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1、第三章微生物的代谢调节和代谢工程,2,微生物代谢的代谢类型和自我调节 酶活性、酶合成调节 分支生物合成途径的调节 能荷调节 代谢调控 次级代谢调节,本章内容,3,现代发酵工业要研究的主要内容就是通过改变培养条件和遗传特性，使微生物的代谢途径改变或代谢调节失控而获得某一发酵产物的过量产生。其方法大体可分为两类：多种方法育种选育基因突变株 控制培养条件，调节代谢,4,代谢调节(regulation of metablism）是指微生物的代谢速度和方向按照微生物的需要而改变的一种作用。酶活性的调节酶合成的调节,5,微生物代谢的控制是指运用人为的方法对微生物的代谢调节进行遗传改造和条件的控制，以期按照
2、人们的愿望，生产有用的微生物制品。,6,第一节 微生物代谢的代谢类型和自我调节,7,细胞内发生的各种化学反应的总称为代谢！,一、代谢类型,8,二、代谢调节部位（方式）,细胞透性的调节代谢途径区域化代谢速度的调控,9,1、细胞透性的调节,细胞质膜的透性直接影响物质的吸收和代谢产物的分泌，从而影响到细胞内代谢的变化。细胞质膜的透性的调节是微生物代谢调节的重要方式，由它控制着营养物质的吸收和产物分泌。,10,2、代谢途径区域化,原核微生物细胞结构虽然简单，但也划分出不同的区域，与某一代谢途径有关的酶系则集中某一区域，以保证这一代谢途径的酶促反应顺利进行，避免了其他途径的干扰。例如呼吸的酶系集中在细胞
3、质膜上；而与蛋白质合成有关的酶系则位于核蛋白体上；分解大分子的水解酶，在革兰氏阴性菌里是位于壁膜间隙中，而革兰氏阳性菌则将这些水解酶类，分泌于胞外。,11,在真核微生物细胞里，各种酶系被细胞器隔离分布。如与呼吸产能有关的酶系集中于线粒体内膜上；蛋白质的合成酶系位于核蛋白体上；DNA合成的某些酶位于细胞核里。,12,细胞具有复杂的膜结构使其代谢活动只能在特定的部位上进行，即代谢活动是区域化的，其实质是控制酶与底物接触，使各个反应有序地进行。,13,线粒体:丙酮酸氧化;三羧酸循环;-氧化;呼吸链电子传递;氧化磷酸化,细胞质:酵解;磷戊糖途径;糖原合成;脂肪酸合成;,细胞核:核酸合成,内质网:蛋白质
4、合成;磷脂合成,酶定位的区域化,14,3、代谢速度的调控,微生物通过调节酶的活性和酶量来控制代谢物的流量。微生物在不同条件下能按照需要，通过激活或抑制原有酶的活性或通过诱导或阻遏酶的合成来自我调节其代谢速度，使之高度经济有效地利用能量和原料进行生长繁殖。,15,第二节 酶合成的调节,16,一、酶合成的诱导,诱导酶是微生物需要它们时才产生的酶类，所以诱导的意义在于它为微生物提供了一种只是在需要时才合成酶、以避免浪费能量与原料的调控手段。,乳糖是大肠杆菌-半乳糖苷酶合成的诱导剂。,17,二、酶合成的阻遏,微生物代谢过程中，当胞内某种代谢产物积累到一定程度时，不仅可以反馈抑制产物合成途径中某种酶的活
5、性，还可以阻遏酶的继续合成。,18,1、末端产物阻遏由于终产物的过量积累而导致的生物合成途径中酶合成的阻遏称为终产物阻遏。常发生在氨基酸、嘌呤和嘧啶等这些重要结构元件生物合成的时候。正常情况下，当微生物细胞中的氨基酸、嘌呤和嘧啶过量时，与这些物质合成有关的许多酶就停止合成。,19,意义 有效地保证了微生物细胞内氨基酸等重要物质维持在适当浓度，不会把有限的能量和养料用于合成那些暂时不需要的酶。微生物通过终产物阻遏与反馈抑制的完美配合有效地调节着氨基酸等重要物质的生物合成。,20,2、分解代谢产物阻遏：葡萄糖效应 葡萄糖常对分解利用其他底物的有关酶的合成有阻遏作用，因为葡萄糖的分解代谢产物阻遏了分
6、解利用其他底物的有关酶合成的结果。分解代谢产物阻遏导致所谓“二次生长”，即先是利用葡萄糖生长，待葡萄糖耗尽后再利用另一种底物生长，两次生长中间隔着一个短暂的停滞期。,21,三、酶合成调节机制,单一效应物调节两种效应物共同调节弱化调节,22,第三节 酶活性的调节,23,一、激活,在激活剂的作用下，使原来无活性的酶变成有活性，或使原来活性低的酶提高了活性的现象。,24,代谢调节的激活作用：代谢物对酶的激活。前（体）馈激活，指代谢途径中后面的酶促反应，被该途径中较前面的一个中间产物所促进。代谢中间产物的反馈激活，指代谢中间产物对该代谢途径的前面的酶起激活作用。,25,前（体）馈激活和反馈激活示意图,
7、例1:糖代谢途径中丙酮酸积累激活丙酮酸羧化酶。例2：乙酰CoA的积累激活PEP羧化酶。,26,酶的反馈激活,27,二、抑制,抑制：由于某些物质的存在，降低酶活性的现象。可逆或不可逆。,28,三、酶活性调节的机制,变构调节化学修饰,29,变构调节(allosteric regulation)有些酶除了活性中心外，还有一个或几个部位，当特异性分子非共价地结合到这些部位时，可改变酶的构象，进而改变酶的活性，酶的这种调节作用称为变构调节。,具有变构作用的酶称为变构酶。变构酶分子组成，一般是多亚基的，分子中凡与底物分子相结合的部位称为催化部位(catalytic site)，凡与效应剂相结合的部位称为调
8、节部位(regulatory site)。,30,变构调节机制,31,化学修饰,某些酶蛋白肽链上的侧链基团在另一酶的催化下可与某种化学基团发生共价结合或解离，从而改变酶的活性，这一调节酶活性的方式称为酶的共价修饰。酶的共价修饰以磷酸化修饰最为常见。酶的共价修饰是体内酶活性快速调节的另一种重要方式。,32,第四节 分支代谢途径的调节,33,在有两种或两种以上的末端产物的分支合成代谢途径中，调节方式较复杂，其共同特点是每个分支途径的末端产物控制分支点后的第一个酶，同时每个末端产物又对整个途径的第一个酶有部分的抑制作用。分支代谢的反馈调节方式有多种。,分支代谢途径,34,一、顺序反馈抑制 seque
9、ntial feedback inhibition,分支代谢途径中的两个末端产物，不能直接抑制代谢途径中的第一个酶，而是分别抑制分支点后的反应步骤，造成分支点上中间产物的积累，这种高浓度的中间产物再反馈抑制第一个酶的活性。,35,36,二、同工酶的反馈抑制 isoenzyme feedback inhibition,同功酶是指能催化同一生化反应，但它们的结构稍有不同，可分别被相应的末端产物抑制的一类酶。其特点是：途径中第一个反应被两个不同的酶所催化，一个酶被H抑制，另一个酶被G抑制。只有当H和G同时过量才能完全阻止A转变为B。,37,38,三、协同反馈抑制concerted feedback
10、inhibition,在分支代谢系统中，几种末端产物同时都过量，才对途径中的第一个酶具有抑制作用，如果末端产物单独过量则对途径中的第一个酶无抑制作用。,39,40,例如，荚膜红假单胞菌中天门冬氨酸族氨基酸生物合成途径中，天门冬氨酸激酶(AK)是受末端产物赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制。,41,四、累积反馈抑制cumulative feedback inhibition,在分支代谢途径中各种末端产物单独过量时，它们各自能对途径中的第一个反应的酶仅产生较小的抑制作用。一种末端产物单独过量并不影响其它末端产物的形成，只有当几种末端产物同时过量时，才对途径中的第一个酶产生较大的抑制。,42,43,五、增
11、效反馈抑制cooperative feedback inhibition,增效反馈抑制既不同于协同反馈抑制又不同于累积反馈抑制。在一个分支代谢途径中，几种末端产物单独过量时，仅产生对共同途径的第一个酶部分的抑制。如果每种末端产物都过量时，其抑制作用则超过各种末端产物单独过量时抑制的总和。,44,45,46,复 习,47,酶合成调节（酶数量）,酶活性调节（酶结构）,激活（变构、化学修饰）抑制,诱导阻遏,48,第五节 能荷调节,49,一、能荷调节(Energy Charge Regulation),能荷指细胞中ATP、ADP、AMP系统中可为代谢反应供能的高能磷酸键的量度。能荷调节指细胞通过改变A
12、TP、ADP、AMP三者比例来调节其代谢活动，也称腺苷酸调节。,能荷,50,糖代谢的调节主要受细胞能荷的控制。,体系中ATP含量高时，ATP抑制磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的活性，使酵解减少；,当需能时，ATP分解为ADP和AMP。ADP、AMP增加、ATP的抑制作用被解除，同时ADP、AMP激活已糖激酶和磷酸果糖激酶，酵解增加。,51,能荷不仅调节形成ATP的分解代谢酶类（如磷酸果糖激酶、异柠檬酸脱氢酶、柠檬酸合成酶等）的活性；也调节利用ATP的生物合成酶类（如柠檬酸裂解酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶等）的活性。,52,第六节 代谢调控,53,但是，在工业生产中却往往需要单一地积累某种产品，这些产品的
13、量又经常是大大地超出了细胞正常生长和代谢所需的范围。,因此，要达到过量积累某种产品的目的，提高生产效率，就必须使原有的调节系统失去控制，在保证微生物适当生存的条件下，建立起新的代谢方式，使微生物的代谢产物按照人们的意志积累。,代谢反应的协调是通过细胞自身的代谢调控系统对细胞机能实行精细控制来达到的。,对于生命过程来说，代谢反应的协调是必要的；,54,实现代谢控制发酵的方法,1、控制发酵条件2、改变菌种的遗传特性3、改变细胞透性,55,一、发酵工艺条件的控制,发酵工艺条件-培养基（各种营养物质，不同的氮、碳源等）-pH-温度-溶氧-生物素-诱导物、前体,56,“添加诱导物或其类似物”,在诱导物就
14、是酶的底物的情况下，添加底物类似物来加强诱导作用是最好的。,因为底物类似物不易被所形成的酶分解，而在细胞中始终保持较高的浓度，能够持续地诱导酶的合成，获得较高浓度的酶。,例如:用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)可诱导-半乳糖苷酶的合成。,57,二、改变细胞透性,细胞内合成的发酵产物若要分泌到培养基中，必须经过细胞膜和细胞壁。如果产物不易分泌出细胞，而积累在细胞内，则会引起反馈调节。,改变细胞膜和细胞壁的通透性，使其有利于产物的分泌，也是降低末端产物浓度的一种途径。,58,采用生理学或遗传学的方法，改变细胞膜的透性。1、生理学方法 谷氨酸发酵生产生物素的浓度的控制；添加青霉素；表面活性剂 2、遗传
15、学方法 营养缺陷型菌株。如谷氨酸生产菌的油酸营养缺陷型，控制油酸，细胞膜合成不完整。,59,60,61,三、菌种遗传特性的改变,1、抗反馈突变菌株2、营养缺陷型菌株3、双重营养缺陷型菌株,62,1、抗反馈突变菌株,在以积累末端产物为目的的发酵生产中，如果代谢途径单一无分枝，往往不能选用营养缺陷型突变株。要提高产量，最好采用抗反馈调节突变株。,抗反馈调节突变株是一种解除合成代谢反馈调节机制的突变型菌株。其特点是所需产物不断积累，不会因其浓度超量而终止生产。,工业上，生产氨基酸、嘌呤、嘧啶和维生素的菌种大都是抗反馈突变株。,63,2、营养缺陷型菌株,64,65,3、双重营养缺陷型菌株,66,第七节
16、 次级代谢与次级代谢调节,67,初级代谢 微生物从外界吸收各种营养物质，通过分解代谢和合成代谢生成维持生命活动的物质和能量的过程。,初级代谢产物 微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。不同种类的微生物细胞中，初级代谢产物的种类基本相同。,68,次级代谢 次级代谢是在一定的生长时期（一般是稳定生长期），微生物以初级代谢产物为前体合成的对微生物本身的生命活动没有明确功能的物质的过程。,次级代谢产物 微生物通过次谢活动所大量积累的抗生素、生物碱、类萜（ferpenoid）、酚类、色素等。,69,一、次级代谢的调节类型,酶合成的诱导调节反馈调节
17、,70,1、酶合成的诱导调节,把一些对次级代谢产物产生有诱导作用的物质加入发酵培养基中可增加产量。,71,2、反馈调节,次级代谢产物的自身反馈抑制和反馈阻遏 分解代谢产物调节 初级代谢产物的调节 磷酸盐调节,72,次级代谢产物的自身反馈抑制和反馈阻遏,如青霉素、链霉素、卡那霉素等的生物合成途径中都发现末端产物的反馈调节作用。,73,分解代谢产物调节,碳分解代谢阻遏或抑制 能迅速被利用的碳源（葡萄糖）或其分解代谢产物，对其他代谢中的酶（包括分解酶和合成酶）的阻遏和抑制。葡萄糖是菌体生长良好的碳源和能源，但对青霉素、头孢菌素、卡那霉素、新霉素、丝裂霉素等都有明显降低产量的作用。,74,3、防止碳分
18、解代谢阻遏或抑制的发生,青霉素发酵中限量流加葡萄糖或糖蜜以减少碳分解阻遏的发生。,使用寡糖、多糖等缓慢利用的碳源。,加入影响糖代谢的硫氰酸苄酯可使金霉菌对葡萄糖的利用速度减慢，增加金霉素的产量。,75,氮分解代谢产物的抑制作用 以铵盐作为链霉素产生菌的唯一碳源，可抑制链霉素的合成。避免使用高浓度的铵盐作氮源以防止氮代谢阻遏的发生，是抗生素工业成熟的经验。,76,初级代谢产物的调节,次级代谢产物与初级代谢产物有一条共同的合成途径；初级代谢产物直接参与次级代谢产物的合成。,77,78,磷酸盐调节,磷酸盐在微生物的生长和代谢产物合成中起着重要的作用，高浓度的磷酸盐对抗生素等次级代谢产物的合成表现出较
19、强的抑制作用。磷酸盐对次级代谢产物的抑制主要是通过抑制酶或导致细胞能荷变化等。,79,二、常用的提高次级代谢产物产量的方法,1、补加前体类似物2、加入诱导物3、防止碳分解代谢阻遏或抑制的发生4、防止氮(磷)代谢阻遏的发生5、筛选耐前体或前体类似物的突变株6、选育抗抗生素突变株,80,1、补加前体或其类似物在合成途径已基本清楚的条件下，向发酵培养基中补加前体是增加次级产物的有效方法。如青霉素G的生产中，苯乙酰-CoA是限速性因子，补加苯乙酸或其衍生物都能增加青霉素G的产量。,81,2、加入诱导物 把一些对次级代谢产物产生有诱导作用的物质加入发酵培养基中会增加产量。如加蛋氨酸或硫脲可使顶头孢霉增产
20、头孢霉素C，加入巴比妥可提高利福霉素产量等。但在工业生产中还未普遍应用此技术，而只是在选择培养基组成时给以考虑。,82,3、防止碳分解代谢阻遏或抑制的发生青霉素发酵中限量流加葡萄糖(或糖蜜)以减少碳分解阻遏的发生，是一项很有效的提高产量的方法。使用寡糖、多糖等缓慢利用的碳源能减少碳分解阻遏的发生。加入影响糖代谢的硫氰酸苄酯可使金霉菌对葡萄糖的利用速度减缓，可增加金霉素的产量。,83,4、防止氮(磷)代谢阻遏的发生避免使用高浓度的铵盐做氮源，以防止氮代谢阻遏的发生，是抗生素发酵工业生产中比较成熟的经验。在抗生素产生期如补加氮源则会造成发酵逆转，返回生长期，抗生素的产量会大为减少。使用亚适量(对菌
21、体生长)的磷酸盐，亦是抗生素发酵工业中遵循的原则之一。为防止氮、磷分解阻遏的发生，应选用黄豆饼粉、蛋白胨类物质为主要原料，而尽量少用易被迅速利用的无机氮源。,84,5、筛选耐前体或前体类似物的突变株 加入前体有提高次级产物产量的效果；但过量对菌体又会有毒。筛选对前体有抗性的突变株可以减少或消除前体的反馈阻遏，从而可获得高产。如抗苯乙酸的青霉突变株，其青霉素的产量会增加。半胱氨酸、缬氨酸是-内酰胺类抗生素的前体，筛选上述氨基酸的结构类似物(三氟亮氨酸、D-缬氨酸)的抗性菌株，其-内酰胺类抗生素产量会提高。,85,6、选育抗抗生素突变株链霉素、氯霉素、金霉素筹多种抗生素都具有抑制产生自身菌体蛋白质的能力。一株高产抗生素产生菌，必然应具备对自身所分泌的抗生素的抗性。筛选抗抗生素产生菌也就成了菌种选育中的常用方法。如：金霉素、链霉素产生菌的抗性菌株，产量有数倍增加。,86,思考题,1.微生物代谢调控有哪些方式？,
