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1、蛋白质化学Protein chemistry,问 题,什么是蛋白质?什么是蛋白质分子?蛋白质化学的内容是什么?,蛋白质的结构与功能,蛋白质的定义 蛋白质的分类 蛋白质的化学组成 蛋白质的结构 结构与功能的关系 理化性质和分离提纯,蛋白质的定义,蛋白质的定义 protein is derived from the Greek word(proteios),meaning in the lead or standing in front.or the most important 蛋白质分子 蛋白质的最小功能单位,蛋白质的分类,按形状分：按组成分 按功能分 按结构分,按形状分类,轴比：长轴与短轴的
2、比例。10:1纤维状蛋白 Fibrous proteins球状蛋白质 Globular proteins膜蛋白 Membrane proteins,纤维状蛋白,a-Keratin,a-ibroin and-Keratin:-Sheet Proteins,Triple Helix:Collagen,球状蛋白质,膜蛋白,按组成分类,终产物氨基酸 简单蛋白（simple protein）结合蛋白（conjugated protein）,简单蛋白质,结合蛋白,蛋白质在生命活动中的作用,生物体的组成成分-结构酶运输运动抗体激素遗传信息的控制细胞膜的通透性记忆、识别,按功能分类,以上分类方法各有什么好处?
3、,蛋白质的化学组成,一、蛋白质的元素组成特征二、蛋白质的基本结构单位三、氨基酸的主要理化性质,蛋白质的元素组成,所有蛋白质均含有 C:50-55%H:6-8 O:20-23 N:15-17某些蛋白质含有：S，P等非金属元素个别蛋白质含有：Zn,Fe,Cu 等金属元素,蛋白质的元素组成特点,各种蛋白质的平均含量氮为16左右蛋白质含量（克%）=每克生物样品中含氮的克数 6.25（蛋白质系数）凯氏（Kjeldahl）定氮法测定,蛋白质含量测定方法,最常用的四种基本方法：定氮法，双缩尿法（Biuret法）、Folin酚法（Lowry法）和紫外吸收法、考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中：Bradf
4、ord法和Lowry法灵敏度比紫外法灵敏1020倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往作为其他方法的标准。,凯氏（Kjeldahl）定氮,消化、蒸馏和滴定,方法选择,每种测定法各有优缺点。选择时应考虑：对测定所要求的灵敏度和精确度；蛋白质的性质溶液中存在的干扰物质；测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法（Bradford法），越来越广泛的应用,我国的牛奶事件 三聚氰胺“白色血液”0r 牛奶致癌 性激素、IGF-1,三聚氰胺牛奶,按照我国制定的生鲜牛奶的质量标准，原奶的蛋白质含量在2.9以上，即100克生鲜牛奶的蛋白质含量在2.9克以上属于合格产品，如低于2.9，就意
5、味着向原奶里掺加了水。我国目前采用的检测牛奶蛋白质含量的方法是凯氏定氮法。凯氏定氮法的缺点是：能检测出氮元素的量，而检测不出氮属于什么化合物。三聚氰胺（Melamine）（C3H6N6），俗称密胺、蛋白精，IUPAC命名为“2,4,6-三氨基-1,3,5-三嗪”，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料。白色单斜晶体，几乎无味，微溶于水（3.1g/L常温），可溶于甲醇、甲醛、乙酸等，不溶於丙酮、醚类、对身体有害，不可用於食品加工或食品添加物。由它制成的树脂可用作阻燃剂。它也是杀虫剂环丙氨嗪在动物和植物体内的代谢产物。,蛋白质的基本结构单位,氨基酸的结构氨基酸的分类稀有氨基酸非蛋白质氨基酸
6、,构成蛋白质的基本结构单位-氨基酸（Amino Acid）,自然界氨基酸有300种，蛋白质氨基酸有20种。蛋白质氨基酸结构：,L-氨基酸通式,记住三字母,蛋白质氨基酸分类,按R基的极性性质（即细胞内的pH范围时的解离状态）按R基的化学结构按R基极酸碱性分类按来源分类不同分类方法有不同的用途,按R侧链极性分为四大类,不带电荷极性氨基酸：Gly,Ser,Thr,Cys,Thr,Asn,Gln带负电荷极性氨基酸：Asp,Glu带正电荷极性氨基酸 His,Arg,Lys非极性氨基酸：Ala,Val,Leu,Ile,Pro,Phe,Trp,Met,按R基的结构分类,1脂肪族氨基酸：一氨基一羧基氨基酸：甘
7、氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸 羟基氨基酸：丝氨酸，苏氨酸。含硫氨基酸：半胱氨酸，甲硫氨酸（蛋氨酸）酰胺基氨基酸：天冬酰胺，谷氨酰胺。一氨基二羧基氨基酸：天冬氨酸，谷氨酸。二氨基一羧基氨基酸：赖氨酸，精氨酸。2.芳香族氨基酸：苯丙氨酸、酪氨酸。3.杂环族氨基酸：色氨酸、组氨酸、脯氨酸。,1、中性AA（有极性与非极性15种）2、酸性AA（2种）：天冬氨酸、谷氨酸3、碱性AA（3种）：组、赖、精,按R基酸碱性分类,按R侧链极性分类有何优点氨基酸开发应用氨基酸工业是自20世纪50年代以来，一个朝气蓬勃的新兴工业体系。氨基酸的研究、开发和应用方面均取得重大进展，发现的新氨基酸种类和数量已由60
8、年代50种左右，发展到80年代的400种，目前已达1000多种。其中用于药物的氨基酸及氨基酸衍生物的品种达100多种。我国药用氨基酸原料生产厂现今已发展到40多家，产量由1994年的600多t增长4000多t，18种基本氨基酸中已有17种实现了国产化。氨基酸在医药上主要用作氨基酸输液和口服氨基酸制剂，此外还用作治疗药物、短肽药物和医药合成原料。,蛋白质氨基酸的理化性质,物理性质旋光性紫外吸收 氨基酸的等电点氨基酸的化学性质,氨基酸物理性质,无色晶体、有味（甜、鲜、苦）或无味，不同程度溶于水、稀酸、稀碱，但不溶于任何有机溶剂。光学性质：色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸有紫外吸收，各种氨基酸在可见区都没有
9、光吸收除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性-碳原子，因此都具有旋光性。氨基酸的比旋光度是物理常数之一。,D-型和L-型,氨基酸D-型和L-型构型,COO-COO-NH3+C H H C NH3+R R,根据甘油醛原则确定构型自然界的氨基酸有两种构型除甘氨酸外，其余19种氨基酸都是L-型,D-型和L-型的生理意义？饲用氨基酸？,氨基酸的光吸收特征,色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的最大吸收波长分别为279、278、259nm利用紫外分光光度计（280nm处）测定蛋白质浓度的基础。,氨基酸的两性解离与等电点,氨基酸在结晶形态或水溶液中氨基是以-NH3+存在，羧基以-COO-存在。,氨基酸的等电点（Isoele
10、ctric point,PI）：氨基酸所带净电荷为零时溶液的pH值,氨基酸等电点的滴定,氨基酸等电点与溶液pH的关系?,稀有氨基酸,除了20种常见氨基酸以外，还有一些仅存在于少数蛋白质中的氨基酸。例如：胶原蛋白中羟脯氨酸和羟赖氨酸；甲状腺球蛋白中的二碘酪氨酸和甲状腺素；肌球蛋白中的-N-甲基赖氨酸；-角蛋白中的胱氨酸 上述氨基酸是常见氨基酸的衍生物,没有遗传密码，是通过有关酶的催化修饰而形成的。,非蛋白质氨基酸,蛋白质氨基酸测定,蛋白质水解氨基酸分离氨基酸测定,1、蛋白质酸水解,常用6mol/L的盐酸或4mol/L的硫酸，回流煮沸20小时左右使蛋白质完全水解。优点：不引起消旋作用，得到的是L-
11、氨基酸。缺点：色氨酸完全被破坏；羟基氨基酸（丝或苏）部分被分解，天门冬酰胺和谷氨酰胺酰胺基水解成羧基。,2、蛋白质碱水解,一般用5mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。优点：蛋白质完全水解，色氨酸不破坏。缺点：许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。部分的水解产物消旋化，是D-型和L-型氨基酸的混合物。,3、蛋白质酶水解,优点：不会破坏氨基酸，不发生消旋化。缺点：一种酶往往水解不彻底，需多种酶协同作用。所需时间较长。最常见的蛋白水解酶有以下几种：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶等。,氨基酸分离,氨基酸的化学反应,-氨基的化学反应-羧基的化学反应R-基的化学反应,成肽反应,肽键：蛋白
12、质分子中氨基酸的-COOH和氨基酸的-NH2脱水缩合而成的酰胺键。,肽：由肽键形成的化合物,-氨基的化学反应,氨基酸-氨基反应具有特殊的意义:茚三酮的反应 Sanger反应 Edman反应氨基酸的-羧基可以和碱作用生成盐。其重金属盐不溶液于水。氨基酸的羧基可以被醇类所酯化而生成相应的酯。,茚三酮的反应,2,4-二硝基氟苯(DNFB)的反应,萘磺酰氯（DNS-Cl）,Edman法（异硫氰酸苯酯）,Edman降解法测定氨基酸序列,R-基的化学反应,丝氨酸、苏氨酸、羟脯氨酸羟基能成酯。酪氨酸苯酚基，组氨酸咪唑基具有芳香环或杂环，能与重氮化合物结合而生成棕红色化合物，可以定性、定量测定半胱氨酸侧链的巯
13、基（-SH），易被氧化生成胱氨酸，胱氨酸中的二硫键在形成蛋白质的构象上起很大的作用。Ag、Hg2能与巯基反应，生成硫醇盐。,硫代硝基苯甲酸,测定Cys含量（pH8.0412nm的摩尔消光系数=13600）,蛋白质结构的层次,初级结构：氨基酸排列顺序高级结构:二级结构：主链骨架的局部空间结构超二级结构：二级结构单位的集合体结构域：多肽可以明显区分的球状区域三级结构：整个多肽链所有原子的空间排布四级结构：由亚基或分子缔和而成的集合体,蛋白质与多肽,蛋白质与多肽并无严格的界线:1.蛋白质分子量变化范围很大,从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白
14、质；2.构象的稳定性。蛋白质比多肽稳定,蛋白质的一级结构,蛋白质的一级结构（protein primary structure）又称初级结构，共价结构：蛋白质多肽链氨基酸的组成和排列顺序。游离的-氨基端称为氨基端或N-端；游离的-羧基端称为羧基端或C-端。多肽链上不完整的氨基酸，称为氨基酸残基,蛋白质一级结构分析,蛋白质的一级结构分析包括:组成蛋白质的多肽链数目多肽链的氨基酸数目、种类多肽链的氨基酸顺序二硫键的数目和位置其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序。,蛋白质的结构层次与慨念?,GSH与GSSG,谷胱甘肽（GSH）,2GSH,GSSG,一级结构的表示,氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，
15、以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,一级结构分析,氨基酸自动测序仪,蛋白质的高级结构,蛋白质结构原理肽单位平面结构和二面角维持蛋白质分子构象的化学键二级结构超二级结构结构域三级结构四级结构,蛋白质的构象原理,1.构型与构象构型是指在立体异构体中取代原子或基团在空间的取向。构型互变-共价键的破裂构象是指基团当单键旋转时可能形成的不同的立体结构。构象改变并不涉及共价键的破裂。2.多肽链折叠的空间限制 肽骨架由肽平面组成 肽平面绕C-N1和C-C2键旋转。和可以取-180+180之间的一值。但和的大小受R基影响。,肽键（peptide bo
16、nd）：,肽键具有部分双键的性质组成肽键的原子处于同一平面。,0.127nm键长=0.132nm 0.148nm,CN,C=N,肽平面（peptide plane）:连接在肽键上的六个原子共处于一个平面上，此平面称为肽平面。,两面角（dihedral angle）C碳原子位于两个肽平面的交线上。C上的C-N和C-C都是可绕键旋转，其中以C-N旋转的角度称为，而以C-C旋转的角度称为，这就是-碳原子上的一对二面角。,维持蛋白质分子构象的化学键,离子键(a)氢键（b）疏水作用力(c)范德华引力(d)配位键、二硫键(e),蛋白质分子构象主要靠非共价键维持,二级结构（secondary structu
17、re）,指多肽链主链在一级结构的基础上进一步的盘旋或折叠，形成的周期性构象，又称为主链空间结构，主链构象结构单元。维系二级结构的力是氢键。二级结构的主要形式-螺旋、-折叠、-转角、-转角、无规卷曲,-螺旋(-helix),3.613 螺旋,每一圈含3.6个残基，13个原子，螺距0.54nm，残基高0.15nm，螺旋半径0.23nm角-57，角等于-47。相邻螺圈之间形成链内氢键。即一个肽单位的基氧原子与其前的第三个肽单位的基氢原子生成一个氢键。氢键与螺轴几乎平行。所有肽键都能参与链内氢键的形成。与-碳原子相连的R侧链，位于-螺旋的外侧。由1条充分伸展的肽链的肽键平面折叠成的右手螺旋。,-折叠（
18、-sheet）,多肽链中一段较伸展的周期性折叠的锯齿形的主链构象-折叠有两种类型:即平行结构和反平行结构.,-折叠,-折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而成的。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象。在-折叠中，-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm。-折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。,-转角(-turn),又称为-回折、-弯曲或发卡结构.是多肽链180回折处的特殊结构。在第一个氨基酸残基的C=O和第四个氨基酸残基的N-H之间形成一个氢
19、键。,无规卷曲（random coil）蛋白质的肽链中没有确定规律性肽段构象。结构比较松散。和-螺旋、-折叠、-转角比较是不规则的，但对于一些蛋白质分子来讲，特定的无规卷曲构象是不能被破坏的，否则就失去活性。,-转角（-turn angle）存在于蛋白质180回折处，是由3个连续的氨基酸残基组成，第一个和第三个残基之间形成两个氢键以维持其结构的稳定,二级结构预测,超二级结构（super secondary structure）,球状蛋白质分子中的一级结构顺序上相邻的二级结构常常在三维中相互靠近，在局部区域形成规则的二级结构的聚合体。motif,常见的超二级结构类型,结构域（domain）,结构
20、域(strucbural domain)或称辖区，是近似球状的三维实体。对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构。,丙酮酸激酶的一个结构域,超二级结构和结构域,超二级结构是若干相邻的二级结构构象单元彼此相互作用，形成有规则的，在空间上能辨认的二级结构组合体。是蛋白质二级至三级结构的一种过渡态构象层次。结构域是球状蛋白质的折叠单位。在超二级结构的基础上进一步绕曲折叠成紧密的近似球行的结构，具有部分生物功能。对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个以上结构域缔合而成三级结构。,蛋白质的三级结构（tertiary structure）,指一条多肽链
21、在二级结构（超二级结构及结构域）的基础上，进一步盘绕、折叠而成的具有特定肽链走向的紧密球状结构,或者说三级结构是指多肽链中所有原子的空间排布。维系三级结构的力有 疏水作用力、氢键、范德华力、盐键,鲸肌红蛋白的三级结构,1957年由John Kendrew 用X射线晶体分析法测定的有三维结构1）由一条多肽链（153个Aa残基）和一个血红素组成。2）多肽链主链主链骨架折叠、盘绕成A,B,C,D,E,F,G,H 8个肽段 3）8个肽段均为-螺旋结构，两段之间的拐角处形成无规卷曲4）亲水氨基酸分布于分子的外表面，Mb溶于水5）疏水氨基酸包埋于分子内部，形成疏水空穴，血红素辅基位于其中,四级结构,由具有
22、三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式；最小的单位通常称为亚基或亚单位Subunit，亚基,分别以、命名。根据亚基数目的不同，可分为二聚体、三聚体、四聚体等。寡聚蛋白(Oligomer protein)与多聚蛋白(polymer protein)。四级结构包括亚基的种类、数目、空间排布以及相互作用。亚基的排列是对称的。维持四级结构的作用力是疏水键、离子键、氢键、范德华引力。主要是疏水力。,Hb（hemeglobin）四级结构,Mb 与 Hb,结构与功能的关系,一级结构与功能的关系高级结构与功能的关系,一级结构与功能的关系,1、一级结构中个别氨基酸改变可能改变功能,2、关键肽端的改变导致功
23、能改变ACTH(促肾上腺皮质激素)SYSMEHFRWGKPVGKKRRPVKVYPNGAEDELAEAFPLEF,一级结构反映物种的进化-分子进化,细胞色素C的种属差异性（以人为标准）,一级结构改变引起分子病,最早从分子水平证明的先天性遗传病镰刀形红细胞贫血症。,高级结构与功能的关系,蛋白质变性（protein denaturation）理化因素使天然蛋白质失去原有的理化性质和生物学活性。蛋白质的变性只是三维构象的改变，不涉及一级结构的改变。包括可逆和不可逆变性。变性蛋白的特征：溶解度降低 黏度变化 易被酶水解 凝固 生物学活性丧失,牛胰RNase的可逆变性,血红蛋白的变构与输氧功能,变构作用
24、（allosteric effect）是指对于多亚基的蛋白质或酶，效应剂作用于某个亚基，引发其构象改变，继而引起其他亚基构象的改变，导致蛋白质或酶的生物活性的变化。这样的效应剂也称变构剂。血红蛋白中的4个亚基与氧分子的亲和性不同。氧分子与血红蛋白的一个亚基结合后，引起其构象发生改变，这种变化在亚基之间传递，改变了其他亚基与氧的结合能力。,氧合可以引发血红蛋白4个亚基的8对离子键相继断开，从紧凑的T构象转变为松弛的R构象,蛋白质的性质,蛋白质的相对分子量蛋白质的颜色反应蛋白质的两性解离和等电点蛋白质的胶体性质,蛋白质的相对分子量,蛋白质相对分子量在10 000-1 000 000之间。测定分子量
25、的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于1940年）蛋白质颗粒在25-50X104 g离心力作用下从溶液中沉降下来。,沉降系数（s）：单位离心场的沉降速度。,沉降系数单位常用S，1S=110-13（s）,蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）关系,蛋白质的颜色反应,OH,N,蛋白质的两性解离和等电点,蛋白质能发生两性离解，有等电点。在电场中，如果蛋白质分子所带正电荷多于负电荷，净电荷为正，则向负电极移动，反之，净电荷为负，向正极移动，这种泳动现象称电泳。利用蛋白质在等电点可以将蛋白质进行分离纯化。,蛋白质的两性解离和等电点与氨
26、基酸的两性解离与等电点有何异同，联系?,蛋白质的胶体性质,由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质，如丁达尔现象、布郎运动等。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去,蛋白质的沉淀,蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质溶解性质在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。蛋白质的沉淀分为可逆沉淀和不可逆沉淀。可逆沉淀又称为非变性沉淀。如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。不可逆沉淀又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等。,蛋白质
27、分离提纯的一般原则,蛋一般程序分前处理、粗分级和细分级三步。第一步是前处理(pretreatment)。把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，生物活性。第二步是粗分级(roughfractionation)。蛋白质混合物选用适当方法，将所要的蛋白质与其他杂蛋白质分离开来。一般用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等。第三步是细分级(finefractionation)。样品经粗分级后，使用层析法，电泳法等进一步提纯。,1前处理,选择适当的生物材料，加上适当的抽提试剂，如0.1molL NaCl溶液，采用适当的细胞破碎方法，对生物材料进行细胞破碎，使蛋白质充分释放
28、到溶液中离心，除去沉淀，得到上清液。,沉淀分离,采用适当的沉淀法，从抽提液中分离目的蛋白。硫酸铵分段盐析法 乙醇分段沉淀法 等电点沉淀法 选择性变性法 原理有什么不同?,纯化,如果要均一的高纯度蛋白质制剂，需要进一步提纯。通常采用柱层析法。如：离子交换柱层析，分子筛层析、亲和层析、疏水吸附层析、高效液相层析等。通常采用制备性电泳法进一步提纯，如：制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳、蔗糖密度梯度等电聚焦电泳等。电泳法只能处理少量的样品，因此，在提纯后期使用比较合适。也可采用结晶法对目的蛋白质进一步提纯。蛋白质制剂必须达到较高的纯度(大约是50)，才能进行结晶。因此，结晶法是在提纯后期使用的。在提纯过程中，
29、必须时刻注意防止蛋白质变性。因此，必须低温操作，防止过酸过碱、防止产生过多的泡沫等。,蛋白质混合物的分离方法,1.根据分子大小不同的分离方法2.利用溶解度差别的分离方法3.根据电荷不同的分离方法4.蛋白质的选择吸附分离5.根据生物学特异性的分离方法,1.根据分子大小不同的分离方法,透析（dialysis）和超滤（ultrafiltration）利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质分开。密度梯度离心。常用的密度有蔗糖梯度，聚蔗糖梯度和其他合成材料的密度梯度凝胶过滤即凝胶过滤层析(getfiltration chromatography)，也称分子排阻层析(molecula
30、r exclusion chromatography)，分子筛层析(molecular sieve chromatography)或凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)。这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之。,凝胶过滤的原理,2.利用溶解度差别的分离,(1)等电点沉淀(2)蛋白质的盐溶和盐析：低浓度时盐溶(salting in)；当溶液的离子强度增加时，蛋白质的溶解度开始下降。当离子强度足够高时，蛋白质从水溶液中沉淀出来,这种现象称为盐析salting out(3)有机溶剂分级法：,蛋白质的选择吸附分离,某些物质，例如极性的硅胶和氧化铝以及非极性
31、的活性炭等的粉末具有吸附能力，能够将其他种类的分子吸附在其粉末颗粒的表面，而吸附力的强弱又因被吸附的物质性质不同而异，吸附层析法(adsorptionchromatography)就是利用这种吸附力的强弱不同而达到分离的目的。,离子交换层析,根据电荷不同的分离方法,(1)电泳：在电场的作用下，带电颗粒向着与其电性相反的电极移动，这种现象称电泳（electrophoresis）或离子泳.泳动速度主要决定于它所带的净电荷量以及颗粒的大小和形状。(2)离子交换层析：是以离子交换剂作支持剂的层析法。由于不同物质与交换剂间的静电吸引不同，使不同物质依次被洗脱下来而得到分离。,自由电泳,亲和层析,质量鉴定,鉴定蛋白质制剂纯度的方法很多，有聚丙烯酰胺凝胶电泳法、等电聚焦电泳法、超离心沉降法、免疫电泳法、酶活力法等一般需要用二种或更多种方法鉴定蛋白质制剂的纯度。测定蛋白质的生理活性，如酶的比活力，多肽激素的生理活性等。为了计算酶的比活力，还必须测定蛋白质浓度。,
