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1、引物设计基本原则引物长度(primer length)产物长度(product length)序歹。Tm 值 (melting temperature)G+C 含量(。omposition)引物二聚体及发夹结构(duplex formation and hairpin)阅读框1. 引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp,但不能大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74C，即Taq酶的最适温度2. 产物的长度扩增片段长度为100600碱基对。3. Tm 值引物的Tm值一般控制在55-60度，尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2度。如果引物中的G+C含 量相对偏低，则可以
2、使引物长度稍长，而保证一定的退火温度。Tm=2 (A+T) +4 (C+G)4. 引物的GC含量有效引物中(G+C)的比例为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。5. 引物自身引物间3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败任务用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1pcDNA3.1BamHI(&ATCC)pcDNA3.1NR1的编码序列(-4000bp)121 ggggctccta gagaacccgg gggcgc+tga ccgcgcgcgg gcggcccgcg gg+cgtacat 181 cgcgaggtcg tcgcac+cgc gc
3、aacccaga gccaggcccg ctgtgcccgg agctca+gag 241 caccatgcac c+gctgaoat tcgccctgct tttttcctgc tccttcgcc c gcgcggatcc 301 cgacccoaag a+cgtcaaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgtt 361 ccgcgaggca gtaaaccagg ccaa+aagcg acacggc+ct tggaagatac agctcaacgc 421 cac+tc+gtc acccacaagc ccaacgccat acaga+ggcc
4、 ctgtcagtgt gtgaggacct 481 catc+ctagc cagg+ctacg cta+cctagt tagccacccg cc+actccca acgaccac+t 541 cactcccacc cctg+ctcct acacagc+gg cttctacaga atccctg+cc tgggactgac 601 tacccgaa+g tcca+ctact ctgacaagag ta+ccacc+g ag+ttcc+tc gcacgg+gcc 661 gccc+ac+cc caccagtcca gcgtctgg+t tgagatga+g cgag+ctaca ac+ggaac
5、ca 721 catcatcc+g ctgg+cccg acgaccacga gggacgggca gcgcagaagc gc+tggagac 781 gttgc+ggag gaacgggagt ccaaggcaga gacg+gctg cagt+tgacc caggaaccaa安色为宿号肽堇色为切位点,下划线标出酶切位点的阅读框GFP 序列(-700bp)ATGffV&A&CAA& G&C&AG&AGC T&TTCACCG& S6TSGTGCCCATCCTGGTCS A&CVGGACGG C&AC&TAAAC GGCCACAAGTTCAGCGTGTC C&GC&A&C &A&G&C&AT&
6、CCACCTAC&CAA&CT&ACC CT&AAGTTCA TCTSCACCAC CG&CAA&CT&CCCGTGCCCT G&CCCACCCT CGTTGACCACC TTCGGCTACGGCCTGCAGTG CTTCGCCC&C TACCCCQACC ACATGAAGCA&CAC&ACTTC TTCAA6TCCG CCATGCCCSA AGGCTACGTCCAG&AGCGCA CCATCTTCTT CAAG&ACGAC &GCAACTACAAGACCC&C&C C&AGGT&AA& TTCGAG&GC& ACACCCTGGTGAACCGCATC &AGCT&AA&G SCATCGACTT
7、 CAAG&AG&ACGSCAACATCC TGGGGCACAA GCTSGASTAC AACTACAACAGCCACAACffT CTATATCATG GCCGACAAGC AGAAGAAC&GCATCAA&ffTG AACTTCAAGA TCC&CCACAA CAlC&AGGAC&GCAGCffTGC AGCTC&CC&A CCACTACCA& CA&AACACCCCCATCSSCGA CGGCCCCffTG CT&CTGCCTAC CASTCCGCCCTGAGCAAAGA CCCCAAC&AG AAGC&C&ATC ACAT&ffTCCTGCTSGA6TTC GT&ACCGCCG CCG
8、G&TCAC TCTCGGCATGGACGAGCTffT ACAAGTAA引物要求PCR扩增GFPGFP两边添加BamHI酶切位点 保证NR1的阅读框不改变 第一步：扩增GFP基本序列6FP序列5 ATG&T&A&CAA&G&C&A&GAGC TCTCG&CAT6&AC&ACTGTACAAGTAA 3H 3* TACCACTCGTTCCCGCTCCTC&.A&AGCCGTACCTGCTC&ACAT&TTCATT S*变性，引物复A&A&CC&TACCT&CTC&ACAT&TTCATT 5 PrimerSPrimer!： 5,3 TACGATCGTTCCCGCTCCTCGCGTACCTGCTCG
9、ACATGTTCATT 5Primerl： 5AT&QT&AGCAA&C&A&GAGCPrimerZ: 5TTACTTSTACAGCTCGTCCATCCGA&A.Prinwrl i 5ATGGTGA GCA A QG&CGA G&A&CPr；ffiflr2: S，CTT&TACA&CTC&TCCA TfC&A&A第二步：GC比值；Tm值Pimorl: 5ATGGT&A&CA AS&C&A G&APrimorZ： 5CTTGTA CASCTC&TC CAT&CCGA GAPrimorl: 5Primap2： 5ATGGTGA&CA A&GC&A&GA (GC：60%,Tm= 64)CTT&VAC
10、A&CTC&TCCATGCC (&C：57%,Tm= 66第三步：酶切位点Prjmerl: 5,BamHI： ggatcc TG&VGA&CAAGGGCGAGGA (GC：60%fTm= 64)Primer2: 5*CTTGTACA&CTCGTCCATGCC (GC：57%,Tm： 66)Primerl： 5ggatccATGGTGA&CAA&GGCGAGGAPrimer?: 5ggatccCTTGTACAGCTCGTCCAT&CC第四步：阅读框NR1序atgagcacca+gcacctgc+gacat+cgccc+gcttttt+cctgciccttcgcc cgc gcg gat ccc
11、gaccccaag atcg+caaca tcggcgcggt gctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca gtaaaccagg ccaataagcg acacggctct tggaagatac agc+caacgccacttctgtc acccacaagc ccaacgccat acagatggcc c+g+cagtg+ g+gaggacctPrimerl: 55QgatccV&V&A&CAA&C&A&GAggatccT V>&A&C A A&C&A&G APrimerl: 5atgagcaccatgcccctgctgacattcgccctgct
12、+ttttcctgctccttcgcccgc gcg gat ccc gaccccaag atcgtcaaca tcggcgcggtgctgagcacg cgcaagcatg aacagatgttccgcgaggca g+aaaccagg ccaataagcg acacgctct tggaagatac agc+caacgccac+tctg+c occcacoogc ccaocgccat acaga+ggcc ctg+cag+gt g+gaggacc+&FP序列5 ATS STS AGC A/4G6GCG A&S A&C TCTCGGC ATGG /A CG AGCTST AC A AST A
13、A 35插入GFP后的组合序cgc gcg gat CCTATfi&TSAGCA&C.TCTC&CG6ACGAGCTGTACAAG ?ggat ccc gaccccaag a+cgtcaaca tcggcgcggt gc+gagcacg cgcaagcatg aacagatgt+ ccgcgaggca gtaaaccagg ccddtaagcg acacggctct tggaagatac agc+eaacgccocttetgte acccacaage ccaacgccat acagatggcc ctgtcag+gt gtgaggacct第五步保护序列Primerl: 5 GCGGggatccT
14、ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2: 5 GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC记得当初写本科论文，感到不知道讨论什么问题好。愣是写了一大段的PCR条件摸索的讨论。后来PCR成为实验最基 本的一步了，但是发现在PCR中还是有许多需要注意的地方PCR的第一步就是引物设计了。引物设计需要注意的地 方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。在某些情况比如构建文库的时候也会在 不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列就与模板不是完全匹配。我们通常指的设计引物都是在 已知模板序列的情况下进行。设计的目的是在两个目标
15、间取得平衡：扩增特异性和扩增效率。引物分析软件将试图通过使用每一引物设计变化的预 定值在这两个目标间取得平衡。设计引用有一些需要注意的基本原理： 引物长度一般引物长度为1830碱基。总的说来，决定引物退火温度Tm值)最重要的因素就是引物的长度。有以下公式可以 用于粗略计算引物的退火温度。在引物长度小于20bp时：4(G+C)+2(A+T)-5C在引物长度大于 20bp 时：62.3C +0.41 C(%G-C)-500/length-5C另外有许多软件也可以对退火温度进行计算，其计算原理会各有不同，因此有时计算出的数值可能会有少量差距。为 了优化PCR反应，使用确保退火温度不低于54C的最短的
16、引物可获得最好的效率和特异性。总的说来，每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上 限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的 稳定双链模板的速率越小。 GC含量一般引物序列中G+C含量一般为40%60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或 AT倾向则可以在引物5端加适量的A、T或G、C尾巴。 退火温度退火温度需要比解链温度低5C，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如 果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，是DN
17、A双链结合。一对引物的退火温度相差4C6C不会影响PCR的 产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55C75C间变化。 避免扩增模板的二级结构区域选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选 择模板。实验表明，待扩区域自由能(AG)小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2- 脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 与靶DNA的错配当被扩增的靶DNA序列较大的时候，一个引物就有可能与靶DNA的多个地方结合，造成结果中有多个条带出现。这 个时候有必要先使用 BLAST
18、 软件进行检测，网址：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/o 选择 Align two sequences (bl2seq)，如下图。BLAST的使用方法也十分简单，如下图所示。将引物序列粘贴到1区，将靶DNA序列粘贴到2区，这两者可以互换的，并且BLAST会计算互补、反义链等多种可 能，所以不需要用户注意两条链是否都是有义链。如果知道序列在数据库中的GI号也可以直接输入GI号，这样就不 用粘贴一大段的序列了。最后在3处点击Align就可以查看引物在靶DNA中是否有多个同源位点了。可是使用BLAST还是有其不方便的地方。因为它一次只能比较两条序列，那么一对引物就需
19、要分开进行比对。如果存 在错配，还需要自己计算由于错配形成的片段长度有多大。在下一篇中将介绍一个软件，可以直接将靶DNA和引物输 入对产物片段进行预测。 引物末端引物3端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C 富集序列区错误引发。3端也不能有形成任何二级结构可能，除在特殊的PCR (AS-PCR)反应中，引物3端不能 发生错配。如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异 性与效率。 引物的二级结构引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引
20、物与模板的复 性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3端的互补 重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。 为了下一步操作而产生的不完全匹配5端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物 素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列 等。额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，但是为了下一步的操作就要作出适当的 “牺牲”。很多时候PCR只是初步克隆，之后我
21、们还需要将目的片段亚克隆到各种载体上，那么就需要在PCR这个步骤为下一步 的操作设计额外的碱基。以下总结一些为了亚克隆所要设计的序列。a添加限制性内切酶酶切位点添加酶切位点是将PCR产物进行亚克隆使用得最多的手段。一般酶切位点是六个碱基，另外在酶切位点的5端还需要 加23个保护碱基。但是不同的酶需要的保护碱基数目是不相同的，例如：Sal I不需要保护碱基，EcoRV需要1个， Not I需要2个，Hind m 3个。其中，在原核表达设计引物时还有一些小技巧，大家可以参考:原核表达之实验前的 分析。里面一些规则是所有表达都通用的。有一种做法是在进行PCR反应的同时进行酶切，这样就需要注意一些内切
22、酶在PCR反应中的酶切反应率，见附录。不 过这种方法虽然方便但并不推荐。有时候，就是把PCR产物回收后酶切再与载体连接效果都不尽理想，同步进行会使 出现问题的原因变得更加复杂。一旦出现问题，分析起来更麻烦。b LIC添加尾巴LIC的全称是Ligation-Independent cloning，它是Navogen公司专门为其部分的pET载体而发明的一种克隆方法。用LIC 法制备的pET载体有不互补的12-15碱基单链粘端，与目的插入片段上相应粘端互补。扩增目的插入片段的引物5 序列要与LIC载体互补。T4 DNA聚合酶的3-5外切活性经短时间即可在插入片段上形成单链粘端。由于只能由制备 好的插
23、入片段和载体互相退火形成产物，这种方法非常快速高效，而且为定向克隆。c定向TA克隆添加尾巴在T载体刚出的时候大家都拍手称赞，真是方便，哪个小子脑子这么聪明想出来的。但是后来人们发现TA克隆无法 将片段定向克隆到载体中，所以后来Invitrogen推出了可以定向克隆的载体，它的一端含有四个突出的碱基GTGG。因 此在PCR引物设计时也要相应的加上与之互补的序列，这样片段就可以“有方向” 了。d In-Fusion克隆方法这项技术是Clontech还属于BD的时候推出的，2004年在生物通可着实风光了一把，不但当选年度创新试剂还被大家 投票为最受大家欢迎的试剂。此技术就其步骤来说是及其方便的，不需
24、连接酶，不需长时间的反应。只要在设计引物 的时候引入一段线性化载体两端的序列，然后将PCR产物和线性化的载体加入到含有BSA的In-Fusion酶溶液中，在 室温下放置半个小时就可以进行转化了。这种方法特别适合大批量的转化。这里顺便提一下如果有什么技术给大家留下深刻影响，欢迎大家发email推荐给生物通。说不定你的推荐可以让它成为 年度之星呢。如果要加入额外的碱基总是或多或少会影响到整个PCR反应，比如在加入NotI的酶切位点后整个引物的退火温度就 会直线上升（它识别的是8个碱基，且全为GC），这样使另外一个引物的设计变得十分困难，因为一对引物间退火温 度相差不宜太远。因此上面提到许多设计原则在实际应用中往往难以做到都符合。在碰到这些情况的时候，我们只能 秉着“实践是检验真理的唯一标准”这一原则，要试一试才能知道能否行得通了。
