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1、第十四章 重组DNA技术主讲教师：张涛,重组DNA技术的发展简史,1865年 的豌豆杂交试验1944年 的肺炎球菌转化实验1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年 开始建造第一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉,第一节 重组 DNA技术的相关概念,DNA克隆工具酶目的基因基因载体宿主细胞,一、克隆,克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。
2、,技术水平：分子克隆(molecular clone)即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）,DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinant DNA)。重组DNA技术 实现DNA克隆所采用的方法及相关的工作统称为重组DNA技术或重组DNA工艺学(recombinant DNA biotechnology
3、)，又称为基因工程（遗传工程）。,二、工具酶,限制性核酸内切酶 DNA连接酶 碱性磷酸酶 DNA聚合酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 反转录酶,重组DNA技术中常用的工具酶,限制性核酸内切酶,定义限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,+,Bam H,分类、（基因工程技术中常用型）,作用与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序
4、。,命名,Hin d,Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶,类酶识别序列特点 回文结构(palindrome),切口：平端切口、粘端切口,GCATGCCGTACG,Nco,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,同功异源酶来源不同，但能识别和切割同一位点的限制酶，称为同功异源酶。（来源不同的同一种限制性内切酶）,+,Bam H,+,Bst,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。,同尾酶,Bam H,Bg l,+,+,同裂酶（isoschizom
5、er）,识别同一序列，但切割位置不同，这类酶互称为同裂酶（isoschizomer）。,Xma,Sma,+,+,第二节 重组 DNA技术的基本原理,一、基本程序,以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程,二、重组DNA技术步骤,1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomic DNA library)3.cDNA文库(cDNA library)4.聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),（一）目的基因的获取,化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列,组织或细胞染色体DNA,基因
6、片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,从基因组DNA文库获取目的基因,从cDNA文库获取目的基因,（三）外源基因与载体的连接,1.粘性末端连接方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接配伍末端连接非配伍末端连接,（二）克隆载体的选择和构建,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶15C,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接,Eco R切割位点,Bg l切割位点,配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。,2.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的
7、平端粘端补齐或切平形成的平端,3.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,载体DNA,目的基因,限制酶或机械剪切,限制酶,4.人工接头(linker)连接由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,人工接头及其应用,受体菌条件安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent),导入方式转化(transformation)转染(transfection)感染(infection),（四）重组DNA导入受体菌,（五）重组体的筛选 1.直接选择法(1)抗药性
8、标记选择(2)标志补救(marker rescue)(3)分子杂交法 原位杂交 Southern印迹 2.免疫学方法 如免疫化学方法及酶联免疫检测分析等,(插入失活法)抗药性标记选择,组氨酸缺陷型大肠杆菌,无组氨酸的培养基,酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,DNA,重组体,标志补救,互补,互补的检测,原位杂交,Southern印迹,鸡的肌球蛋白的克隆和检出,重组DNA技术操作过程可形象归纳为：,小 结,重组DNA技术操作的主要步骤,表达体系的建立表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化,（六）克隆基因的表达,1.原核表达体系（E.coli表达体系最为常用）标准：选择标志强启动子
9、 翻译调控序列多接头克隆位点E.coli表达体系的不足 不宜表达真核基因组DNA不能加工表达的真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body)很难表达大量可溶性蛋白,大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌,优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累缺点：操作技术难、费时、经济,转染 将表达载体导入真核细胞的过程,方法：磷酸钙转染DEAE葡聚糖介导转染电穿孔 脂质体转染 显微注射,2.真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）,表达载体pFASTBACI 的物理图谱,一、疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子
10、机制。,二、生物制药,第三节 重组 DNA技术与医学的关系,重组DNA医药产品,基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。,三、基因诊断,基本过程,区分或鉴定DNA的异常,分离、扩增待测的DNA片断,标准.能正确扩增靶基因；.能准确区分单个碱基的差别；.本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定;.便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。,四、基因治疗,定义 基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷 的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿 其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。,方式体
11、细胞基因治疗(somatic cell gene therapy)性细胞基因治疗(germ line gene therapy),1.产前诊断2.携带者测试3.症候前诊断4.遗传病易感性,五、遗传疾病的预防,1.什么是DNA克隆？什么是限制性核酸内切酶？,应用酶学的方法，在体外将各种来源的DNA与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，就称为DNA克隆也称为基因克隆。限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,
12、并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,【思考题】,2.什么是基因组文库？什么是cDNA文库？,采用物理方法或限制性核酸内切酶将染色体DNA切割，继而将所获得的片段与适当克隆载体连接，将重组DNA转入受体菌中扩增，每个细菌内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝。全部细菌所携带的各种染色体DNA片段就涵盖了基因组全部信息，这个携带所有基因组DNA的集合即称为基因组文库。以细胞mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，扩增后可获得含有相应cDNA的大量克隆，这些克隆就构成了cDNA文库。,3.重组DNA过程中所需要的酶主要有哪些？,限制性核酸内切酶 DNA连接酶 碱性磷酸酶 DNA聚合酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 反转录酶,4.重组DNA技术的基本步骤有哪些？,5.重组DNA技术在医学上有哪些应用？,进行致病基因的发现进行疾病的分子诊断进行基因治疗用于发展生物制药,
