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1、中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖 犜 代替 猪繁殖和呼吸综合征检疫规范犙犲狀犻狋犪狀狉犪狌狆犾狉狅犮狅犳狋狅狉狆犲狀犻犲犮狉狅狆犲狏犻犪狀狋犱犮狅犱狌狉狊犲狉狆狉狅狋犪狉犻狔 狊狔狅狀狉犱犿犲 发布 实施中华人民共和国发 布国家质量监督检验检疫总局犜 犛犖前 言本标准代替 猪繁殖和呼吸综合征间接免疫荧光试验和 猪繁殖和呼吸综合征免疫过氯化物酶单层试验。本标准的附录 、附录 、附录 和附录 是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫 局 、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起
2、草人：孙颖杰、张伯强、白泉阳、苏永生、简中友、袁文泽、赵祥平、董志珍。本标准所代替标准的历次版本发布情况为： ； 。猪繁殖和呼吸综合征检疫规范 范围本标准规定了猪繁殖和呼吸综合征（）的检疫规范。本标准适用于猪繁殖和呼吸综合征的病毒分离鉴定、病毒抗原监测、病毒抗体检测，可用于该病的检疫、诊断和流行病学调查。 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。 凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而 ，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 猪繁殖和呼吸综
3、合症诊断方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。免疫过氧化物酶单层试验 犻犿犿狌狀狅狆犲狊犱犪犻狓狅狉犪犲犿犾狅狀狅狔狉犪犲狊狊犪狔 （犐犘犕犃）培养的单层细胞，接种病毒或处理过的被检样品，让 细胞感染，经组织固定和内源酶处理，加被检血清 或 阳 性 抗 体 处 理，再 加 酶 标 抗 抗 体，经 过 显 色 反 应 检 测 抗 原 或 抗 体 的 存 在。 在诊断上最早用于检测其抗体。 间接免疫荧光试验犫犱狅狋犻狀犲犮狋狊犪狀犲狉狅狌狋犾犮犲犳狉犻狀犱犻狔狋狊犲狋（犐犉犃）成切片或涂片的标本经过固定后，加抗血清处理，再加荧光标记的抗抗体染色，漂洗，滴加缓冲甘油后用盖玻片封载，用荧光显微
4、镜进行检测。 检测抗体，可用于早期诊断。 疾病概述猪繁殖 和 呼 吸 综 合 征（ ，）， 也 称 为 蓝 耳 病（）， 是由 猪 繁 殖 和 呼 吸 综 合 征 病 毒（ ，）引起的以母猪繁殖障碍和仔猪及育成猪呼吸困难为特征的接触性传染病。 繁殖障碍的特征是流产、死胎和产弱仔，弱仔由于呼吸道疫病和继发感染常常很快死亡；呼吸道特征是仔猪及育成猪呼吸困难，年龄较大的猪可能出现温和性呼吸道症状，有时因继发感染而使病情复杂。 其病原、流行 病学、诊断以及检疫与诊断参见附录 。 检疫方法 病毒的分离与鉴定（见 ） 设备、材料和试剂 器材：孔或孔细胞培养板、微量移液器、恒温水浴箱、二氧化碳恒温箱、普通冰
5、箱及低温 试剂：培养液、犊牛血清、青霉素（ ）与链毒素（碳酸氢钠溶液等。冰箱、离心机及离心管、组织研磨器、孔径 的微孔滤膜、普通光学显微镜。 ）溶液、犛犖 犜 细胞：猪原代肺泡巨噬细胞培养物（）或 猪获取，并经批次检验合格，制备和检验方法参见附录 。 提供。 样品的采取和送检或 细胞。 由无或 细胞由国家指定单位在发病早期，无菌采取病猪的血清或腹水。 对病死猪（如流产的死胎）和扑杀猪（如弱胎猪）， 应立即采取肺、扁桃体和脾等组织，置 保存，立即送实验室检疫。 不能立即送检者，应置 冰 箱中，或加甘油生理盐水， 保存送检。 样品的处理血清和腹水可直接使用。 肺 、脾和扁桃体等组织经处理后可单独使
6、用，也可混合使用。 各组织剪碎后研磨成糊状，加入培养液，制成悬液，犵 离心 ，吸取上清液，加入青霉素 、链霉素 、庆大霉素 和两性霉素 。 怀疑有细菌污染的样品，可用 操作方法 微孔滤膜过滤处理。 稀释样品取细胞培养板 每 孔 加 入 细 胞 培 养 液（含 犊 牛 血 清、青 霉 素 、链 霉 素 、两性霉素 、 ） ，在 和 孔内加入同一份已处理的样品各 （样品倍稀释）。将板轻轻摇动后，从 和 排孔各取 分别移入和 排孔内（样品倍稀释）。除第 列和第列留作正常细胞对照外，其他各孔的样品稀释方法同上。 振动稀释板后加盖 ，置 冰箱内保存备用。 制备细胞板已建立的某些猴肾细胞系不能支持所有分离
7、物特别是欧洲型病毒株的良好生长，因此病毒分离应首选细胞，先将细胞泥用细胞培养液稀释，使细胞终浓度为 个 ，或将 或 细胞用营养液稀释，细胞终浓度 个 。 然后，在另一换孔细胞培养板上每孔加入上述细胞悬液 ，于 二氧化碳恒温培养至形成单层细胞。按照上述操作，每板可检测份样品，每份样品重复两个滴度。 第 列和第列留作正常细胞对照 （不接种样品）。 接种样品由样品稀释板每孔内各吸取稀释的样品液 ，接种于已形成细胞单层的细胞板相应的孔内（第 一代）。细胞板加盖后 ，放入 二氧化碳保湿恒温箱中培养，每天观察致细胞病变作用（）， 连 续观察 。通常在接种后 内出现，主要呈现细胞圆缩、聚集、固缩，最后溶解脱
8、落 。 培养物盲传根据第一代培养物出现的情况（通常在接种后的第 ）安排盲传。 盲传时，不论有无，一 律 各 取 孔 内 混 悬 液 ，移 入 新 细 胞 板 相 应 的 孔 内。 再 于 二 氧 化 碳 恒 温 箱 培 养 ，每天观察。 结果的判断和解释在第二代培养结束时，不论是否出现，对所有的孔应采用免疫过氧化物酶单层试验（）或间接免疫荧光试验（）进行终判；其结果呈现阳性反应的，则被认定为病毒分离阳性。 免疫过氧化物酶单层试验（犐犘犕犃）（ 见 ） 材料准备 器材：微量移液器、倒置显微镜等。 试剂：诊断板的制备参见附录 ；标准阳性血清、标准阴性血清和兔抗猪过氧化物酶结合物均由国家指定单位提供
9、，使用前按说明书规定稀释至工作浓度；洗涤液、血清稀释液和显色 底物溶液参照附录 自行配制。犛犖 犜 样品：采集被检猪血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无 污 染，密 装 于 灭 菌 小 瓶 内。或 冰箱保存或立即送检。 试验前将被检血清统一编号，并用血清稀释液作倍稀释。 操作方法 取已作倍稀释的被检血清加入诊断板同一排相邻的 个病毒感染细胞孔（）和其后的 个未感染细胞孔（）内 ，每孔 ，同时设立标准阳性血清、标准阴性血清和空白对照，以 血清稀释液代替血清设立空白对照，封板并于条件下过夜。 弃去板中液体，用洗涤液洗板 次 ，每孔 ，每次拍干。 ，最后在吸水纸上轻轻 每孔加入工作浓度的兔抗
10、猪过氧化物酶结合物 ，封板后放在保温盒内于恒温箱中感作。 弃去板中液体，洗涤 次 ，方法同。 每孔加入显色 底物溶液 ，封板于室温（ ）下感作。 弃去板中液体，洗涤 次 ，方法同待检。 结果判定与解释，再用三蒸水洗涤 次 ，最后在吸水纸上轻轻拍干，将 诊断板 置 于 倒 置 显 微 镜 判 读。 在 对 照 标 本 都 成 立 的 前 提 下， 即 空 白 对 照 感 染 细 胞 孔（ ）和未感染细胞孔（ ）均应为阴性反应；标准阳性血清对照感染细胞孔（ ）应呈典 型阳性反应，未感染细胞孔 （ ）应为阴性反应；标准阴性血清对照感染细胞孔（ ）和未感染细胞孔（ ）均应呈阴性反应；被检血清未感染细胞
11、孔（）不应出现阳性反应。 被检血清标本的 细胞浆（可能仅见于部分细胞）出现弥漫状或团块状棕红色着染者，判读为免疫过氧化物酶单层试验阳性 ，记作（ ）； 无 棕 红 色 着 染 者， 判 读 为 免 疫 过 氧 化 物 酶 单 层 试 验 阴 性， 记 作（ ）。（ ）者表明被检猪的血清中含有病毒的抗体。 间接免疫荧光试验（犐犉犃）（ 见 ） 材料准备 器材荧光显微镜、恒温箱、保湿盒、微量移液器等。 试剂 诊断板的制备：参见附录 。 兔抗猪异硫氰酸荧光素（）结合物、标准阳性血清和标准阴性血清，由国家指定单位 提供。 样品采集被检猪血液，分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内
12、，或 冰箱保存或立即送检。 试验前将被检血清统一编号，并用液作倍稀释。 操作方法 取 诊断板，编号，弃去板中的乙醇溶液，置超净工作台中风干，每孔加 液洗 次 ，弃去液并在吸水纸上轻轻拍干。 在编号对应的孔内加入倍稀释的被检血清：同一排相邻的感染细胞孔 个及其后感染细胞孔 个 ，每孔 ，同时作标准阴、阳性血清及空白对照，空白对照是用液代替血清。 置 恒温箱中感作。 弃去板中血清，用 液洗板 次 ，每孔 ，每次，最后在吸水纸上轻轻拍干。 每孔加入工作浓度的兔抗猪结合物 ，在 恒温箱中感作。 弃去板中液体，用 液洗板 次 ，方法同。犛犖 犜 荧光显微镜检查及判定与解释荧光显微镜采用蓝紫光（激发滤板通
13、常用，吸收滤板用或 ）， 在 倍 倍下检查 。 标准阳性血清对照中感染细胞孔（ ）应出现典型的特异性荧光，而未感染细胞孔（ ）不应出 现 特 异 性 荧 光， 标 准 阴 性 血 清 对 照、 空 白 对 照 中 感 染 细 胞 孔（ ） 和 未 感 染 细 胞 孔（ ）均不应出现特异性荧光；被检血清对照中未感染细胞孔（ ）不应出现特异性荧光。 被 检血清样品感染细胞孔（ ）出现特异性胞浆亮绿色荧光判为阳性；否则，判为阴性。 间接酶联免疫吸附试验（间接犈犛犔犐犃）（ 见 ） 材料准备 器材孔平底微量反应板、微量移液器、酶标仪、恒温箱、保湿盒等。 试剂 病毒抗原和正常细胞对照抗原，由国家指定单位
14、提供。 使用前，按说明书规定用抗 原稀释液稀释至工作浓度。 兔抗猪 辣根过氧化物酶结合物（简称酶标抗体）由国家指定单位提供。 使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。 血清稀释液稀释至工作浓度病毒标准阳性血清和标准阴性血清。，由国家指定单位提供。 使用前按说明书规定用 抗原稀释液、血清稀释液、洗涤液、封闭液、底物溶液、终止液等，参照附录 自行配制。 样品采集被检猪血液分离血清，血清应新鲜、透明、不溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，或 冰箱保存或立即送检。 试验前将被检血清统一编号，并用血清稀释液作倍稀释。 操作方法 包被抗原：取 孔平底微量反应板，于奇数列加工作浓度的病毒抗原，偶数列加工作
15、浓度的对照抗原，每孔 （参见表 ）， 封板，置保湿盒内放恒温箱中感作过夜。 ，再移置冰箱内表 间接犈犛犔犐犃诊断板加样表 注 ： 为 病毒抗原包被列； 为正常细胞抗原包被列； 为标准阳性血清对照孔； 为标准阴性血清对 照 孔 ； 、 、 等为被检血清编号。 洗板：弃去板中包被液，加洗涤液洗板，每孔 ，洗涤 次 ，每次拍干。 封闭：每孔加入封闭液 ，封板后置保温盒内恒温箱感作，在吸水纸上轻轻。犛犖 犜 洗涤：方法同。 加血清：反应板按表 编号后，对号加入已作稀释的被检血清、标准阳性血清和标准阴性血清 。 每份血清各加两个病毒抗原孔和两个对照抗原孔，孔位相邻。 每孔加样量均为 。 封板，置保湿盒内
16、于恒温箱中感作。 洗板：方法同。 加酶标抗体：每孔加工作浓度的酶标抗体 ，封板，放保温盒内置恒 温 箱 中 感 作。 洗板：方法同。 加底物：每孔加入新配制的底物溶液 ，封板，在 恒温箱中感作。 加终止液：每孔添加终止液 终止反应。 光密度（犗犇 ）值测定与计算 犗犇值测定在酶标测定仪上用 读取反应板各孔溶液的值 ，记入专用表格。 犗犇值计算按下式分别计算标准阳 性 血 清、标 准 阴 性 血 清 和 被 检 血 清 与 个 平 行 抗 原 孔 反 应 的值 的 平 均值。标准阳性血清（ ）与病毒抗原（ ）反应的均值 （ ）按式（ ）计算： （ ） （ ）式中： 阳性血清对照平均值； 孔 值
17、； 孔 值 。标准阳性血清（ ）与对照抗原（ ）反应的均值 （ ）按式（ ）计算： （ ） （ ）式中： 阳性血清空白对照平均值； 孔 值 ； 孔 值 。标准阴性血清（ ）与病毒抗原（ ）反应的均值 （ ）按式（ ）计算： （ ） （ ）式中： 阴性血清对照平均值； 孔 值 ； 孔 值 。被检血清（ ）与病毒抗原（ ）反应的均值 （ ）按式（ ）计算（以 血清为例）： （ ） （ ）式中： 被检血清（ ）与病毒抗原（ ）反应的平均值； 孔 值 ； 孔 值 。被检血清（ ）与对照抗原（ ）反应的均值 （ ）按式（ ）计算（以 血清为例）：犛犖 犜 式中： （ ） （ ） 被检血清（ ）与对照抗原
18、（ ）反应的平均值； 孔 值 ； 孔 值 。 被检血清值与标准阳性血清值的比值 按式（ ）计算： （ ）（ ） （ ）式中： 被检血清值与标准阳性血清值的比值。 结果的判定与解释 有效性判定 （ ）与 （ ）的差值应大于或等于无效。 判定标准与解释时 ，才可进行结果判定。 否则，本次试验 比值小于，判定为病毒抗体阴性，记作间接（ ）。 比值大于或等于，小于，判定为疑似，记作间接（ ）。 比值大于或等于，判定为病毒抗体阳性，记作间接（ ）。间接（ ）者表明被检猪血清中含有病毒抗体。 血清中和试验（犛犖 ）（ 见 ） 材料准备 器材孔细胞培养板、微量移液器、二氧化碳恒温箱、倒置显微镜等。 病毒美洲
19、标准株 或欧洲标准株 ，由国家指定单位提供。 使用前参照附录 方法滴定病毒效价后，用含健康猪新鲜血清的营养液（ 为工作病毒液。 细胞）将其稀释至 ，作或 传代细胞，由国家指定单位提供。 使用时，用细胞分散液消化、分散细胞，计数 ，再用营 养 液（含 犊 牛 血 清，青 霉 素 ，链 毒 素 ， 个 。 试剂病毒标准阳性血清和标准阴性血清，由国家指定单位提供，使用前经灭活 说明书规定进行稀释。 样品） 稀 释 至，并按无菌采集被检猪血清，血清应新鲜、透明、无溶血、无污染，密装于灭菌小瓶内，保存或立即送检，检测的经灭活 周时采集为宜。 操作方法。 由于中和抗体产生稍晚，故该血清以在疾病中后期或病毒
20、感染后 周 加营养液：取 孔细胞培养液，编号，于各血清检测孔内加入营养液（含 犊牛血清 、 青霉素、 链霉素， 不加。） ，细 胞 对 照 区 各 孔 加 病 毒 对 照 区 各 孔 加被检血清：用微量移液器精确吸取已作灭活处理的被检血清，在各排头两孔各加入 。每份被检血清应平行安排两排，即每个稀释度两孔。犛犖 犜 稀释被检血清：从第 列开始依次向后将被检血清作倍比稀释，使第 、 、 、 、 列孔的血清稀释倍数依次为 、 、 、 、 。 稀释时，用 道微量移液器先在第 列孔内吹吸数次，充分混匀后吸取 移入第 列 ，同前混匀后取 移入第 列 ，依次稀释，当第 列各孔混匀后，各吸取 弃去，稀释过程
21、中切勿产生气泡。 稀释对照血清：同 法进行标准阳性血清和标准阴性血清稀释。 加病毒液：除血清对照、病毒对照和细胞对照外，各孔添加含健康猪新鲜血清营养液，将病毒液稀释成 工作病毒液 。 病毒对照：取灭菌试管 支 ，用 健康猪新鲜血清营养液（ ）将病毒液稀释至含毒量为 、 、 和 个滴度，然后各取 加入相应的孔内（每个滴度 个孔）， 再于各孔内加入 倍稀释的标准阴性血清，此时，病毒浓度分别降为 、 、 和 。 中和感作：将培养板放入的 二氧化碳恒湿箱中保湿感作。 添加细胞：于每孔内加入配制好的或 细胞悬液 。 培养：封板后，放入的 二氧化碳保湿恒温箱内培养。 观察与记录在倒置显微镜下逐孔观察致细胞
22、病变作用（）。每天观察 次 ，连续观察 天 ，并将观察结果记入专用登记表内。 病毒在缩 、聚集、固缩，最后溶解脱落。 中和效价计算和结果判定或 细胞上生长，引起的主要表现为：细胞圆在各对照组符合下述要求时，本次中和试验才成立： ） 病毒对照：病毒浓度为 的各孔不应出现， 的各孔均应出现。 ） 血清毒性对照：相当于试验中最低稀释度（本标准中为 倍 ）的被检血清对细胞应没有任何毒性作用。 ） 细胞对照：在整个试验中应一直保持良好的形态和特征。 ） 阳性血清对照：试验中所显示的能抑制出现的血清最高稀释度不应比其已知滴度差 个滴度以上。 ） 阴性血清对照：各稀释度应出现。对被检血清的中和效价进行计算，
23、其血清中和效价为能抑制平行两孔或两孔中一孔出现的血清最高稀释倍数的倒数。 血清中和效价大于或等于，判定为血清中和试验阳性，记作 （ ）； 小于 ，判为阴性，记作 （ ）。 （ ）表示被检猪血清中含有病毒抗体。犛犖 犜 附 录 犃（资料性附录）疾 病 概 述犃 猪繁殖和呼吸综合征（狆犲狀犻犲犮狉狅犲狆狏犻犪狀狋犱狅犱犮狌狉狊犲狉狆狉狅狋犪狉犻狔 狊狔狅狀狉犱犿犲，犘犚犚犛）也称为蓝耳病 （）， 是由猪繁殖和呼吸 综 合 征 病 毒（，）引起的以母猪繁殖障碍和仔猪及育成猪呼吸困难为特征的接触性传染病。犃 病原属于动脉炎病毒科（）动脉炎病毒属的成员，为有囊膜的单股正链病毒，病毒粒子呈球型，直径为 。
24、 专嗜在猪肺泡巨噬细胞内生长，在传代细胞系和、中亦可生长繁殖，且可产生明显的细胞病变；不凝集红细胞，无血凝活性；其对 值及温度变化非常敏感， 值大于 或小于 时其感染性降低以上，对碱耐受性极差， 为其保存最适 值 ，室温及以下迅速失活， 即被完全灭活；对消毒剂抵抗力不强。根据基因的变异程度，目前将分为两种主要抗原型：分别以和 为代表株的欧洲型和美洲型， 据 现 有 资 料， 我 国 流 行 的 毒 株 为 美 洲 型。 有 种 主 要 结 构 蛋 白： 分 子 量 为 的核衣壳蛋白（ ）、 的基质蛋白（ ）和 的囊膜蛋白（ ）。其中 蛋白免疫原性最强，在 感染猪体时，所有感染猪在后都能检测到抗 抗体。犃 流行病学中长期持续感染，传播途径多、传播速度快，可在猪群。 研究表明：精液中需要一定数量的病的主要传播途径是接触传染，可通过空气和精液传播，猪是唯一感染并出现临床症状的动物毒才能感染母猪，公猪受感染后排毒可达之久。 将感染猪特别是隐性感染猪引入易感猪群是该病流行的重要原因。 在妊娠早期，病毒可通过胎盘感染胎儿，妊娠中期病毒很难通过胎盘而感染胎儿。 该病遍布于全世界主要养猪地区，于 世纪年代在北美和欧洲大面积爆发流行，世纪年代中期 传入我国。犃 症状本病临床症状主要表现为死胎率和乳仔猪死亡率较
