《生皮蛋白质化学》PPT课件.ppt

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1、本章包含如下内容1 氨基酸（分类、性质）2 多肽3 蛋白质（构象、性质）4 生皮蛋白质化学（胶原、角蛋白等）,1 蛋白质的化学组成,C、H、O、N，大多含有 S有的还含有P、Fe、I、Cu、Mo、Zn,1.元素组成,各元素的百分比对于大多数蛋白质都较相似，其中N约占16%。这可用于测定蛋白质的含量凯氏定氮法。,2 蛋白质的基本结构单位 氨基酸(amino acid),组成蛋白质的氨基酸都为a-氨基酸（除Pro外）,C,酸,氨,不同的 aa 在于 R基团 的不同,组成蛋白质的氨基酸都为L型（除Gly外）,D型 与 L型,组成蛋白质的氨基酸共有20 种,I 非极性氨基酸,I 非极性氨基酸,I 非极

2、性氨基酸,组成蛋白质的氨基酸共有20 种,不同的 aa 在于 R基团 的不同,II 非解离的极性氨基酸,II 非解离的极性氨基酸,III 酸性氨基酸,IV 碱性氨基酸,1.由R基团的性质,Phe、Tyr、Trp,Pro、His,Ala、Val、Leu,二.氨基酸的分类,二.氨基酸的分类,2.由aa的营养需求,人类自身能合成,人类自身不能合成或不能足量合成，必须依赖食物供给。,Lys Val Leu Ile Met Phe Thr Trp,Gly Ala Ser Tyr Cys Pro Asn Asp Glu Gln,Arg His,三 不常见的氨基酸4-羟脯氨酸(4-hydroxyprolin

3、e)和5-羟赖氨酸(5-hydroxy1ysine)，存在于结缔组织的纤维状蛋白质中。胱氨酸（Cystine,Cys）是由两个半胱氨酸氧化后生成，毛、发、角、蹄中含量丰富。-N-甲基赖氨酸（-N-methyllysine）存在于肌球蛋白，一种行使收缩功能的肌肉蛋白质。-羧基谷氨酸(-carboxyglutamic acid)，在凝血酶原中发现，它也存在于某些具有血液凝固功能的其他蛋白质中。,5羟赖氨酸 N甲基赖氨酸 羧基谷氨酸 4羟脯氨酸,胱氨酸,锁链素(dasmosine)和异锁链素（isodesmosine），它是赖氨酸的衍生物，中央的吡啶环结构是由4个赖氨酸分子的侧链组成的，此氨基酸只存

4、在于弹性蛋白中。,以游离或结合态存在于细胞或组织中，大部分是常见氨基酸的衍生物或异构型。如存在于细菌细胞壁肽聚糖内的D-谷氨酸和D-丙氨酸、花生中的g-亚甲基谷氨酸、甘蔗中的b-氨基丁酸，刀豆中的刀豆氨酸等。,非蛋白质氨基酸,非蛋白质氨基酸,鸟氨酸(Orn),瓜氨酸,四 氨基酸的性质1 等电点PI2 光学活性3 化学性质【氨基、羧基、共同参与、侧链R基】,1.两性性质和等电点,四 氨基酸的理化性质,氨基酸同时含有氨基和羧基：氨基具有碱性，羧基具有酸性,甘氨酸的解离曲线,滴定曲线,1.两性性质和等电点,等电点(isoelectric point),使氨基酸净电荷为零时溶液的pH值，用 pI 表示

5、,此时，aa 以两性离子形式存在，也有少量的数目基本相同的正、负离子存在，还有极少量的中性分子,pI 是氨基酸的特征常数,1.两性性质和等电点,等电点(isoelectric point),20种氨基酸的pI,等电点的计算,例 Gly 的pI 计算,pI=1/2(pK1+pK2),等电点的计算,例 Lys 的pI 计算,pI=1/2(pK2+pK3),溶液 pH 值增大,等电点的计算,例 Glu 的解离,pI=1/2(pK1+pK2),等电点的计算,aa 等电点的计算公式,pI=1/2(pKn+pKn+1),(其中n为可解离的正电荷基团数目),Conclusion,pH pI 带负电，移向正极

6、,pH pI 带正电，移向负极,pH=pI 不带电，不移动,2.光学性质,除Gly之外，其余蛋白质氨基酸都有手性碳原子，都具有旋光性。,旋光性质,Trp、Tyr、Phe 含芳香环共轭双键系统，最大吸收峰分别在 279nm、278nm、259nm。,紫外吸收,3.重要的化学性质,茚三酮反应,反应分2步：,茚三酮反应常用于aa的定性和定量分析,在酸性条件下，氨基酸与茚三酮共热，生成紫色化合物,Pro的茚三酮反应呈黄色,Sanger反应,在弱碱溶液中，氨基酸的-氨基与2,4-二硝基氟苯(DNFB)反应，生成黄色的二硝基苯氨基酸（DNP-AA）,此反应最初被Sanger 用于测定肽链 N-端氨基酸,E

7、dman反应,Edman反应,Edman反应,此反应即是目前“蛋白质顺序测定”的设计原理,3 肽（peptide）,一.肽的定义,一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基脱去一分子水而形成酰胺键，这个键称为肽键（peptide bond），产生的化合物叫做肽（peptide）。,二个氨基酸形成的肽称作二肽,三个氨基酸形成的肽称作三肽；余类推。寡肽（oligopeptide）：aa 10 个,二.肽的结构,肽键结构特点1）肽键具有部分双键性质，不能自由旋转；2）肽平面是刚性平面结构（六个原子处在同一平面内）；3）在肽平面内，羰基上的氧与亚胺基上的氢反式排布。,无分枝的长链,由“N-C-C”单元的周期

8、性连接，构成多肽链的主链；氨基酸残基的R基团连接在主链的Ca上，形成多肽链的侧链。,具有方向性。两个末端分别为N端(氨基端)和C端(羧基端)。,1、中文表示法：从肽链的N端开始，对氨基酸残基逐一命名，残基称氨酰,三.肽的表示法,2、三字母表示法：aa1-aa2-aa3-aa4-aa1.aa2.aa3.aa4.,3、单字母表示法：ABCD,四.肽的酸碱性质,其等电点是在所有可解离的基团的净电荷为0时的状态。,肽链的一端含有一个游离的-氨基，另一端含有一个游离的-羧基，加上部分氨基酸可解离的R基团，因而与氨基酸一样具有两性解质的性质。,五.重要肽,还原性谷胱甘肽（reduced glutathio

9、ne）是存在于动植物细胞中的一种非常重要的三肽。它是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成。GSH,谷氨酰半胱氨酰甘氨酸,GSH由谷氨酸，半胱氨酸和甘氨酸通过两步依赖ATP的反应而生成。第一步反应由谷氨酸和半胱氨酸在-谷氨酰半胱氨酸合成酶(-EC合成酶；-ECS,EC 6.3.2.2)催化下形成-谷氨酰半胱氨酸(-EC),第二步是由GSH合成酶(GS,EC 6.3.2.3)将-EC和谷氨酸连接形成 GSH,4 蛋白质一 蛋白质的构象1 蛋白质的一级结构（primary structure）蛋白质分子的一级结构是指多肽链中氨基酸的组成、连接方式和排列顺序。不同的蛋白质，一级结构不同。蛋白质的一级结构是由

10、基因上的遗传密码的排列顺序决定的。一级结构最为重要，它包含着决定蛋白质空间结构的基本因素，也是蛋白质生物功能的多样性和种属特异性的结构基础。,牛胰岛素的一级结构示意图（牛胰岛素由两条肽链共51个氨基酸残基组成）A链含有11种共21个氨基酸残基，N-端为甘氨酸，C-端为天冬酰胺，A链本身的6位和11位上的二个半胱氨酸通过二硫键相连成环；B链含16种共30个氨基酸残基，其N-端为苯丙氨酸，C-端为丙氨酸。,2 蛋白质的空间结构主要包括蛋白质的二级结构、三级结构和四级结构。维持蛋白质分子构象的作用力有：氢键、盐键、疏水键、范德华力和二硫键等。,a氢键；b盐键；c疏水键；d二硫键,（1）蛋白质的二级结

11、构蛋白质的二级结构是指多肽链的主链骨架中若干肽段在空间的伸展方式。维系主链构象稳定的最主要因素是主链的羰基和亚氨基之间所形成的氢键；蛋白质的二级结构最重要的是-螺旋和-折叠，还有-转角和无规卷曲等。,1）-螺旋结构（Helix）,在-螺旋结构中，多肽链中各肽键平面通过-碳原子的旋转，围绕中心轴形成一种紧密螺旋盘曲构象。蛋白质分子中广泛存在-螺旋。,如果一系列相邻肽单位的成对二面角都采用相同或相似的值，导致多肽链的主链骨架绕定轴一圈圈螺旋上升，形成象弹簧一样的螺旋结构。,结构特点如下：肽链呈螺旋上升，每相隔3.6个氨基酸残基上升1圈，每个氨基酸残基绕轴旋转100，沿轴向升高0.15nm，故螺距约

12、为0.54nm；,螺旋间靠氢键维系，氢键是由同一条主链上一个氨基酸残基中的C=O氧与后面第四个氨基酸残基中的N-H氢形成，方向与螺旋轴大致平行，由于每个肽键中的C=O和N-H都参与形成链内氢键、故保持了-螺旋的最大稳定性。,2）-折叠结构（Sheet）一般由两条以上的肽链或一条肽链内的若干肽段共同参与形成，它们平行排列，并在两条肽链或一条肽链内的两个肽段之间以氢键维系而成。,按照通过氢键结合起来的相邻肽链的端基方向，折叠分为平行折叠和反平行折叠两种。在平行折叠中，相邻肽链的N端都在同一端；在反平行折叠中，每一条肽链都与其相邻肽链的端基方向相反，即首尾交替排列。折叠大量存在于丝心蛋白和角蛋白中。

13、,3）胶原螺旋（Collagen Helix）胶原螺旋是胶原蛋白质特有的构象形式。胶原属于纤维蛋白，是动物结缔组织中的主要蛋白质。平均分子量将近30万，1056个AA构成；氨基酸构成：13 Gly，11 Ala，12 Pro和9Hyp；肽段呈现明显的三肽周期性结构，Gly为三肽中的固定组成，Pro、Hyp是肽中对构象有决定意义的组成。最常见的几种三肽序列：GlyXPro、GlyProY、GlyXHyp,胶原为三股胶原螺旋构象，即由三条呈左手螺旋的肽链形成的右手复合螺旋。其中，单条肽链的左手螺旋是一种较伸展的螺旋构象，螺距为0.9nm，每圈含3个氨基酸残基，每个氨基酸在螺旋轴线上的投影约为0.3

14、nm，明显的大于螺旋的螺距0.54nm和每个氨基酸投影0.15nm。右手大螺旋的螺距2.86nm，每圈含10个氨基酸残基。肽链之间形成的氢键维持构象稳定。,(2)蛋白质的三级结构,蛋白质的三级结构是指蛋白质（主要指球状蛋白）分子在二级结构的基础上依靠非共价键力进一步卷曲、折叠而构成的一种不规则的、特定的、更复杂的空间结构。球状蛋白质分子内有几类二级结构单元。,肌红蛋白存在于哺乳动物（鲸、海狗和海豚）肌肉中，是一种较小的球状蛋白，它是由一条含153个氨基酸残基组成的多肽链。主链中75绕曲成8段比较直的-螺旋。,3 蛋白质的性质1）蛋白质的酸碱性（PI）,2)蛋白质的沉淀(precipitatio

15、n),3)蛋白质的变性（Denaturation）与复性A 概念由于物理、化学等因素而导致蛋白质构象的变化，使蛋白质丧失生物学功能和原有的性质。此时，维持蛋白质构象稳定性的氢键、疏水键、范德华力、离子键，甚至双硫键遭到破坏。分为可逆变性（复性）及不可逆变性,B 变性因素（1）温度（热变性）（2）pH改变（3）有机溶剂（4）脲及盐酸胍（5）盐类,Christian B.Anfinsen等人用含有2-巯基乙醇的8M脲的变性剂使Rnase A变性，导致酶的三级结构和催化活性完全丧失，生成含有8个巯基的多肽链。如果使变性的酶氧化和再折叠，8对巯基可以随机配对的话，那么就有可能生成105种二硫键不同的结

16、构，但具有生物活性的只有一种。如果将还原剂和脲同时都除去，并且稀释还原的蛋白将它于生理pH条件下暴露在空气中，Rnase A会自发地获得它的天然构象，一套正确的二硫键和充分的酶活性。,5 生皮蛋白质一 生皮蛋白质构成,毛被 角蛋白 Keratin表皮 角蛋白基膜 Basement Membrane真皮 胶原蛋白（Collagen）弹性蛋白（Elastin）网硬蛋白皮下组织 脂类,皮革生产过程，只保留了原料真皮层中的胶原蛋白，其余的纤维介质和蛋白都在制革过程中通过化学物理方法和机械处理而除去。,二 胶原纤维（Collagen）1 胶原分类 型胶原是生皮中最丰富的胶原，型胶原分子由三条肽链构成，两

17、条肽链相同，一条不同，分别称为1 和2链，分子组成为1（）22（）。型胶原是软骨和玻璃体的主要胶原蛋白质，由三条相同的肽链构成，分子组成为1（）3，其氨基酸组成与型胶原类似。,2 胶原结构 1）胶原的一级结构-AA组成一般由1056个左右AA组成，其中3 Gly（3034），脯氨酸羟脯氨酸（Hyp+Pro）约 22（2023），不含色氨酸（Trp），除型胶原外，都不含Cys；,胶原的多肽序列特点其中螺旋区段含有1014个AA残基，螺旋区段呈现（Gly-X-Y）n周期性排列，即338个（Gly-X-Y）周期结构，其中约的X和Y为Pro或Hyp螺旋区段长度大约为链总长度的95。C-端肽、N端肽分别

18、含有25个和16个AA残基，N端为焦谷氨酸（PGlu），C端肽的端基为27位的门冬氨酸（Asp）。,链中是酸性和碱性AA残基，且分布较集中，对应在链中出现许多极性区，如第残基为LysAsnGlyAspAspGlyGlu以及C端GlnGlnLysAlaHisAspGlyGlyArg等。而非极性AA亦呈明显区域分布。极性和非极性AA区域集中正好对应于链长间距片段，晶体电镜照片中的非周期性明暗条纹（SLS），其中暗纹为极性区。,螺旋区肽段第87位、第930位的Hyl可以和C端肽的第16位(16C)，N端肽的第9位(9N)的Lys形成分子内交联。,2）胶原蛋白质的二级结构-胶原螺旋 三条呈左手螺旋的肽

19、链形成的右手复合螺旋。其中，单条肽链的左手螺旋是一种较伸展的螺旋构象，螺距为0.9nm，每圈含3个氨基酸残基，每个氨基酸在螺旋轴线上的投影约为0.3 nm，明显的大于螺旋的螺距0.54nm和每个氨基酸投影0.15nm。右手大螺旋的螺距2.86nm，每圈含10个氨基酸残基。肽链之间形成的氢键维持构象稳定。由三条肽链借助于链间氢键形成的胶原螺旋，构象紧密，僵硬，具有很高的稳定性，若氢键被破坏，单个肽链成为无规卷曲。,3）胶原的分子内、分子间交联1965年Smith提出了原胶原分子排列的14错列模型，认为：平行排列的胶原分子不是齐头齐尾，而是错开一个确定的距离，即明暗横纹间距67nm，处于同一轴线上

20、的前后两原胶原分子，首尾并不相接，而是空出一段间隙，称为HO，且HO0.5D。原胶原分子总长4.5D，明纹间距0.6D，暗纹间距0.4D94个AA残基由Hly-Lys之间的侧向交联产生。,Lys和Hyl对分子内和分子间交联的重要性螺旋区肽段第87位第930位的Hyl可以和C端肽的第16位(16C)，N端肽的第9位(9N)形成分子内交联。,三种交联方式，都与Lys,Hyl的氨基有关氨基在赖氨酰氧化酶作用下氧化为醛基，得醛赖氨酰，其非常活泼，可与多种侧链官能团发生交联反应。（1）醛胺缩合醛赖氨酰的醛基与Lys进行醛胺缩合，得希夫碱PCHOH2NCH2PPCNCH2P,（2）羟醛缩合两分子醛赖氨酰之

21、间发生，生成羟醛交联，羟醛通过分子内脱水转化为烯醛。,（3）羟醛组氨酸交联1975年，豪斯莱（Howsley）从胶原的酸水解中分离出来的，由三条链间的醛赖氨酰，醛羟赖氨酰与组氨酰交联而成。,3 胶原性质1）酸、碱2）盐类3）酶4）胶原的湿热稳定性及Ts胶原纤维在水浴（或甘油浴）中受热，突然发生收缩变性的温度，称为胶原纤维的收缩温度，也叫Ts，Ts随动物种类的不同略有不同，一般为6070。,胶原受热收缩与氢键破坏相关，对于胶原纤维，维持构象稳定性的作用力主要来自于链间氢键，但由于羟脯氨酸吡咯烷环的空间位阻，链间的肽平面不能完全形成有效的氢键，因此，Hyp的羟基氢原子与主链羰基中的氧原子之间形成的

22、氢键具有重要意义。这可以由胶原的Hyp含量与Ts的一致性关系得到体现，Hyp含量高，Ts越高。,胶原分子间的共价交联能显著提高胶原纤维的Ts，鞣制过程就是在胶原纤维间引入了新的交联结构。Ts是制革过程中对胶原水解、变性的程度和革的鞣制质量进行评价的重要指标。,三 角蛋白（Keratin）1 角蛋白概述 角蛋白是构成动物皮肤中表皮、毛发的主要结构蛋白，另外，动物的指甲、羽毛、蹄、角等也含有角蛋白。根据角蛋白分子中Cys含量，可将角蛋白分为：硬角蛋白和软角蛋白：硬角蛋白，也称真角蛋白，Eukeratin，Cys711；软角蛋白，也称假角蛋白，Pseutokeratin，Cys7。,-角蛋白的基本结

23、构是右手-螺旋聚集方式如下：三条右手螺旋链相互缠绕，构成了一个直径为2.0nm的左手三股螺旋，是纤维的初级单位，叫初原纤维（Protofibril），大量的双硫键参与了初原螺旋的形成。11条初原纤维，两条在中间，其余九条环绕排列形成了一个微原纤维（Microfibril），直径为7.5nm，由数百根微原纤维平行伸展、侧向聚集形成巨原纤维（Macrofibril），其直径为200nm。,2 角蛋白的性质 1）酸、碱对角蛋白的作用角蛋白质中的双硫键对酸非常稳定，用强酸处理角蛋白，会由于肽键的水解而溶解，但水解片段中仍保持原有的双硫键结构。强碱对角蛋白质有强烈的溶解作用。主要原因在于双硫键的水解，此

24、水解属于双分子消除反应。,硫醚键交联和亚氨基交联永久型结合 脱氢丙氨酰的双键可以与亲核试剂加成，随着双硫键的不断水解，脱氢丙氨酰逐渐增多，这两个残基之间可以通过亲核加成以硫醚键交联起来；Arg在碱性条件下脱胍形成的鸟氨酸的侧链氨基可以与脱氢丙氨酰的双键加成生成亚氨基交联，这些新的交联键会大大增强所在部位的稳定性，并可使角蛋白纤维达到“永久定型”；,脱氢丙氨酰还可以与酰胺水解释放的NH3反应，产生-氨基丙氨酰。由于-氨基丙氨酰中的NH2可以提供质子，则可与另一分子脱氢丙氨酰以亚氨基交联形成稳定结构；半胱氨酰盐可以与羟基反应，依次生成次磺基丙氨酰、磺基丙氨酰。,在Ca(OH)2溶液中，双硫键断裂后

25、，生成的脱氢丙氨酰、半胱氨酰盐还会形成有Ca2+参加的链间交联。,这种交联键很牢固，难于被碱和硫化物破坏。这就是制革脱毛浸灰操作不当时出现“护毛”的原因。,2）氧化剂的作用角蛋白对氧化剂很敏感，主要是双氧水、亚氯酸钠、高锰酸钾、过甲酸、过乙酸等。氧化剂的作用点在双硫键上，将双硫键氧化为磺酸基，得到可溶性角蛋白衍生物。PSSPRCOOOHH2OPSO3HRCOOH过甲酸、过乙酸是常用的有机过氧酸，可以定量地将胱氨酸氧化为磺基丙氨酸。,3）还原剂的作用主要是硫化物（Thiols）、磷化物（Phosphines）、亚硫酸盐（Sulfites）等，常用硫化钠、巯基乙醇、巯基乙酸、亚硫酸钠等。如三丁基膦

26、，反应条件温和，反应专一定量、不会发生角蛋白的水解。产生的巯基用碘乙酸封闭。PrSSPrPR3H2OPrSHPR3O亚硫酸盐的反应：PrSSPrNaHSO3PrSHPrSSO3Na此时产生的巯基用碘化甲基汞除去。,双硫键与硫化物，如硫化钠的反应，PrSSPrNa2SNaSSNa2PrSNa制革中硫化钠脱毛的原理。,4)酶对角蛋白的作用天然角蛋白对酶很稳定，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等均不能水解。而还原角蛋白则可以被多种酶水解。能水解天然角蛋白的酶称为双硫键还原酶，存在于皮蠹虫中。,3 角蛋白的交联反应 通过在还原角蛋白的Cys之间引入新的化学交联，可以提高角蛋白纤维的机械强度，改善湿热收缩性能，常用

27、的交联剂有甲醛、二卤代烷。PrSHHCHOPrSCH2SPr交联反应也可以在Cys与Lys的侧链氨基之间发生。PrSHHCHOH2NC4H8CH（NH2）COOHPrSCH2NHLys通过二卤代烷的烷基化反应，如1，3二溴丙烷作交联剂，形成交联。PrSHBrC3H6BrPrSC3H6SPr,4 制革过程中角蛋白的处理 制革工艺中，角蛋白的除去主要是在浸灰过程完成的，通常采用Na2S、CaO处理，Na2S还原角蛋白中的双硫键，除去毛发、表皮，并使胶原蛋白膨胀。但在使用过程中，要注意Na2S、CaO的加入顺序，而且要注意Na2S的用量，否则会产生“护毛”作用。正确的操作是：先加入硫化钠（60%）处

28、理，等毛已经开始溶解后加入氧化钙；氧化钙纯度 60%。,四 弹性蛋白质（Elastin）1 弹性蛋白质的侧链交联 弹性蛋白具有特别高的湿热稳定性表明，其分子间必然存在牢固的侧链共价交联。包括链内、链间交联，主要是锁链素（Desmosine）、异锁链素（Isodesmosine）、开链赖氨素(Merodesmocine)和赖氨酸正亮氨酸（Lysinorloncine）。,异锁链素锁链素的生物合成过程（包括6步）。下面以异锁链素为例，讲述其生物合成过程。三个醛赖氨酰与一个赖氨酰结合而成。合成步骤如下：醛胺缩合、不对称加成、羟醛缩合、醛胺缩合、脱水氧化。,2 弹性蛋白在制革中的变化 弹性蛋白只占动物皮肤总蛋白含量的1，但对皮革性能有很大影响，弹性蛋白在干燥情况下，当水份含量20时，弹性消失，既硬且脆，对成革柔软性有不良影响，因此在制革过程中要将弹性蛋白完全除去。弹性蛋白通常在软化过程被除去，因为胰蛋白酶能水解弹性蛋白。,五 网硬蛋白（略）六 生皮中的球蛋白（略）七 生皮中的非蛋白质组分（略）,作业P 49-501、7、8、11、13,