模板体外制
10、备单链探针有两种方法：1）合成可与克隆于嗜菌粒或M13噬菌体载体上的序列互补的放射性标记DNA（图3-1）2）将克隆于特定载体上的靶序列转录成放射性标记的RNA，在此载体上带有可被噬菌体依赖于DNA的RNA聚合枚识别的启动子。,将靶序列克隆于适当的M13噬菌体或噬菌粒载体中，分离出带有靶序列的单链DNA,利用通用引物合成与靶序列互补的放射性标记DNA,用切点位于靶序列远端的限制酶来消化 DNA,通过凝胶电泳把标记探针与未标记的的模板分开,利用单链DNA载体合成探针(从左到右),RNA探针,在来自鼠伤寒杆菌SP6噬菌体或来自大肠杆菌T7及T3噬菌体的强启动子下游装置多克隆位点，组建成质粒载体，可
11、合成高比活度的单链RNA探针。RNA探针具有许多优越性：1）放射性标记RNA的合成效率高。因为用于合成RNA的模板可被转录多次，所以产生的RNA数倍于模板。2）rNTP的浓度相对交低时(1-20umol/L)，噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶也能在体外发挥作用，所以合成高比活度全长探针的成本相对较低。3）仅用无RNA酶的DNA酶I处理就可从RNA探针中除去模板DNA。而不必用凝胶电泳进行纯化。4）由于RNA杂交体的稳定性本身就比较高，所以RNA杂交反应中产生的信号一般要比相同比活度的DNA探针强。5）RNA探针的使用改进了分析哺乳动物基因转录物的方法。可用RNA酶A来消化RNARNA杂交体，而
12、不必用难以控制的S1核酸酶来消化DNARNA杂合分子。,将靶序列克隆于带有噬菌体启动子的质粒中，这些启动子可被噬菌体编码的依赖于 DNA的RNA聚合酶所识别,用切点位于靶序列远端的限制酶消化重组质粒产生平端或3凹端,体外转录合成RNA探针(从左到右),DNA的5或3末端标记,不同的末端标记用不同的酶：1）大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段：3末端标记2）T4噬菌体多核苷酸激酶：标记DNA 5端3）T4噬菌体DNA聚合酶：标记DNA3端,寡核苷酸标记,T4噬菌体多核苷酸激酶：合成的寡核苷酸在合成时其5端缺少一个磷酸基，因而极易用T4噬菌体多核苷酸激酶进行磷酸化反应，从而将-32p从-32p
13、ATP转移至其5端。大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段：用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段合成与合成寡核苷酸互补的 DNA链，可得到高比活度的探针。用一短引物与寡核苷酸模板结合，后者的序列互补于所用的放射性标记探针。该引物随后在大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段的作用下延伸，从而使-32pdNTP在模板指导下发生掺入。,标记基因探针的纯化,1）乙醇沉淀法2）CPB沉淀法：回收用磷酸盐缓冲液从羟基磷石灰层析柱洗脱下来的DNA3）放射性标记探针的纯化:19%PAGE电泳、Bio-Gel P-60柱或Sep-Pak柱层析,1）探针浓度,同位素标记的探针：5-100ug/mL非同位
14、素标记的探针：25-1000ug/mL,注：,2）随机多聚体,硫酸葡聚糖：5-10%PEG6000-8000聚丙稀酸（钠盐）：2-4%,转印,虹吸印迹法 电转移法 DNA片段大小影响转移速度.,预杂交,用DNA酶I消化并变性的小牛胸腺DNA或鲑精DNA封闭膜.,杂交液,5XSSC 20mmol/L鳞酸缓冲液(pH7.0)5XDenholdt氏液 10%硫酸葡聚糖 100g/ml变性小牛胸腺DNA或鲑精DNA.50%甲酰胺,洗涤液 2XSSC,0.5%SDS 5min.2XSSC,0.1%X SDS 15 min.(室温).0.1XSSC,0.1%X SDS 37 C 30min至1h.0.1X
15、SSC,0.1%X SDS 65 C洗涤30min至1h.(水浴)显影(放射性,非放射性),原位杂交原位杂交1969年美国耶鲁大学Gall和Pardue首先创立的，他们用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，确定该基因定位于卵母细胞的核仁中。,原位杂交技术的基本方法：,(一),杂交前探针种类选择。(二),杂交前探针标记方法选择。(三),探针的纯化。(四),杂交前准备,包括固定、取材、玻片和组织的处理，增强核酸探针的穿透性、减低背景染色等。(五),组织的前处理。(六),预杂交。(七),原位杂交。(八),杂交后处理(漂洗)。(九),杂交后显色。,原位杂交固定,目的是为了保持细胞形态结构，最大限度地保
16、存细胞内的DNA或RNA的水平；使探针易于进入细胞或组织。DNA是比较稳定的，mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。RNA更易被酶降解，应考虑到取材至进入固定剂或冰冻这段时间对RNA保存所带来的影响，因组织中mRNA的降解是很快的。,固定剂,最常用多聚甲醛固定组织。醋酸酒精的混合液和Bouins固定剂也能获得较满意的效果。mRNA的定位将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中12 h，在冷冻前浸入15%蔗糖溶液中，置4冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中待恒冷箱切片机或振荡切片机切片。组织也可在取材后直接置入液氮冷冻，切片后才将其浸入4%多聚甲醛约10 min，空气干燥后保存在-7 0。如冰箱温度恒
17、定，在-70切片可保存数月之久不会影响杂交结果。,在病理学活检取材时多用福尔马林固定和石蜡包埋。其它固定剂如应用多聚甲醛蒸汽固定干燥后的冷冻切片也可获满意效果。各种固定剂均有各自的优缺点，如沉淀性(Precipitating)固定剂：酒精/醋酸混合液、Bouins液、Carnoys液等能为增加核酸探针的穿透性提供最佳条件,但它们不能最大限度地保存RNA,而且对组织结构有损伤。戊二醛较好地保存RNA和组织形态结构,但由于和蛋白质产生广泛的交联,从而大大地影响了核酸探针的穿透性。,杂交,杂交是将杂交液滴于切片组织上，加盖硅化的盖玻片，或采用无菌的蜡膜代替硅化的盖玻片,加盖片防止孵育过程中杂交液的蒸
18、发。在盖玻片周围加液体石蜡封固或加橡皮泥封固。玻片进行杂交的载玻片放在盛有少量5SSC或2SSC(standard saline citrate,SSC)溶液的湿盒中进行孵育。,杂交后漂洗,杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高漂洗。,显示,显示又可称为检测系统(Detection system)。根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。,非特异性染色,非特异性染色可能会来自探针、组织内源性酶、组织细胞、显色系统等;探针特异性不高以及组织细胞内某些成分与显示系统中的抗体成分非特异结合也可造成非
19、特异性染色。组织细胞内源性酶是原位杂交中非特异性着色的重要原因,目前最常用的酶是过氧化物酶和碱性磷酸酶,这两种酶都广泛存在于组织细胞中,因此用这些酶时应有消除内源性酶的相应步骤。如过氧化物酶用3%H2O2处理510 min;10%冰醋酸处理组切片10 min,或在底物显色液中加入1 mmol/L左旋咪唑可防止内源性碱性磷酸酶的染色。NBT/BCIP显示碱性磷酸酶时如果在光照下显色也会增强非特异性染色。必须根据检测系统不同的标记酶作不同的内源酶处理。,常用的对照试验,1将cDNA或cRNA探针进行预杂交(吸收试验)。2与非特异性(载体)序列和不相关探针杂交(置换试验)。3将切片应用RNA酶或DN
20、A酶进行预处理后杂交。应用同义RNA探针(Sense probe)进行杂交。4以不加核酸探针杂交液进行杂交(空白试验)。5组织对照用已知确定为阳性或阴性组织进行杂交对照。6应用未标记探针做杂交进行对照。,通常用地高辛(Dig),生物素,荧光素,同位素,等标记探针;(一)、地高辛(Dig)标记DNA探针在石蜡切片检测病毒DNA的方法。(二)、生物素标记DNA探针在石蜡切片上检测目的DNA的方法。(三)、cRNA探针检测组织切片中的RNA原位杂交。(四)、用寡核苷酸探针检测组织切片中的RNA原位杂交。(五)、用cDNA探针检测体外培养细胞中的RNA原位杂交。(六)、RNA原位杂交与免疫组化双重检测
21、技术。(七)、多重RNA原位杂交技术。(双重原位杂交是在同一标本或同一细胞内同时检测两种或两种以上的靶核酸序列的技术。)(八)、原位杂交的PCR增敏法。,引物原位标记技术(Primed in situ Labeling,PRINS),针对染色体的特异性-卫星DNA 序列设计和合成引物。利用未标记的寡核苷酸引物与变性后的染色体DNA特异结合,然后用荧光素标记的脱氧核苷酸(dUTP)与未标记的脱氧核苷酸一起在DNA聚合酶的作用下进行延伸反应,标记了的dUTP将以碱基配对的形式掺入到新合成的DNA单链中,最后用相应的荧光抗体与标记物结合以显示检测结果。,原位杂交技术应用,原位杂交技术已应用于基础研究
22、如基因组图(Gene mapping),转基因检测,基因表达定位(localization of gene expression),核DNA和RNA的mRNA的排列和运输(arrangement and transport of mNA),复制(replication)和细胞的分类(Sorting of cells)。临床研究应用在细胞遗传学(Cytogenetics),产前诊断(Prenatal diagnosis),肿瘤和传染性疾病的诊断,生物学剂量测定(biological dosimetry)和病毒学的病原学诊断等。,分子灯塔是一个用荧光标记的核酸探针.也叫分子信标,它是近几年兴起的利
23、用核酸杂交技术对核酸分子进行检测的新技术。这一技术是由纽约市公共健康研究协会于1996年首次建立的。因其在与核酸分子互补结合之后荧光素便能开始发光,故称为“分子灯塔”。这一技术的建立为研究核酸分子的组成、含量及对过程中进行实时监控提供了快速、特异、方便的新方法。分子灯塔作为一种核酸探针,不但适用于体外核酸分析,而且适用于活体分析;不仅广泛应用于核酸分子的研究,还是一种极好的研究蛋白质等能与核酸发生相互作用的物质的工具。,灯塔是一个用荧光标记的,具有“发夹”样结构的单链寡聚核苷酸序列,一般含2030个核苷酸,由两部分组成,即环状部分和茎部。如图1所示1:环状部分为单链核苷酸,是分子灯塔的基因识别
24、部位,它能与靶基因一段或,在聚合酶的存在下特异的互补结合。茎部是一段由412对碱基(大多含有5对碱基)互补形成的发夹结构。在茎部的末端,即5端和3端通过连接臂分别与荧光素和淬灭物质结合。荧光素和淬灭物质可根据研究目的的不同自行设计。,分子灯塔在未与靶序列结合以前,以环茎结构的形式存在,其茎部的双链互补结构使末端的荧光基团和淬灭基团紧紧地靠在一起,二者间距离710。荧光基团EDANS在336的激光下会激发出波长为490的蓝色荧光,但由于淬灭基团DABCYL与它靠得很近,因而发生了荧光共振能量转移(fluorescence resonanceenergytransfer,FRET),这样一来,荧光基团发出的荧光就被淬灭基团吸收并以热的形式散发掉,因而此时检测不到荧光信号。当有靶序列存在时,分子灯塔的环状部分的核苷酸序列可以与靶序列特异性地结合,所形成的杂交分子比分子灯塔的茎部双链结构更稳定,于是杂交分子的刚性使茎部的双链分子分离,也就使得荧光基团和淬灭基团分开,此时,荧光分子发出的荧光就不能被淬灭分子吸收,这样在室温下就可通过荧光仪或合适配置的显微镜观察到荧光。,
