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1、第四章 细胞培养的基本技术,解放军总医院基础医学研究所 免疫学研究室 黄建华,细胞培养技术平台,基因治疗基因诊断试管婴儿组织工程药物筛选致病机理,主要内容,基本操作技术和要求 原代培养 传代培养和细胞系的维持 细胞冻存与复苏 细胞培养污染的检测和排除,细胞是生命活动的基本单位,1665年英国学者Robert Hooke，用自制的显微镜观察软木的薄片，第一次发现植物的细胞结构，并首次借用拉丁文Cella（小室）词.1983-39德国植物学家施莱登和动物学家施旺确立了“细胞学说”的基本原则。（）细胞是有机体，动植物都是由细胞发育来的；（）每个细胞都作为一个相对的独立单位，有自己 的“生命”。（）新
2、的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。进化论，遗传学和细胞学说定为现代生物学的三大基 石，而细胞学说又是后二者的基石。,组织（细胞）培养,从生物体内取出细胞（组织），模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存、生长并维持其结构和功能的方法。细胞（组织），包括器官培养终归是离体培养，缺少生物整体的严密联系，不能代表整个机体。在进行医学生物实验过程及对结果的评估是都必须考虑这些。,1 基本操作技术和要求,由于体外培养的细胞没有抗感染能力，因此防污染是决定培养成功的首要条件。一切操作需要保证无菌和有条不紊。,1.1 培养室内的无菌技术,培养前的准备：按实验计划和程序 准备 物品，作到心中
3、有数培养室和超净台：定期全面彻底消毒培养用品的无菌处理：高压灭菌、过滤、酒精消毒实验中无菌培养操作：均在火焰近处进行，实验用品需火焰灭菌，冷却后接触培养细胞，以防烧死细胞。,1.2 培养细胞的 取材,基本要求：取材组织用培养液浸泡，4度运送，24h内尽快培养。取材无菌操作，避免对组织的机械损伤，尽量去除脂肪、神经、结缔、坏死组织，污染组织可用青链霉素和制霉菌素漂洗。原代取材同时保留组织学和电镜标本，对供体来源、部位及一般情况做记录。,1.2.3 皮肤和粘膜的取材,皮肤和粘膜是上皮细胞培养的重要来源。取材方法似断层皮片手术，面积2-3mm2.尽可能去除皮下和粘膜下组织。因分布在体表，故细菌、霉菌
4、很多，需严格消毒，可用较高浓度抗菌素漂洗。,1.2.4 内脏和实体瘤的取材,内脏除消化道和泌尿管道外基本是无菌的，明确取材部位，去除结缔组织。肿瘤组织取材避免坏死液化和结缔组织，标本应按污染组织处理。,1.2.5 血细胞的取材,血细胞培养可用于造血干细胞移植、免疫活性细胞的治疗和染色体分析等。取血抗凝剂量过大易导致溶血，肝素常用浓度为20U/ml,针管用较高浓度肝素500U/ml湿润。,1.3 组织材料的分离,欲从组织中获得大量生长良好的细胞，须将组织分散开，使细胞解离出来。常用方法有机械法和化学法。,1.3.1 细胞悬液的分离方法,离心法：血液和体液等细胞悬液500-1000rpm 转速 5
5、-10分钟。离心速度过大、时间过长，会造成细胞损伤和死亡。密度梯度离心法：用离心法将细胞分到不同密度的梯度介质中，再分别吸出各层细胞。适于分离密度不等的的细胞。常用介质有Ficoll 400,Percoll,泛影葡胺等。,1.3.2.1 机械分散法,适于较柔软的组织，如脑、肝、脾、淋巴结、胸腺、胚胎组织和肿瘤组织等。剪切组织为1mm3碎块 后，置于组织匀浆研磨，或用吸管反复吹打分散组织细胞 组织液放在注射器内通过针头压出。注射器针芯挤压后，用PBS液洗涤，分别通过不锈钢筛网80,150,400目孔径筛网。记数活细胞数，制成细胞悬液接种。,1.3.2.3 消化分离法,消化法是结合生化和化学手段把
6、已剪切成较小体积的组织进一步分化，获得细胞悬液直接进行培养,1.3.2.3.1 胰蛋白酶法,主要作用是对细胞间蛋白质水解，使细胞离散。活性以消化酪蛋白的能力测定，常用1：250消化效果与pH值、温度、酶浓度和组织块大小与硬度有关，对细胞分离作用与细胞的类型与性质关系密切钙镁离子和血清抑制活性常用剂量为0.25%（0.1-0.5%），pH值 8（8-9）温度 37。4度配制应用液。,1.3.2.3.2 胶原酶法,只对细胞间质胶原组织起消化作用，使上皮细胞与胶原成份分离产品有I-V VII-IX等型，分别适用于分离肝细胞、胰岛、脂肪细胞肾及纤维组织钙镁离子和血清不影响活性,常用剂量为200单位/m
7、l或0.1g/ml 0.3 g/ml,1.3.2.3.3 EDTA法,EDTA（二乙烯四乙酸二钠）作用较缓和。主要作用：能从组织生长环境中吸取维持组织完整的钙镁离子。单独使用不能使细胞完全分散，常用1:1的EDTA（0.02%）和胰蛋白酶0.25%混合液,2 原代培养,也称初代培养,是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。细胞保持原有的基本性质，仍具二倍体遗传物性。最接近和反映体内生长特性。适合作药物测试，细胞分化研究。原代培养细胞部分生物学特征尚不稳定，供体和细胞间有很大差异。,2.1 组织块培养法,将组织剪成小块后，接种于培养瓶，24小时贴壁后，细胞就从组织周围长出。培养瓶底预先涂以胶
8、原薄层，以利上皮细胞的生长。如需做组织染色或电镜检查，可将组织可放入小盖玻片上后再放进培养瓶培养。换液需轻巧，以免组织块漂起，细胞死亡,2.2 消化培养法,采用前述的组织消化分散法。将妨碍细胞生长的细胞间质去除，使细胞分散，形成悬液，按不同浓度接种培养瓶培养。,3 传代培养和细胞系的维持,培养细胞增殖长满瓶壁时，既达到所谓的饱和密度。此时正常细胞则不再生长；恶性细胞重叠生长，易于从瓶壁上成片脱落,，为此传代势在必行。,培养细胞的生长过程,1）原代（初代）培养期：从机体取下组织培养到第一次传代，此代细胞保持异质性，细胞种类较多，接近原组织细胞种类。维持时间，因细胞种类不同，一般1-4周。2）传代
9、期培养：初代培养的细胞生长到一定程度，即可连接传代，使其连续生长。一般正常二倍体细胞，不加附加条件，可传代30-50代，此时可发生染色体丢失、突变、细胞增殖变慢、停止分裂，进入衰退期，我们称之有限细胞系。这一转折点有人称之危象临界点（crisis）有些细胞的少数后代，或通过人工条件转化的细胞可通过这一期，获得持久的增殖传代能力，我们称细胞系，或无限细胞系，即一般通称的细胞系。,（3）衰退期：传代细胞到达一定代数，即发生增殖缓慢，逐 渐停止，进而发生衰退、死亡，多数传代细胞（或叫有限细胞系），不能通过所谓的“crisis（危象临界点），导致最终死亡，这一现象可能说明生物学衰老的细胞学基础。人胚胎
10、成纤维细胞可以进行60代增殖，而80岁老人的肺成纤维细胞仅传代了16代后便死亡。表皮细胞寿命4-10天；红细胞3周-3个月，白细胞5-7天，神经细胞数年或更多。,密度抑制（Density inhibition）或接触抑制（Ccontact inhibition）,1958年Abercrombie 等学者提出的一种现象，培养细胞再生长过程中多发生分裂增殖，细胞移动而相互靠近，这时某些细胞可移向其他方向，保证细胞不会重叠，一但接触，这种活动即可停止。所谓接触抑制实际使细胞汇合形成单层时，细胞变得拥挤，与培养液接触的表面区域也相应减少，营养成分消耗，其分裂也将停止。,细胞生长曲线,细胞数量,生长天数
11、,缓慢生长期,对 数 生 长 期,平 衡 期,（1）迟缓期（或延迟期）当细胞接种到培养瓶后，细胞逐渐贴附于瓶底，并恢复贴壁形状，代谢开始旺盛，出现细胞分裂及增殖，但生长缓慢。（2）对数生长期：此期几乎所有的细胞都在进行分裂，细胞数目迅速增长。期细胞倍增时间（TD）等于细胞周期时间（TC）长度。这一期常用细胞倍增时间及细胞分裂指数来判定。（3）平衡期（平坦期）这期细胞数目虽然在增加，但其增加速度在减慢，直至细胞数量不再增加，处于平衡状态。,3.1 原代细胞培养的传代,细胞由培养瓶内分离再培养称之为传代,进行一次分离再培养称之为传一代。原代培养的首次传代是建系的关键时期，细胞需覆盖大部分瓶底后再传
12、代。首次传代时细胞接种数量要多一些，使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增殖。,3.2 细胞传代方法,贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打即可传代；悬浮生长的细胞采用离心分离后传代，,3.2.1 贴壁细胞传代步骤,吸除瓶内旧培养液；加入1ml消化液；37C或室温25 C消化2 5分钟显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大后；直接加少许含血清的培养液，终止消化；细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液计数，分别接种在新的培养瓶内。,3.2.2 悬浮细胞的传代,直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清洗掉1/2 1/3，然后用吸管吹打形成细胞悬液后，再传代。离心法：离心800 1
13、000rpm，5min，除上清，加新的培养液，然后传代接种。部分贴壁生长细胞直接吹打传代或需消化后传代,3.3 细胞系的维持,是通过换液、传代和细胞冻存实现的：建立档案：记录组织来源，生物学特性，培养液要求、传代、换液时间和规律，细胞的遗传学标志，生长形态，常规病理染色的标本等。,3.3 细胞系的维持,防细胞之间的交叉污染，传代时所用器械要编号或做好标记每一种细胞系都应有充足的冻存储备，以防绝种；另外二倍体细胞等有限细胞系如果暂时不用最好冻存以免传代太多，造成细胞衰老或发生改变,4.3.4 培养细胞的纯化,自然纯化自然纯化 即利用某一种类细胞的增殖优势，而排除其它细胞生长，靠自然的增殖潜力最后
14、留下生长优势细胞，去除其它细胞，达到细胞纯化的目的。,4.3.4.2 人工纯化,利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件，抑制其它细胞的生长，从而达到纯化细胞的目的。,3.4.2.1 酶消化法,酶消化法：由于上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同,，成纤维细胞先脱壁，而上皮细胞要消化相当长的时间才脱壁，利用这种差异采用多次差别消化方法将上皮细胞和成纤维细胞分开。,3.4.2.2 机械划除法,机械划除法：上皮细胞和成纤维细胞多数都同时出现，混杂生长常常分区呈片，采用机械的方法去除不需要的细胞区域，而保留需要的细胞。,3.4.2.3 反复贴壁法,成纤维细胞和上皮细胞相比，其贴壁过程快，大部
15、分细胞常能在短时间内大约10 30min完成附着过程（但不一定完全伸展）；而上皮细胞大部分细胞在短时间内不能附着或附着不稳定，稍加振荡即浮起，这样可以利用此差别来纯化细胞,3.4.2.4 克隆法,将细胞分成单个细胞，使之分别生长成克隆，然后对每一克隆进行测试，选择出所需要的克隆。,3.4.2.5 培养基限定方法,某些细胞在生长过程中必须存在或必须去除某种物质，否则将无法生长。而其它细胞与之相反，可以利用这种技术来纯化细胞。如杂交瘤技术常用的HAT培养液，就用来筛选杂交瘤细胞而抑制其它细胞。,4.1 细胞的冻存,冻存细胞要缓慢冷冻。减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损伤的关键。冷冻保护剂的使用，可使
16、细胞免受冰晶形成和渗透压改变而致的损伤。常用二甲基亚砜和甘油。冻存细胞最好每三个月复苏一次，检测细胞原特性是否改变。,细胞冻存步骤,取生长对数期的细胞消化成细胞悬离心细胞记数 2.5x106/ml冻存液加含10%DMSO冻存液熔封置4度数小时，负20度过夜 或-70C放置2-3h移入液氮罐中记录,细胞复苏步骤,取出安瓶立即放入37C水中消毒安瓶开封后将细胞 移入离心管中加培养液离心记数接种培养瓶培养,4.3培养细胞的运输,冷冻储存运输，即利用特殊容器内盛液氮或干冰冻存 充液法：（1）选择生长状态良好的细胞。一般以生长1/3 1/2瓶底壁为宜，换新液，保留微量空气，拧紧瓶盖（2）用棉花等做防震防
17、压处理,5细胞培养污染的检测和排除,培养细胞的污染概念包括所有混入培养环境中对细胞生存生存有害的成份和造成细胞不纯的异物（真菌、细菌、病毒和支原体）、化学物质及细胞,微生物污染的途径,空气：一般培养室环境中每立方米含菌数不应超过1 5个器材：CO2温箱操作血清组织样本,微生物污染的检测,真菌污染细菌污染支原体污染：可做如下检测（1）相差显微镜检测（2）荧光染色法（3）电镜检查（4）DNA分子杂交或支原体培养等方法,微生物污染的防治,防止的关键在于严格无菌操作，把好每一个关口，尽可能禁止其它污染的物品进入培养操作环节：,微生物污染的防治,抗生素：一般用常用量的5 10倍作冲击疗法。用药24 48
18、h后，再换常规培养液。加温处理：根据支原体对热敏感的特点，将受支原体污染的细胞放置在41 C作用5 10h，最长不超过18h，以杀灭支原体。动物体内接种：将支原体污染的细胞接种在同种动物的皮下或腹腔，借动物体内的免疫系统消灭支原体。待一定时间后取出细胞，做原代培养再进行繁殖。,细胞交叉污染,有效防止细胞交叉污染：所有器具要严格区分不要触及培养液瓶瓶口细胞系都要在早期留有充足的冻存储备，可以复苏早期冻存细胞使用。,流式细胞仪分离法,流式细胞仪可根据细胞核酸含量、某些物质含量或细胞结构大小等参数来将细胞分离成不同的群体。,培养细胞生长状态的观察,贴附生长型为能附着于底物表面生长的细胞，悬浮生长型悬
19、浮状态即可生长，如血、骨髓 脾细胞。,培养细胞的生长特性,贴附：附着于底物如其它细胞、胶元、玻璃或塑料，促细胞附着物质如基膜素、纤维连接素、胶元、血清扩展因子可能参加细胞的粘附过程。接触抑制：当两个细胞相互接触时，细胞不再移动，细胞膜皱褶样活动停止。密度依赖性：细胞稀少时生长迅速，融合成片后，分裂停止。,常规观察,需每天观察细胞生长过程中出现的变化：1.培养液的颜色与透明度2.细胞形态变化3.细胞生长状态4.微生物污染,细胞形态变化的观察,相差显微镜：利用光通过不同物质时 的折射和物体厚度差别，产生衍射而引起光程改变，产生相位差的特性，用于观察培养细胞的附着、贴壁、伸展、移动、有丝分裂等形态活
20、动。状态好的细胞透明度大，折光性强，轮廓清楚，分裂期细胞多见。状态差的细胞，失去原来的特点，胞质出现空泡、颗粒，细胞变形，出现死亡。,细胞计数,它是 了解细胞生长状态的量化指标。制备细胞悬液，密度不低于10000细胞/ml，用10 x物镜观察计数板四角大方格的细胞数计数：细胞数/ml原液（4大格细胞数之合/4）X 10000 注意：细胞分散均匀制成单个细胞悬液。,活细胞的染料排除检测法,细胞损伤或死亡时，细胞膜通透性发生变化，某些染料可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色，而活细胞能排出进入细胞内的染料，或阻止这类染料进入细胞内，因而不易着色。借此可以鉴别死活细胞。,细胞活力测定的M
21、TT比色法,原理：活细胞的线粒体脱氢酶能将染料MTT（二甲基噻唑二笨基四唑溴盐）转变为不可溶性的紫色甲替颗粒，后者被酸性异丙醇溶解后所呈现的色度（用OD值表示）反映出生活细胞的代谢水平。死亡细胞则无此酶活性。,细胞培养技术的商业化：对于生物技术所使用的各种细胞株的价值，很难作出评价。1998年，美国市场就达3.5-4亿美元，而且还以6-8%的速度在增长。下边介绍几家美国细胞株供应公司和机构。,美国细胞株供应公司和机构,名 称 网 址 Invitrogan 有关不同细胞株的用户论坛 ATCC 各种细胞株的主要供应者 提供有关细胞株的筛选 Cellsalive 生产各种细胞感染、凋亡其它细胞过程的
22、录象和图片 Gentest 药物代谢试验用的酶和肝细胞主要供应者 Expession Systems 杆病毒细胞株的主要供应者 Life Tech 供应基础研究用的特异化细胞株,方法与结果,96孔板培养细胞，加入20ul MTT液，继续培养4h,吸去上清液，加入100ul二甲基亚枫酶标仪测定光吸收，波长490nm.,细胞分裂指数,计算分裂细胞占全部细胞中比例的方法，以表示细胞的增值程度。一般要计算和观察1000个细胞中的细胞分裂相数。方法：细胞接种于放置小玻片的培养瓶内，每24h取出一个小玻片，95酒精固定，吉姆萨染色。计算出1000个细胞中分裂相平均数值和所占百分比。按所测的百分数逐日顺序绘制成图。,细胞生长曲线,利用细胞计数法进行同一种密度准确接种细胞，以710天能长满而不发生生长抑制为度每天取三瓶细胞计数，连续12周，以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），生长曲线上细胞数量增加1倍时间为细胞倍增时间,
