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1、Method for the determination of amnesic shellfish poison in shellfish for import and exportSN/T10702002前言本标准是按照GB/T 1.1 1993标准化工作导则第1单元：标准起草与表述规则第1部分：标准编写的基本规定及SN/T 0001 1995出口商品 中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定的要求而进行编写的。其中测定方法是参考有关文献中所载的贝类中记忆丧失性贝类 毒素分析方法，经研究、改进和验证后，按规定格式编写的。在标准中同时制定了抽样方法和制样方法。本标准测定低限是根据
2、国际上对贝类中记忆丧失性贝类毒素的最高限量和本测定方法的灵敏度而制定的。 本标准的附录A为提示的附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：唐守亭、卫锋、宋文斌、陈明生。 本标准首次发布。1 范围 本标准规定了海产双壳类贝肉、贝柱、外套膜及其制品的记忆丧失性贝类毒素检验的抽样、制样和液相色谱测定方法。 本标准适用于进出口海产双壳类贝肉、贝柱、外套膜及其制品(不包括盐渍制品)的记忆丧失性贝类毒素的检验。2 抽样和制 样2.1 检验批以不超过10 00为一检验批，同一检验批以商品应具有相同的特征，如包装、标记、产地、
3、规格和等级等。2.2 抽样数量表 1不同批量抽样数量批量/箱最低抽样数/箱150及以下31513 20083 201 10 000132.3 抽样方法按2.2规定的抽样箱数随机抽取，逐件开启。每箱至少取500及时送实验室。2.4 分析样品的采集作g 为原始样品，原始样品总量不得少于2 k装入盛样器内，加封后，标明标记，分析样品要有充分的代表性，取样个数不少于12个贝类个体，即从2 k混合样品中挑选良好的贝去壳，去壳肉量应达200。g 对于个体过小的品种，则以去壳后肉量不少于200来g 决定采集个数。2.5 试样制备2.5.1 生鲜贝类 先用清水将贝壳外表彻底洗净，然后切断闭壳肌、开壳，用清水淋
4、洗内部去除泥沙及其他外来物。将闭壳肌和连接在胶合部的组织分开，仔细取出贝肉，切勿割破肉体。开壳前不得加热或用麻醉剂。将收集的200质。2.5.2 冷冻贝类贝g 肉置于10号筛子中沥水5 min不要使肉堆积)，检出碎壳等杂物，将贝肉均进出口 贝类 中记忆丧 失性 贝类 毒素 检验 方法2.5.3 贝类罐头在室温下，使冷冻的样品(带壳或脱壳的)呈半冷冻状态，按2.5.1方法开壳、淋洗、取肉、均质。均质。2.5.4 贝肉干制品 干制品可于水中浸泡(冷藏)，按2.5.3方法沥干、均质。2.6 试样保存将上述2.5中处理的样品于-18以下冷冻保存。注： 抽样和制样的操作过程中，必须防止样品受到污染或发生
5、软骨藻酸含量变化。3 测定方法3.1 方法提要样品以甲醇/水提取，经LC-SAX强阴离子柱固相萃取(SPE)净化，用反相液相色谱紫外检测器测定，外标法定量。3.2 试剂和材料3.2.1 水：Milli-Q系统净化。3.2.2 甲醇：色谱纯。3.2.3 乙腈：色谱纯。3.2.4 三氟乙酸：优级纯。3.2.5 一水柠檬酸：优级纯。3.2.6 柠檬酸三铵：优级纯。3.2.7 乙腈/水(19，)。3.2.8 0.5 mol柠/L檬酸溶液(pH=3.2)：40.4后，以水定容至500 m。L一g 水柠檬酸和14.0柠g 檬酸三铵溶解于400 m水中，以浓氨水调pH为3.2，加入50 m腈，完全溶解3.2
6、.9 L-CSAX柱：3 mL(Supelco,USA，) 或相当者。3.2.10 软骨藻酸标准储备液：DACS-1C (100,National Research Council Cana，da或) 相当者。3.2.11 软骨藻酸标准溶液：以乙腈/水(19，)稀释标准储备液(3.2.10)分别配成为含软骨藻酸0.1、0.5、1.0、2.5、10.0、25.0 的标准工作溶液。3.3 仪器和设备a) 高效液相色谱仪：配有二极管阵列或紫外检测器。b) 组织均质器：最大转速20 000 r/m。inc) 台式高速离心机：最大转速6 000 r/m。ind) 涡旋混匀器。e) 超声波清洗器。f) 离
7、心管：50 m。g) 容量瓶：25 m50 m。将罐内所有内容物(肉及液体)倒入均质器充分均质。如果是大罐，将贝肉沥汤并收集沥下的汤汁，分别称量，将固形物和汤汁按比例混合、充分h) 微量进样器：10 。3.4 测定步骤3.4.1 提取中，以水定容至刻度，混匀。3.4.2 净化取上述粗提取液5.0 m移入依次经6 m甲醇，3 m水，3 m甲醇/水(11，/)处理过的LC-SAX柱上，待液体以1滴/s的速度流出后，再依次用5 m腈/水(19，/)，0.5 m檬酸洗脱液以1滴/s的速度过柱，弃去流出液，最后用2 m檬酸洗脱液洗脱吸附在柱上的软骨藻酸，供色谱测定。注： 在液体过柱时，当液体凹液面下端与
8、柱填料上端水平时，停止液体流出，避免LC-SAX柱填料与空气接触。3.4.3 测定3.4.3.1 色谱条件a) 色谱柱：Zorbax S-BC18，1504.6 mm(i.d.),5，或相当者；b) 流动相：乙腈/0.1%三氟乙酸(1387，/)；c) 流速：1 mL/mi；nd) 进样量：10 ；e) 测定波长：242 n；f) 柱温：室温。3.4.3.2 色谱测定 根据样液中软骨藻酸含量情况，选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中软骨藻酸响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件下，软骨藻酸的保留时间约为6.6 miA1。3.4.4
9、空白试验 除不加试样外，按上述测定步骤进行。3.5 结果计算和表达用色谱处理机或按式(1)计算试样中软骨藻酸含量：软骨藻酸标准溶液液相色谱图见附录A(提示的附录)中图称取试样5.0 g(精确到0.1 g)于50 mL加盖离心管中，加入10 mL甲醇/水(11，/)溶液，涡旋混匀1 min，超声提取5 min，以4 000 r/min离心20 min，使固液两相彻底分离。移出上清液至25 mL容量瓶中，残渣再加入5 mL甲醇/水(11，/)重复提取两遍，上清液均移入25 mL容量瓶(1 )式中：试样中软骨藻酸含量，mg/kg；样液中软骨藻酸峰面积，mm2；s标准溶液中软骨藻酸峰面积，mm2；s标准溶液中软骨藻酸浓度，； 最终样液代表的试样量，g； V样液最后定容体积，mL。注： 计算结果需扣除空白值，报告结果时以贝类中可食组织部分的软骨藻酸的含量(mg/kg)报告结果。4 测定低限、回收率4.2 回收率及回收率的实验数据4.1 测定低限 本方法的测定低限为0.2 mg/k。g5 mg/k，回收率为96.00%；在0.2 mg/kg时，回收率为96.52%；10 mg/k时g ，回收率为96.10%；20 mg/k时g ，回收率为96.80%。附录（提示的附录） 软骨藻酸 标准样品色 谱图图 A1软骨藻酸标准样品液相色谱图
