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1、无菌及环氧乙烷残留量检测,浙江省医疗器械检验所 虞海莹,提纲,1.常用灭菌方法,3.微生物检验基础知识,4.医疗器械无菌检查,2.环氧乙烷残留量,常用的灭菌方法,灭菌的方法：物理方法干热灭菌湿热灭菌射线灭菌滤过灭菌化学方法气体灭菌药液灭菌,干热灭菌法,干热灭菌法可用于能耐受较高温度，却不宜被蒸汽穿透、或者易被湿热破坏的物品的灭菌。分类：火焰灭菌法：是将待灭菌物品直接置于火焰中烧灼进行灭菌的方法，灭菌迅速、可靠、简便。适用于：耐火焰材质的物品如金属、玻璃用具或容器及瓷器等的灭菌 干热空气灭菌法：是将待灭菌物品置于高温干热空气中灭菌的方法，需要长时间高热环境才能达到灭菌效果。适用于：耐高温材质的物
2、品（玻璃、金属制品等）及耐高温、不允许湿气穿透的油脂类和粉末化学药品。干热空气灭菌常用：135145灭菌35h；160170灭菌24h；180200灭菌0.51h。,湿热灭菌法,湿热灭菌法是通过热蒸汽或沸水使细菌蛋白质变性而杀灭微生物的方法。分类:煮沸灭菌流通蒸汽灭菌热压灭菌适用于：耐高温、耐高压蒸气的物品。金属或玻璃容器及用具、瓷器、橡胶塞、膜滤器等均能采用此法。常用条件（温度、蒸气表压与时间）为：115（67kPa），30min；121（97kPa），20min；126（139 kPa），15min。影响湿热灭菌的因素有：细菌的种类与数量器械（被灭菌物）性质灭菌温度、压力与时间,射线灭菌法
3、,常用的有：辐射灭菌法：原理是射线可直接破坏细菌DNA，导致微生物死亡。辐射灭菌的特点是不升高灭菌产品的温度，穿透性强。适用于：羊肠线、高分子材料等医疗器械的灭菌。紫外线灭菌法：是利用紫外线作用于菌体核酸蛋白促使其变性，同时空气受紫外线照射后产生微量臭氧，从而起共同杀菌作用。紫外光波长190-350nm之间，其中波长为260nm左右，对微生物的生物效应最大。适用于：无菌室、某些工作区的空气灭菌、物体表面灭菌。微波灭菌法：采用频率300MHz300kMHz的电磁波照射产生热能杀灭微生物的方法。,紫外线照射灭菌时注意的问题,紫外线的杀菌力，随使用时间增加而减退，一般使用时间达到额定时间70时应更换
4、紫外线灯管，以保证杀菌效果。紫外线灯平均寿命一般为2000h。紫外线的杀菌作用随菌种不同而不同，杀霉菌的照射量要比杀杆菌大40 50倍。紫外线照射通常按相对湿度为60的基础设计，室内湿度增加时，照射量应相应增加。紫外线灭菌效果与照射的时间长短有关，这需要通过验证来确定照射时间。紫外照射灯的安装形式及高度，应根据实际情况，参考使用说明决定,滤过除菌法,滤过除菌法：指用滤过方法除去活的或死的微生物的方法，是一种机械除菌方法，供除菌用的滤器，要求能有效地从溶液中除净微生物，溶液能顺畅地通过，容易清洗，操作简便。适用于：对热不稳定的药物溶液、气体、水等的除菌。常用除菌滤器（应在无菌操条件下进行）：0.
5、22m或0.3m的微孔滤膜G6垂熔玻璃滤器,化学灭菌法,气体灭菌法：指用化学药品的气体或蒸气杀灭微生物的方法。常用气态杀菌剂：为环氧乙烷、甲醛、丙二醇、臭氧、乳酸、过氧 乙酸等。药液灭菌法:药液灭菌法利用药液杀灭微生物的方法。常用的有0.1%0.2%苯扎溴铵溶液，75%乙醇、2%煤酚皂溶液、1%聚维 酮碘溶液等。,小结,高压蒸汽灭菌:工作服、口罩、稀释液等，置高压杀菌锅内，一般采用121灭菌半小时,不同的培养基有不同的要求,应分别处理。火焰灭菌：接种针、接种环等可直接火焰灭菌。高温干燥灭菌：各种玻璃器皿、注射器、吸管等，置于燥箱中160灭菌2小时。一般消毒:无菌室内的凳、工作台、试管架、天平、
6、待检物容器或包装均无法进行灭菌，必须用其他方法进行消毒处理，可采用适当的消毒液擦拭消毒，工作人员的手也用此法进行消毒。空气的消毒：开启紫外灯照射3060分钟即可。,提纲,1.常用灭菌方法,3.微生物检验基础知识,4.医疗器械无菌检查,2.环氧乙烷残留量,环氧乙烷灭菌相关知识,环氧乙烷灭菌利用环氧乙烷在常温下为气态，蒸汽压较大，对灭菌物品的穿透性强，可以穿透微孔而达到物品的深部，环氧乙烷是一种非常活泼的灭菌剂，杀菌能力强且广泛，有很强的穿透能力，适合于包装物品的灭菌，对物品损坏轻微，且费用较低。现大部分的医疗器械生产企业采用此种方法灭菌。环氧乙烷能够高效地对医疗产品进行灭菌，在杀灭微生物的同时医
7、疗产品上的环氧乙烷残留也会对使用者和患者的身体带来一定的毒害。其毒性包括两个方面：一为环氧乙烷本身的毒性。通过呼吸器官吸入体内刺激呼吸道，引起恶心、呕吐、头昏、头痛、嗜睡等症状。严重者可引起肺水肿；通过皮肤、粘膜接触后，引起红肿、水泡及血泡，严重者可出现局部皮肤烧伤及粘膜组织灼伤，造成毛发脱落；超量进入人体血液内，可致红细胞溶解，补体灭活和凝血酶破坏引起全身性溶血。二是灭菌后生成物的毒性。环氧乙烷与氯元素接触产生毒性很大的氯醇，与水接触形成乙二醇，对环境和种植物的生产起到很大的破坏作用。,环氧乙烷灭菌相关知识,医疗器械产品如采用环氧乙烷灭菌，应由有资格的人员负责设备维护灭菌的确认和常规控制及产
8、品放行工作。应不断提高各类人员对环氧乙烷残留量造成健康风险的意识，首先经环氧乙烷灭菌的医疗器械必须按规定进行解析，即纸塑包装灭菌后解析7天，全塑包装灭菌后解析14天，并经检测确定器械上的环氧乙烷残留量小于10g/g后出厂；其次经环氧乙烷灭菌的医疗器械应采用透气性好，有助于消除残留环氧乙烷的纸塑包装，以最大限度地降低环氧乙烷残留，降低器械使用的风险；第三体积越大，环氧乙烷含量绝对就越高；对于医用敷料、无纺布、合成医用乳胶手套等对环氧乙烷气体有很强的吸附性，吸附在这类产品上的残留量很难彻底解析，所以对此类产品，不应选用环氧乙烷灭菌。,环氧乙烷残留量测定方法,气相色谱法比色分析法原理：环氧乙烷在酸性
9、条件下水解成乙二醇，乙二醇经高碘酸氧化生成甲醛，甲醛与品红-亚硫酸试液反应产生紫红色化合物，通过比色法分析可求得环氧乙烷含量。所用试剂：高碘酸，硫代硫酸钠，无水亚硫酸钠，碱性品红，盐酸，乙二醇等浸提方法：分模拟使用浸提法和极限浸提法。模拟使用浸提法：用0.1mol/L盐酸作为浸提介质,整个或部分与人体接触的器械在37(人体温度)浸提,不直接与人体接触的器械在25(室温)浸提.浸提时间应考虑在推荐或预期使用最为严格的时间条件下进行,但不短于1h.浸提表面为器械与药液或血液接触的表面.极限浸提法:取样品上有代表性的部位,截为5mm长碎块,称取2.0g置于容器中,加0.1mol/L盐酸10ml,室温
10、放置1h,作为供试液;对于容器类样品,可加0.1mol/L盐酸至公称容量,在371下恒温1h.,环氧乙烷残留量,试验步骤 绘制标准曲线：取5支纳氏比色管，分别精确加入0.1mol/L盐酸2ml,再精确加入0.5m、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml乙二醇标准溶液。另取一支纳氏比色管，精确加入0.1mol/L盐酸2ml作为空白对照。于上述各管中分别加入高碘酸溶液（5g/L)0.4ml，摇匀，放1h，然后分别滴加硫代硫酸钠溶液（10g/L）至出现的黄色恰好消失。再分别加入品红-亚硫酸试液0.2ml，用蒸馏水稀释到10ml，摇匀，35 37 条件下放置1h,于560nm波长处以空白液作参
11、比，测定吸光度。绘制吸光度-体积标准曲线。试验方法：精确量取供试液2.0ml于纳氏比色管中，按上面的步骤操作，以测得的吸光度从标准曲线上查得试液相应的体积。,、,提纲,1.常用灭菌方法,3.微生物检验基础知识,4.医疗器械无菌检查,2.环氧乙烷残留量,微生物检验基础知识,无菌技术：是指在微生物试验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设施、无菌试验器材以及无菌操作。无菌环境设施 无菌室的使用与管理要求超净工作台的使用与管理要求生物安全柜无菌试验器材无菌操作：概念：是指在无菌环境条件下，在对无菌制品或无菌器械进行检验的过程中，能防止微生物污染与干扰
12、的一种常规操作方法。注意事项。,提纲,1.常用灭菌方法,2.环氧乙烷残留量,4.医疗器械无菌检查,3.微生物检验基础知识,医疗器械无菌检查引用标准,中华人民共和国药典2005版/医用输液输血注射器具检验方法第部分：生物学试验方法,无菌检查法的定义,中华人民共和国药典2005版：无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品，医疗器具，原料，辅料及其他品种是否无菌的一种方法/：本试验系将医疗器械或其浸提液接种于培养基内，以检验供试品是否有细菌和真菌污染,无菌检查方式,直接接种法薄膜过滤法,主要设备,超净工作台恒温培养箱恒温水浴箱压力蒸汽灭菌器电热干燥箱光学显微镜,主要器具,试管及试管架酒精灯75乙醇棉灭
13、菌刻度吸管(1ml)灭菌平皿（9cm）锥形瓶三角烧瓶灭菌剪刀、镊子等,主要培养基,流体硫乙醇酸盐培养基改良马丁培养基营养琼脂培养基,稀释液、冲洗液及其制备方法,无菌氯化钠溶液：质量浓度为9g/L的无菌氯化钠溶液 蛋白胨水溶液（0.1）制备方法：取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，调节pH值至7.10.2，分装，灭菌。pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液制备方法：取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钠7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装，灭菌,培养基要求,用于培养需（厌）气菌和真菌的培养基的制备、培养基灵敏度检查及其他各项要求应符合中国药典（
14、二部）附录中无菌检查法的规定。培养基可按药典的处方制备，也可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。制备后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。制备好的培养基应保存在225、避光的环境。培养基若保存于非密闭容器中，一般在三周内使用;若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。,培养基,灵敏度试验的菌种,金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌铜绿假单胞菌生孢梭菌白色念珠菌黑曲霉:中国医学细菌保藏管理中心,器具灭菌,与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，通常置压力蒸气灭菌器内12130min，或置电热干燥箱内1602h。,无菌室菌落数要求,无菌室操作台或超净工作台局部应符合洁净度100级单向流空气区域要求。无菌室在消
15、毒处理完毕后，应检查空气中的菌落数。方法：取直径约90mm培养皿，无菌操作注入融化的营养琼脂培养基约20mL，在3035培养48h证明无菌后，取3只培养皿在无菌室操作台或超净工作台平均位置打开上盖，暴露30min后盖好，置3035培养48h后取出检查，3只双碟上生长的菌落数平均不得超过1个.无菌试验过程中应检查空气中的菌落数，方法同上。在试验开始进行时打开平皿盖，至试验结束盖好照上法培养，应符合上述要求。,阳性对照,应根据供试品特性选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌；抗革兰阴性菌为主的供试品以大肠埃希氏菌为对照菌；抗厌氧菌的供试品，以生孢梭菌为对照菌
16、；抗真菌的供试品，以白色念珠菌为对照菌。阳性对照试验的菌液制备同培养基灵敏度检查（大肠埃希氏的菌液制备同培养基的灵敏度检查中的金黄色葡萄球菌）加菌量小于100cfu，供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。阳性对照管培养4872小时应生长良好。,供试品数量,同一批号至少3个11个单位供试品。批出厂产品最少检验数量：个：或个（取较大者）：或件（取较少者）,上市抽验样品（液体制剂）的最少检验量,上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量,M50mg 全量 2050mgM300mg 半量 10300mgM5g 150mg 10M5g 500mg 10外科用敷料棉花及纱布取100mg或1cm3cm
17、 10缝合线、一次性医用材料整个材料 20带导管的一次性医疗器具（如输液袋）10其他医疗器具整个器具（切碎或拆散开）20,备注,每种培养基各接种10支供试品。如果医用器械体积过大，培养基用量可在2000ml以上，将其完全浸没。,供试液制备及接种,制备及接种优先采用将供试品或其有代表性的各部分直接投放入培养基内培养。如供试品不适宜直接投放，可按下列方法制备供试液，应使介质充分洗提供试品的浸提表面。管类器具：按管内表面积每10cm2流过管内腔1mL浸提介质，流量约为10ml/min;容器类器具：容器内已装有液体的或直接抽取容器内液体为供试液;空容器按容器内表面积每10cm2加入浸提介质1ml，振摇
18、数次。实体类器具：实体类器具按表面积每10cm2加入加入浸提介质1ml，振摇数次。供试液制备应按无菌操作法进行，在制备后2h内使用。,接种后的培养基,培养基装量,直接接种法即每支供试品按规定量分别接种到各含硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基的容器中。除另有规定外，每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，改良马丁培养基每管装量不少于10ml。每种培养基接种的管数同供试品的检验数量。,培养及观察,上述含培养基的容器按规定的温度培养14天。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。如在加入供试品后、或在培养过程中培养基出现
19、浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中或划线接种于斜面培养基上，细菌培养2天，真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊或斜面是否有菌生长;或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。,结果判断,若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定;若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明试验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。,有下列至少一个条件时，试验结果无效,无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求;回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素;阴性对照管有菌生长;供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法重试，若无菌生长，判供试品符合规定;若有菌生长，判供试品不符合规定。,谢 谢！,浙江省医疗器械检验所,
