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1、乳腺癌基因治疗研究进展The research progress of human breast cancer gene therapy,曾 赵 军 中南大学生物科学与技术学院 分子生物学系,2,乳腺癌是严重危害妇女健康的恶性肿瘤。据国际抗癌协会（IARC）公布的统计资料表明，乳腺癌在全世界大多数地区的发病率有逐年增高的趋势，现已成为女性发病率最高的恶性肿瘤。,第一节 乳腺癌基因治疗研究背景,3,乳腺癌的危险因素：(1)与发育、激素水平有关(2)与营养膳食有关(3)与家族史和基因改变遗传因素有关 a.抑癌基因失活 b.癌基因异常(4)其它危险因素,4,乳腺癌肿瘤治疗模式,手术、放疗、化疗、激素
2、治疗是肿瘤治疗的常规模式。这些治疗方法常难彻底消灭肿瘤细胞又易伤及正常组织，特别是伤害机体的免疫系统。目前肿瘤的基因治疗日益受到人们的重视，显示出良好的应用前景。,5,乳腺癌发病的分子机理主要有两个方面：第一、基因表达异常。最常见的基因表达异常是cyclin D1、neu和ras、c-myc 或 Wnt-1 原癌基因过表达。第二、基因结构改变。包括染色体缺失与基因扩增。,第二节 乳腺癌自杀基因治疗的概念、内容与特点,6,Breast cancer gene therapy using tumour suppressor genes,Clinical trials of p53 gene rep
3、lacement have had limited success;PTEN expression alters metastatic potential and reduces neovascularization,7,Prospects,The ability to induce growth arrest and apoptosis Downstream targets of p53 and Rb is necessaryClinical trials of second-generation oncolytic virusesCombinations of tumour suppres
4、sor genes,8,乳腺癌抗体治疗,单克隆抗体Herceptin(贺赛汀)针对HER-2/neu原癌基因的人/鼠嵌合单抗，与细胞表面的erb-B2受体结合,抑制乳腺癌细胞的生长,产生抗体依赖细胞介导的细胞毒作用。,免疫基因治疗,指在基因水平，通过诱发或加强机体内针对肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原（TAAs）的特异性免疫反应，调动宿主的免疫系统来识别并破坏癌细胞。乳腺癌组织表达多种TAAs，包括HER-2/neu（c-er-2）、MACG-1和MUC-1等，机体针对这些TAAs产生一定的特异性体液和细胞免疫反应。,将编码促进免疫反应的细胞因子的基因直接在体内转染到肿瘤细胞内，或在体外将这些基因转
5、染到肿瘤细胞内，在肿瘤细胞经放射线照射灭活后，自身移植于体内，以增强免疫反应。包括IL-2、IL-12、干扰素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等。,10,采用特异的靶抗原作为疫苗对肿瘤的免疫反应更有效。目前用于乳腺癌免疫治疗的特异抗原包括HER-2、CEA、MAGE-1、MUC-1等。采用基因工程将编码这些抗原的基因修饰后，克隆到逆病毒载体，转入体内；或在体外采用基因工程，将这些抗原的不同抗原簇克隆，产生不同抗体，筛选出能抑制肿瘤细胞生长的抗体。赫赛汀（Herceptin）就是针对c-er-2细胞外区域不同抗原簇的人单克隆抗体。它可有效抑制c-er-2的下游信号传导，从而抑制乳腺
6、癌细胞的生长。,特异性靶抗原的免疫治疗,肿瘤抑癌基因治疗,野生型p53基因具有通过调控视网膜母细胞瘤基因控制细胞凋亡、抑制细胞增殖的作用。但是，由于乳腺癌细胞中p53易突变而失活，影响了p53基因治疗乳腺癌应用。在乳腺癌家族中发现抑癌基因BRCA1常存在突变而表达过低。在乳腺癌动物模型中采用装有BRCA1的逆病毒载体，直接注射入瘤内，可抑制晚期乳腺癌胸壁转移瘤的生长。,化学基因治疗,将耐药基因，如多药耐药基因（MDR）转入造血干细胞，然后自体回输以增加化疗药物剂量，增强疗效，也不影响机体的造血系统。Cowan等将4例乳腺癌病人的造血细胞提取后，体外转染MDR基因，并且在体外应用大剂量化学药物杀
7、死可能污染的肿瘤细胞后，将转染了MDR的造血细胞自身移植。给予大剂量的化学药物治疗后，3例病人移植细胞中仍可检测到MDR的表达，转染MDR的细胞存活率与骨髓抑制成反比，无严重毒副作用发生。,药物前体激活基因治疗（GPAT）可以利用正常和肿瘤细胞之间的某一基因转录差异，选择性驱动表达导入肿瘤细胞内的无活性化疗药物前体转化为有活性的代谢产物，特异性杀伤肿瘤细胞。氟脲类药物对乳腺癌有杀伤作用，但5-氟胞嘧啶核苷酸（5-FC）作为药物前体，对细胞无杀伤作用，而它在嘧啶脱氨酶的转化下，可代谢为有活性的5-FU（5-氟尿嘧啶）而具有杀伤肿瘤细胞的能力。,化合物中筛选出一种名为维生素B17的化合物。维生素B
8、17可以通过竞争性结合ATP，不可逆地抑制c-er-2活性，而不影响其蛋白表达。动物实验表明，维生素B17可使c-er-2过度表达的乳腺癌肿瘤缩小。,显性基因敲除治疗,敲除显性的癌基因，削弱肿瘤的生长和浸润能力。研究表明，一种myc反义核酸对雌激素依赖型和非依赖型乳腺癌细胞均有抑制作用，转化生长因子（TNF-）的反义信使RNA能够抑制雌激素诱导的雌激素反应性乳腺癌细胞的增殖。,抗血管生成基因治疗,抗血管生成基因的因子包括内皮抑素、血管抑素和干扰素-。基于肿瘤和正常内皮细胞之间基因表达的差异，选择性抑制肿瘤内皮细胞中异常基因的表达，抑制肿瘤血管生成，从而达到治疗肿瘤的目的。最强的血管生成细胞因子
9、是VEGF。反义核酸，可溶性VEGFR、核糖酶、抗VECF单克隆抗体和受体酪氨酸激酶（RTK）抑制剂已被用于抗肿瘤血管生成的基因治疗。,18,自杀基因治疗乳腺癌的作用机理,病毒载体,病毒蛋白,自杀基因,药物前体,毒性代谢物,乳腺癌细胞,直接杀伤癌细胞,通过旁观者效应杀伤癌细胞,19,自杀基因 HSVtk 编码胸腺嘧啶激酶，在细胞内，自杀基因HSVtk 能将核苷类似物 GCV 磷酸化，使其进一步代谢为三磷酸 GCV，抑制细胞 DNA 聚合酶，影响 DNA合成，导致细胞死亡，达到清除肿瘤的目的。,20,存在的问题？,目的基因的表达不受控制，存在过度表达或不适当表达，特别是当插入基因是一些毒性的基因
10、或对机体有影响时，不仅对疾病的治疗不利，甚至会导致致命的副作用。,21,特异性的转录调控元件使治疗基因准确、有效地表达于肿瘤细胞，使治疗基因的表达受体外因素的调控，提高基因治疗的有效性和可控性，是基因治疗领域的一个重要问题。,第三节 乳腺癌自杀基因调控治疗,22,乳腺癌基因治疗的调控元件,1)乳腺癌相关基因：erbB-2、Muc-1、p53、BRCA1、BRCA2、nm23、p16等；2)组织特异性基因:雌激素反应元件(ERE)、人乳白蛋白基因(hALA)、羊乳球蛋白基因(oBLG)等；3)缺氧反应元件(HRE)等。,23,Tet 基因表达调控系统,Tet 系统利用大肠杆菌抗四环素操纵子 的阻
11、遏与去阻遏作用来调控基因表达，使基因表达受四环素的精确调控。Tet 激活系统（Tet-On）是突变的 tet 阻遏蛋白与 VP16 的激活域融合表达 rtTA,强力霉素存在时，rtTA 与 tetOp 结合，激活靶向转录。,24,Tet-On 调节乳腺癌细胞株 HSVtk 表达及 体外调控性治疗作用的实验研究,25,重组逆转录病毒载体 pRevTRE/tk的构建,PCR 扩增获得HSVtk 基因DNA 片段，设计引物时，在引物 TK1 的 5加上BamH酶切位点，引物 TK2 的 5 加上Hind 酶切位点，定向克隆到pRevTRE质粒上,得到pRevTRE/tk质粒。,26,重组逆转录病毒载
12、体 pRevTRE/tk的鉴定,M 1 2,图 1 重组质粒 pRevTRE/tk的 酶切鉴定结果M:DNA/Hind DNA Markerlane 1:pRevTRE/HSVtk/Bam HI+Hind;lane 2:pRevTRE/HSVtk plasmid DNA,图 2 重组质粒pRevTRE/tk 的PCR鉴定结果M:100bp DNA ladder Marker;lane 1:PCR product with primer TK1 and TK2;lane 2:PCR product with primer TK3 and TK4,27,MCF-7细胞转染实验,MCF/TRE/tk
13、/Tet-On,28,Tet-On 基因调控系统中，其发挥作用所需的两个组成元件：TRE 元件和rtTA 元件，分别克隆于两个载体系统中。使用时先将含有TRE元件和目的基因转染入宿主细胞，然后再以含有 rtTA 的质粒转染该细胞，经过两次转染而构建出细胞株。,29,MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞 HSVtk 基因的表达,图 3 Dox 调节 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞中 HSVtk 基因的表达 M:100 bp DNA Marker;Lane 1-6代表 Dox 浓度为0，0.1，1，10，100,1000 g/ml时细胞HSVtk 基因的表达,30,MTT 法检测分析
14、 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞存活率,图 4 在 Dox 浓度为 1g/ml 时，MTT 法检测 GCV不同浓度时 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞存活率的变化,31,Dox 浓度对 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞生长的影响,图 5 GCV 浓度为 1 g/ml 时，不同浓度 Dox 对 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞存活数的影响,32,旁观者效应,表 1 MCF/TRE/tk/Tet-On 细胞旁观者效应的克隆记数,33,可调控性自杀基因乳腺癌动物模型的建立,以表达 HSVtk基因及调控系统 Tet-On 的乳腺癌细胞 MCF/TRE/tk/Tet-O
15、n 直接接种SCID 小鼠成功建立了可调控性自杀基因乳腺癌动物模型，为探讨自杀基因体外调控机制的研究奠定了基础。,34,SCID小鼠体内成瘤及治疗前后肿瘤大小的变化,图 6 乳腺癌细胞 MCF/TRE/tk/Tet-On 接种 SCID小鼠后，NS组、GCV组、GCV+Dox组 SCID小鼠肿瘤体积的变化,35,SCID小鼠肿瘤组织病理学观察,图 7 三组（NS组、GCV组、GCV+Dox组）SCID 乳腺癌小鼠 经治疗15天后肿瘤组织病理学观察 H-E染色（250）NS 对照组;GCV 治疗组;Dox+GCV 治疗组,36,RT-PCR 检测 SCID小鼠肿瘤组织 HSVtk的表达,M 1
16、2 3,图 8 RT-PCR 检测各组 SCID小鼠肿瘤治疗15天后 HSVtk的表达M:100bp Marker;1.GCV治疗组;2.Dox+GCV治疗组;3.NS 对照组,37,研究背景,逆转录病毒载体用于 ex vivo基因治疗，实际感染效率低。原因:一、感染正在分裂的细胞；二、获得病毒滴度低；三、病毒半衰期短，移动距离有限,在一个半 衰期内大多数病毒不能到达靶细胞。,重组逆转录病毒介导的 HSVtk基因 表达及提高逆病毒滴度的初步研究,38,逆转录病毒的纯化,将初步浓缩的病毒液经冷冻干燥去除更多的水分，以小体积的缓冲液（DMEM）复溶后70冻存得到浓缩病毒液。,39,产毒 PA317
17、 阳性细胞克隆筛选培养,图 14 微乒乓感染 pRevTRE/HSVtk、pRevTet-On、pRevTRE 载体的 PA317 细胞经潮霉素B、G418 筛选2周后形成的抗性克隆(100),40,不同培养时间与重组病毒滴度的关系,图 9 不同培养时间对克隆 PA317 细胞产生重组 病毒滴度的测定,41,不同丁酸钠浓度和重组病毒滴度的关系,0 5 10 15 20,图 10 不同丁酸钠浓度下对克隆 PA317 细胞培养 30h 产生重组病毒滴度的测定,42,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测有无病毒蛋白表达,图 11 克隆 PA317 细胞上清 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳M：蛋白质分子标准；L
18、ane 1：pRevTRE DNA转染 PA317 30 h 后细胞上清；Lane 2：pRevTRE/tk DNA转染 PA317 30 h 后细胞上清,43,PCR 检测克隆的细胞上清有无 HSVtk 基因插入片段,图 12 转染 PA317细胞上清 PCR 扩增 HSVtk 基因M：100 bp DNA 标准物；Lane 1：pRevTRE/tk DNA转染 PA317 30 h 后细胞上清；Lane 2：pRevTRE DNA转染 PA317 30 h 后细胞上清,44,RT-PCR 检测被逆转录病毒浓缩液感染的 MCF-7 细胞中 HSVtk 基因的表达,-actin420 bp,图
19、 13 逆转录病毒浓缩液感染的 MCF-7细胞中 HSVtk 基因的表达M：100 bp DNA 标准物；Lane 1：MCF-7 细胞；Lane 2：被重组逆转录病毒液感染的 MCF-7 细胞,45,产毒性细胞系分泌重组病毒的 PCR鉴定,图 15 pRevTRE/tk、pRevTet-On、pRevTRE 乒乓转染的 PA317 细胞上清PCR 扩增目的基因M：100 bp ladder marker；1：转染 pRevTRE/HSVtk 质粒载体的克 隆 PA317 细胞上清；2：转染 pRevTet-On 质粒载体的克隆 PA317 细胞上清；3：转染 pRevTRE质粒载体的克 PA
20、317 细胞上清,46,重组病毒感染 MCF-7 细胞及阳性克隆细胞株的筛选,图 16 重组病毒感染 MCF-7 细胞后筛选的潮霉素B和 G418 抗性克隆(100),可调控性重组逆转录病毒在乳腺癌基因治疗中的实验研究,47,制备重组逆转录病毒 RevTRE/HSVtk 和 RevTet-On，然后通过逆转录病毒感染靶细胞，将 Tet-On 基因调控系统中的反应元件 TRE 和 rtTA 调控元件共同整合到同一宿主细胞中，使目的基因导入靶细胞，并处于 Tet-On 基因的有效调控，同时也提高了外源目的基因的转导效率。,48,病毒感染细胞基因组 DNA 的提取与酶切,图 17 病毒感染细胞基因组
21、 DNA 的提取与酶切图M：Lambda DNA/EcoRI+Hind DNA Marker；1：逆病毒 RevTRE/HSVtk 和 RevTet-On 感染 MCF-7 细胞基因组 DNA；2：MCF-7 细胞基因组 DNA；3：MCF-7 细胞基因组 DNA EcoRI酶切；4：逆病毒 RevTRE/HSVtk、RevTet-On 感染 MCF-7 细胞基因组 DNA EcoRI酶切,49,逆病毒感染细胞 Southern印迹杂交分析,M 1 2 3,图 18 细胞 Southern 印迹杂交分析图 M：100 bp ladder marker；1：MCF-7 细胞；2：逆病毒 RevT
22、RE/HSVtk、RevTet-On 一次感染的 MCF-7 细胞；3：逆病毒 RevTRE/HSVtk、RevTet-On 重复感染的 MCF-7细胞,50,利用微乒乓感染的方法将制备的重组逆转录病毒 RevTRE/HSVtk 和 RevTet-On 导入乳腺癌细胞株 MCF-7 细胞。实验中观察到，HSVtk 基因的表达受 Dox 的诱导调控，随着 Dox 的浓度增高，GCV 对乳腺癌细胞的杀伤能力加强。,51,台盼蓝排斥试验和细胞计数分析检测细胞活力,图 19 不同 Dox 浓度诱导下台盼蓝排斥试验和细胞计数,52,MTT 法检测重组病毒感染的 MCF-7 细胞不同药物浓度诱导 24 h
23、 的存活率,n=4,n=4,53,流式细胞分析,图 20 流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡图1：MCF-7 细胞；2：逆病毒 RevTRE/HSVtk、RevTet-On 感染的 MCF-7 细胞；3：1g/ml Dox、2g/ml GCV 作用 48 h 的逆转录病毒感染 MCF-7 细胞,54,流式细胞仪（FCM）检测细胞周期,图 21 流式细胞仪（FCM）检测细胞周期图 1：MCF-7 细胞；2：逆病毒RevTRE/HSVtk、RevTet-On 感染的 MCF-7 细胞；3：1g/ml Dox、2g/ml GCV作用 48 h 的逆转录病毒感染 MCF-7 细胞,55,半定量 RT-P
24、CR 的方法探讨重组逆转录病毒感染MCF-7 细胞在 Dox不同浓度诱导下自杀基因的表达,56,TUNEL分析,图 22 TUNEL法检测逆转录病毒感染 MCF-7 细胞镜下改变（1040）1：MCF-7 细胞在 DMEM 完全培养基条件下培养 48 h；2：1g/ml Dox、2g/ml GCV作用 48 h 的逆转录病毒感染 MCF-7 细胞；“”示凋亡小体。,57,BALB/c裸鼠乳腺癌移植瘤模型的建立,58,通过逆病毒直接注射将调控因子 Tet-On 基因及反应元件 TRE 转入到乳腺癌细胞株 MCF-7 裸鼠成瘤模型内，使得裸鼠的体内肿瘤能受到外源诱导剂 Dox 的诱导控制，使自杀基
25、因 HSVtk 转录与表达受到Tet-On 系统的调控，并激活前药 GCV，在体内发挥杀瘤作用。,59,BALB/c裸鼠移植瘤的抑瘤实验,60,BALB/c裸鼠移植瘤的抑瘤实验,A：DMEM 组；B：GCV+Dox 组；C：GCV+病毒组；D：Dox+GCV+病毒组,61,BALB/c裸鼠移植瘤治疗结束后湿重,62,M:100 bp Marker；1：DMEM 组荷瘤裸鼠肿瘤；2：GCV+Dox 组荷瘤裸鼠肿瘤；3：GCV+病毒组荷瘤裸鼠肿瘤；4：Dox+GCV+病毒组荷瘤裸鼠肿瘤,RT-PCR 检测 BALB/c 荷瘤裸鼠治疗35天后肿瘤 HSVtk 的表达,63,BALB/c裸鼠移植瘤的病理形态学检测,A,B,D,A：DMEM 组；B：GCV+Dox 组；C：GCV+病毒组；D：Dox+GCV+病毒组,C,乳腺癌自杀基因调控治疗的问题与展望,靶组织特异性调控特异性杀瘤有效性,64,
