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1、拟南芥TDNA 插入突变体的鉴定,1、反向遗传学,经典遗传学：由表及里，即通过杂交等手段观察表型性状的变化而推知遗传基因的存在与变化。表型基因,反向遗传学：由里及表，即通过DNA重组等技术有目的地、精确定位地改造改造基因的精细结构以确定这些变化对表型性状的直接影响。基因表型,研究基因功能的方法,1、转基因技术2、基因敲除3、基因敲入4、基因诱导超表达5、基因诱捕技术6、RNAi干扰7、生物信息学分析8、反义技术,1、反向遗传学,2、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技术,T-DNA插入突变技术，通过插入已知序列的T-DNA，破坏目标基因的结构使之沉默；将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上
2、，通过农杆菌的转化作用，将目的基因整合到植物细胞染色体DNA上，使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达,农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。,根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti(Tumour inducing)质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA(Transferring DNA)，它能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。Ti质粒已成为植物分子生物学中广泛应用的遗传转化载体，而外基因就是整合到T-DNA上的。,农杆菌质粒,2、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技术,During tumour inductio
3、n,Agrobacteriumattaches onto plant cells and then transfers part of its DNA to some of these cells.The transferred DNA(T-DNA)which is found on a large Ti(tumour inducing)plasmid，is modified within the bacterium and is transferred to the plant where it becomes integrated into the plant genome.,the me
4、chanism of T-DNA insertion,Proteins which are encoded by the virulence(vir)region of the Ti plasmid regulate the T-DNA modification and transfer.,Phenolic compounds that are derived from a wounded plant cell induce expression of thevirregion genes.,Virulence proteins recognise the border sequences(L
5、B、RB)that define the T-DNA.,In the presence of VirD1 protein,VirD2 cleaves the border sequence.A single-stranded T-DNA is produced when the nicked DNA is released from the plasmid.,2、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技术,the mechanism of T-DNA insertion,2、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技术,In the plant cell,the T-DNA is coated
6、with the single-stranded DNA-binding protein,VirE2.,The complex that comprises of the T-DNA bound to the binding protein then moves into the nucleus and is integrated into the nuclear genome.,the mechanism of T-DNA insertion,2、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技术,转化过程示意图,2、反向遗传学的重要手段T-DNA插入突变技术,来源：arabidopsis.info
7、/students/paaras/t_dna.htm,3、反向遗传学方法研究赤霉素糖苷转移酶基因,（1）研究背景,（2）模式生物拟南芥,（3）筛选纯合突变体,（4）表型鉴定,（1）研究背景,赤霉素可促进叶和芽的生长，用于农业生产，在某些方面有较好的效果。赤霉素的生物合成和代谢对赤霉素活性的调控作用已了解的比较清楚。植物界广泛存在的赤霉素糖基化修饰对赤霉素活性的作用，以及糖基化修饰能否调控以及如何调控赤霉素的活性并进而影响植物的生长发育的问题尚未解决。,拟南芥是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物。植物特点：(1)生长周期短,6周内完成;(
8、2)基因组小,仅有5条染色体,113亿个碱基对,但是它的大多数基因与其他“复杂”的植物基因具有很高的同源性，(3)具有双子叶植物的所有特性(4)有效的农杆菌介导转化途径,易获得大量的突变体和基因组资源;(5)在有限的空间内可大量种植，体形小,占地少(6)收获大量的种子，每株拟南芥可产生多达5000粒种子；(7)生活力强，用普通培养基就可作人工培养。,（2）模式生物拟南芥Arabidopsis thaliana,目前已经完成测序的植物有三种：拟南芥、水稻、毛果杨(Populus trichocarpa)。美国NCBI下面的植物基因组数据库资料：http:/www.ncbi.nlm.nih.gov
9、/genomes/PLANTS/PlantList.html 拟南芥的基因敲除文库的建立,实验方案设计,1.确定所要研究的基因 通过生物信息学的方法推测出一些可能具有赤霉素糖基转移酶的基因。2.获得种子进入如下网站http:/arabidopsis.org/index.jsp，输入种子基因型号。,（3）筛选纯和突变体,1、实验方案设计,（3）筛选纯合突变体,点击进入基因序列信息网页,实验方案设计,（3）筛选纯和突变体,实验方案设计,（3）筛选纯合突变体,输入种子基因型号,实验方案设计,（3）筛选纯合突变体,点击进入基因序列网页,实验方案设计,（3）筛选纯合突变体,基因序列网页,实验方案设计,（
10、3）筛选纯合突变体,查找突变体及引物设计,实验方案设计,（3）筛选纯合突变体,输入基因型号,实验方案设计,（3）筛选纯合突变体,查看含有相关基因的种子信息,实验方案设计,（3）筛选纯合突变体,引物设计,实验方案设计,（3）筛选纯合突变体,中间引物的设计,实验方案设计,（3）筛选纯合突变体,两侧引物的设计,实验方案设计,（3）筛选纯合突变体,2、实验材料,赤霉素糖基转移酶基因的T-DNA插入突变种子：SALK_064481.43.20.x LP（左引物）：GCTGGAGTCCACAACTTGAAG Len 21 TM 59.90 GC 52.38 RP（右引物）：AACTCCTCCTCAAAGG
11、CTCAG Len 21 TM 60.00 GC 52.38 器材：离心机，离心管，PCR仪，点泳池，电泳现象仪,（3）筛选纯合突变体,实验原理,（3）筛选纯和突变体,三引物法,3、突变体鉴定原理,（3）筛选纯和突变体,“三引物法”即采用三个引物（LP、RP、LB）进行PCR扩增。,野生型植株（WT）目的基因的两条染色体上均未发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有1种，片段大小为基因的长度（即从LP到RP的长度）,纯合突变体植株（HM）目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，而T-DNA本身的长度约为17 kb，过长的模板会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与RP（
12、或LP，根据T-DNA在基因上插入的方向选择）为引物进行扩增的产物，分子量约410+N bp（即从LP或RP到T-DNA插入位点的片段，长度为300+N bp，再加上从LB到T-DNA载体左边界的片段，长度为110bp）；,杂合突变体植株（HZ）只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到410+N bp和片段大小为基因的长度bp两种产物。电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。,双引物法,与“三引物法”本质相同。,实验原理,（3）筛选纯和突变体,首先以基因组 D N A作为模板，用一对特异引物(LP和RP)扩增目的基因片段，野生型和突变杂合体均一条带，纯合
13、突变体没有条带;然后再以基因组DNA 为模板，由T-DNA 片段的特异引物(LB)与LP 或RP 组成一对引物，扩增目的基因T-DNA 插入片,野生型没有条带，杂合体和纯合体一条410+N。,不足之处是完成最终鉴定需进行两轮P C R 扩增。,4.3 电泳并观察结果 配制琼脂糖凝胶，将扩增后的样品加入凝胶孔电泳，电泳后观察结果。,5.结果分析,使用三引物法PCR检测，若电泳图上出现一大一小两条带，则为突变杂合体；出现一条小带，则为突变纯和体；出现一条大带，则为野生型。,（3）筛选纯和突变体,（4）表型鉴定,反向遗传学,用PCR筛选出突变纯合体后，便可以利用反向遗传学的思路对纯合突变体进行一系列
14、的基因功能的研究。基因敲除所产生的突变表型，是该基因缺失后的表型，因而直接表明了该基因的功能与表型的关系，人们由此可以直接快速的检测得到基因的功能。然而，有很多基因敲除突变体没有很明显的表型作用。,（4）表型鉴定,表型不明显的原因,由于重复基因的存在，一个基因成员的突变导致的功能丧失会被另一个重复基因所弥补。有些突变个体只有在特定的环境下、特定生长时期、特定生理状态下才表现突变性状，这类基因若在非表达阶段被突变，则不会产生明显的表型突变一些基因控制生物的代谢过程，并没有表型的改变 在多个生长阶段发挥作用的基因，其突变可能导致早期胚致死效应，因而也无法鉴定。瞬间表达的基因、低水平表达的基因，以及
15、在少数细胞中表达的基因，都很难用基因敲除突变体鉴定。（Patrick J.Krysan et al，1999）（赵霞，周波等，2009）,（4）表型鉴定,表型鉴定应对策略,Knock-knock 突变体环境胁迫基因捕获载体和激活标签载体。,（4）表型鉴定,Knock-knock 突变体,（Patrick J.Krysan et al，1999）,（4）表型鉴定,突变-表型,One can easily determine the precise genotype of large numbers of individual plants by using the T-DNA insertion
16、 as a PCR marker for the mutant locus.Such analysis,however,does not prove that the PCR-identified,T-DNAinduced mutation is responsible for the phenotype rather than a closely linked,unrelated mutation.,（4）表型鉴定,方法 isolate additional mutant alleles for the locus complement the mutation by introducing
17、 a wild-type copy of the gene into mutant plants,（Patrick J.Krysan et al，1999）,表型鉴定的一般思路,（4）表型鉴定,4、T-DNA的研究方向与价值,近年来，借助于农杆菌介导的遗传转化技术，T-DNA插入技术已被广泛应用于拟南芥等模式植物的突变体库构建中。在植物功能基因组学研究中发挥着重要作用，广泛应用于大规模植物基因功能分析，是分离新基因、研究基因功能的有效工具。构建突变体库，是反向遗传学的突破性技术之一,局限性：利用T-DNA插入突变体研究新基因，要求创建饱和突变体库，需要进行大规模的转基因工作，因此实验材料需要具
18、有完善的遗传转化体系（水稻、拟南芥等模式生物）。T-DNA转移和整合机制尚不清楚，有时会出现多拷贝插入，且容易产生直接的串联、反向重复和边界缺失等。,4、T-DNA的研究方向与价值,Our team,拟南芥幼苗的移植,用镊子小心地将幼苗从培养基中取出，移入土，此过程中注意保护幼苗的根部。用营养土和蛭石以1：1的比例混合拌匀配制，以保证营养及透气性。之前用高温杀菌以杀死土中的害虫。在不伤根的情况下用镊子尾部将幼苗小心插入挖好的小洞中，用土掩埋幼苗根部。掩埋过程中注意保持土质疏松。一般直径为8cm的小花盆中种植1-2株即可。,移植后幼苗的培养,幼苗移植后将花盆用塑料薄膜覆盖，置于21，6300（3
19、00）lx光照强度下，前4-6天，每隔两天浇一次营养液以保持土质湿润。当植株叶子出现明显伸长，茎开始发育时去掉薄膜。此后为使植株更好的生长和诱导开花，可将光照时间延长至14-16h。注意保持土质湿润。出现花芽时，一定保持水分供应，以促进果实发育。结有豆荚后，减少水分供应至每周一次，以促进种子成熟。,CTAB法提取拟南芥DNA,CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(0.7mol/LNaCl)，CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核
20、酸。通过有机溶剂抽提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后，加入乙醇沉淀，即可使核酸分离出来。,CTAB法原理,(1)将10mLCTAB分离缓冲液加入50mL离心管中，置于60C水浴中预热。(2)称取1.5g叶片，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎。(3)取1g粉末直接加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动使之混匀。(4)样品于65保温30分钟。(5)加等体积（10mL）的氯仿-异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀(6)室温下4000rpm离心10分钟。(7)用滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中，加入2/3体积的异丙醇，轻轻混匀，使核酸沉淀下来。（有些情况下，这一步可以产生用玻璃棒搅起来的长链
21、DNA，或者是云雾状的DNA，如果看不到DNA，样品则可以在室温下放置数小时甚至过夜）。,CTAB法提取拟南芥DNA,操作方法,CTAB法提取拟南芥DNA,操作方法,CTAB法提取拟南芥DNA,CTAB分离缓冲液2%CTAB，1.4mol/LNaCL,20mmol/L EDTA,100mmol/L Tris-HCL(pH8.0),0.2%巯基乙醇,-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。注意：CTAB溶液在低于15时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15,CTAB法提取拟南芥DNA,EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，因
22、DNase作用需要金属离子作为辅基，所以可抑制DNase活性；,Tris-HCl(pH8.0)（1）提供一个缓冲环境，DNA在此条件下较稳定。（2）在中性或碱性条件下，RNA 比DNA更易游离到水相，可 以获得RNA 含量较少的DNA样品。,NaCl提供一个高盐环境，破坏使蛋白质稳定的因素，使蛋白质与DNA分离并沉淀；盐的阳离子与DNA结合，形成DNA-阳离子盐溶于溶液中；使大量多糖存在溶液中。,异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。可以降低表面张力，从而减少气泡产生。有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。,氯仿：使蛋白质变性，加速有机相与水
23、相分层。且酚易溶于氯仿中。,异丙醇：夺取DNA周围的水分，使DNA能够聚集沉淀；优点是速度快，所需容积小，缺点是容易使盐类和DNA共沉淀，在DNA沉淀中难以挥发除去。,70%乙醇：在70%乙醇中，DNA是不溶的，而盐离子却可溶，可以洗去DNA表面的盐；除去异丙醇。,苯酚：使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用。用苯酚处理匀浆液时，由于蛋白与DNA 联结键已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。,(8)用下述方法收集DNA：如果呈可见的丝状DNA，可用玻璃棒搅起，转移至10-20mL，涤缓冲液中。如果DNA呈云雾状，可在2000rpm离心1-
24、2分钟，小心地倒掉上清液，在松散的沉淀上加10-20mL洗涤缓冲液，轻轻转动离心管使核酸沉淀悬浮起来。(9)洗涤至少20分钟。(10)按照（8）法重新收集核酸，并按照（9）法二次洗涤。(11)用玻璃棒搅出沉淀或2000rpm离心10分钟。小心倒去上清液，在室温下使DNA沉淀干燥。(12)将DNA沉淀溶于11.5mL TE中，20保存备用。,方法二,Edwardsbuffer200mMTris-HCl;200mMNaCl;25mMEDTA;0.5%SDS,SDS：一种离子型表面活性剂作用：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质
25、结合成为复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。（4）能抑制核糖核酸酶的作用。,方法二,（1）取新鲜的拟南芥叶片23片加入1.5ml的离心管中，加入400lEdwardsbuffer，用玻璃棒研碎。（2）振荡器上振荡5秒，室温下16000rpm/min 离心2分钟。（3）将300 l 离心后的上清液转移到干净的离心管里。（4）加入300 l 异丙醇，混匀后室温放置2分钟。（4）室温16000 rpm 离心5分钟。（5）去上清后用300 l 的70%乙醇洗沉淀，16000 rpm 离心5分钟，室温下干燥沉淀。（6）用100l1XTE(pH8.0)溶解DNA，温和振荡几秒钟，放置-20C 条件下保存。,4.2 T-DNA插入突变纯合检测（PCR鉴定）,反应条件：94（3min）；30循环（94/1min，5/1min，72/1min）；72延伸10min。,电泳检测,PCR反应过程中，准备0.8%的琼脂糖凝胶板。将完成PCR反应的管取出，取5 l PCR扩增反应物与上样缓冲液混合，点样，恒压100V电泳约30至45min。,
