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1、细胞周期与调控,内容,细胞周期概念细胞周期调控网络 Cyclins CDKs CKIS调控网络,人来源于人 人的繁殖“一切细胞来自细胞”细胞的增殖,细胞增殖(cell proliferation)是细胞通过生长和分裂使细胞数目增加的过程。,细胞增殖是细胞生命活动的基本特征之一,细胞增殖?,细胞周期与调控,细胞增殖有十分精确的调控机制，表现出精确的平衡和严格的时间及空间的顺序性和周期性，如果异常就会产生疾病。如造血细胞生成的速率小于血液中细胞死亡的速率，就会造成贫血；机体局部细胞无休止的分裂就会产生肿瘤；细胞增殖过程中染色体分配异常就会导致染色体病。所以探讨细胞增殖的机理对于医学的理论和实践有十
2、分重要的意义。,第一节 细胞周期的基本概念,一、细胞周期（cell cycle)细胞增殖的顺序性和周期性：,（一）细胞增殖周期概念,细胞周期：指连续分裂的细胞从亲代细胞分裂结束开始到子代细胞分裂结束为止所经历的全过程，简称细胞周期(cell cycle)。,何为细胞周期?,DNA合成前期(G1期)间期 DNA合成期(S期)DNA合成后期(G2期)细胞周期 分裂期（M）前期、中期、后期、末期,“圆”常用于表示周期性概念,（二）细胞周期时间,不同生物或不同 组织细胞的周期时间可以有很大差别:有的只需几十分钟，如早期胚胎细胞；有的要几十个小时，如某些上皮细胞和离体培养细胞；也有的要1-2年（肝、肾实
3、质细胞）甚至更长的时间。,细胞周期时间(cycle time，TC)细胞增殖过程所经历的时间则称为细胞周期时间。,何为细胞周期时间?,不同细胞的周期时相差别很大：,TC TG1 TS TG2 TM TC TG1小鼠食道上皮 87 75 7.2 4.1 0.7 12小鼠腹壁上皮 151 139 6.2 5.3 0.5 12 人大肠粘膜 24 10 11.5 2 0.5 14 人宫颈癌 20 8 6.8 4.5 1.5 12人羊膜 19.4 9.8 6.8 2.2 0.6 9.6大鼠肝 47.5 28 16 1.8 1.7 15.5人肺成纤维细胞 16.8 6 6 4 0.8 10.8,细胞,时相
4、(小时),从表中可看出:,不同细胞的TC差别很大TC与 TG1的变化一致TS+TG2+TM 值比较稳定,约12-24小时TM 较小,约1小时左右可见,G1期时间决定细胞周期时间,二、细胞周期各时相的划分,合成前期（期）细胞增殖周期（TC）合成期（期）合成后期（期）分裂期（M）细胞周期各个阶段所需时间分别为:TG1、TS、TG2、TM TC=TG1+TS+TG2+TM 单位:小时,持续增殖细胞 不断进入周期，进行分裂，如皮肤生发层细胞，骨髓造血 细胞等。暂不增殖细胞 又称期细胞，如肝肾的部 分细胞。肝切除后开始分裂修复。不增殖细胞 即细胞失去增殖能力，合成（分化细胞）其功能性蛋白而走向分化，又称
5、不育细胞或终末细胞。,根据细胞增殖状态，将机体细胞分三类：,1期细胞三种去向：,0 期细胞的特点：表型分化的细胞，其性质与1期相似，因此，可视为延长了的1期细胞 暂停分裂 可恢复增殖能力 对药物的敏感性差,期细胞即部分G1期细胞离开周期暂停分裂,当给予适宜的刺激时又可进入周期开始分裂，这类细胞称为0期细胞。如肝细胞、肾细胞等,什么是G0细胞?,细胞周期各时相生化特点的总结,G1 S G2 M G1A G1BRNA合成 S期需要的酶 DNA复制 有丝分裂因子 染色质组装为蛋白质合成 及前体物质 组蛋白、及微管蛋白的合成 染色体，均等核糖体形成 的合成 非组蛋白合成 分配入子细胞（细胞生长（为DN
6、A复（为细胞分裂 胞质分裂 物质积累）制做准备）做准备）,细胞周期的特点有：,单向性 即细胞只能沿G1SG2M方向推进而不能逆行阶段性 在4个连续的时相中，细胞的形态与代谢特点有较明显的差异，细胞可因某种原因在某时相停滞(arrest)下来，待生长条件好转后，细胞可重新活跃起来过渡到下一时相。,试想一想，46条染色质（每条染色体DNA长度约40000 m）绕在一个很小的范围内(细胞核直径约30m），如何平均分配？,染色体形成的意义完成遗传物质的平均分配,只有绕成一个个线团，才能平均分配。,调控元素：细胞周期素(cyclin)细胞周期素依赖激酶(cyclin-dependent kinase，C
7、DK)细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDK inhibitory protein CKIS）Cyclins CDKs CKIS调控网络,第二节 细胞周期调控,背景,成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF)=CDK1(cdc2)+cyclinB,1983年，Evans等首次在海洋无脊椎动物中发现一组蛋白质呈周期性出现，并调节细胞的生长，其被确定为细胞周期蛋白(细胞周期素)。,细胞周期蛋白（cyclin）,至少发现有11种不同的cyclin，分别为A、B1、B2、C、D1、D2、D3、E、F、G和H。其中8种主要的cyclin己被分离。根据cyclin调控细胞
8、周期时相的不同，可分为G1期和M期两大类。,（一）G1期胞周期蛋白（G1cyclin）作用在G1期或G1/S交界期，启动细胞周期和促进DNA合成的cyclin，G1期是增殖细胞唯一能接受从外界传入的增殖或抑制增殖信号的时期。cyclin D：cyclin D1、cyclinD2、cyclin D3 cyclin C cyclin E：cyclin E1、cyclin E2,1、cyclin D cyclin D能激活CDK6，驱动细胞通过START。它有3个亚型，包括D1、D2、D3，具组织特异性。在细胞周期的调节中cyclinDl是一个比其它cyclins更加敏感的指标。cyclin D1全
9、长约15kb，最小，该蛋白半衰期很短，不足25min。在有生长因子的情况下，cyclin D1在细胞周期中首先被合成，并于G1中期合成达到高峰，cyclln D1的功能主要是促进细胞增殖，是G1期细胞增殖信号的关键蛋白质，被视为癌基因，其过度表达可致细胞增殖失控而恶性化。cyclinD2的编码基因位于12p13，称为CCND2，在正常的二倍体细胞及Rb阳性肿瘤细胞中cyclin D2的表达呈波动状态，其峰值在G1晚期。给G1期细胞微量注射cyclinD2抗体，可使表达cyclin D2的淋巴细胞停滞在G1期，说明cyclin D2是细胞从G1期向S期转移所必须的。cyclin D3称为CCND
10、3。正常和恶性组织中未见cyclinD3基因异常及其蛋白的过度表达。目前认为cyclinD3似乎不直接反映恶性度，而是肿瘤发展到晚期的结果。,2、cyclin C cyclin C与所有cyclin的同源性最低，主要在果蝇及人类细胞中发现，它与其他G1-cyclin不同的是其mRNA和蛋白质水平在G1早期达最高，可能在G1早期发挥作用。,3、cyclin E cyclin E在cyclin D之后出现，于G1S转化过程中表达，人类cyclin E基因定位于染色体19q12-q13。cyclin E中13段为高度保守区，称为周期蛋白盒，此为CDKs结合所必须。在G1晚期发挥正调控细胞周期的作用。
11、cyclin E蛋白的C端存在PEST序列(一个富含脯氨酸（P）、谷氨酸（E）、天冬氨酸（S）、丝氨酸和苏氨酸（T）残基的PEST序列，在蛋白质转化和降解中起作用)。cyclin E基因及其产物的表达在细胞周期的G1中期上升，至G1晚期或S早期达高峰，然后经与“PEST”序列有关的蛋白水解或与S期激酶相关蛋白-2(S-phase kinase-associated protein SKP2）泛素路径降解而迅速下降。缺乏SKP2的细胞表现cyclin E蛋白降解不足并不断积累。,（二）M期细胞周期蛋白（M-cyclin）在G2M交界期诱导细胞分裂的cyclin。cyclin A：cyclin A
12、是G1期向S期转移的限速因素，也可促进细胞从G2期向M期的转化。cyclin B：cyclin B是有丝分裂蛋白激酶的一个亚单位，能促进G2期向M期的过渡。哺乳动物cyclin B在S晚期合成。cyclin A与cyclin B之间存在多种差异（1）周期积累方式不同，cyclin A含量在S期及G2期初最高，cyclin B在G2期末含量最高；（2）结合的催化亚基不同；（3）功能不同，cyclin A在S期发挥作用，与DNA的复制完成有关，cyclin B在G2M交界期发挥作用，诱发细胞分裂；（4）对细胞分裂的影响不同，cyclin B持续升高可使细胞停滞于分裂期，而cyclin A的持续升高
13、并不影响细胞分裂的完成。,二、细胞周期素依赖激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)CDK是一类重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，包括CDK17种。催化亚基 CDK 复合物 调节亚基 cyclin。ATP的结合部位,三、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDK inhibitory protein CKIS）CKIS是CDK抑制蛋白，通过竞争性地抑制cyclin或cyclinCDK复合物，导致cyclin生物学功能丧失；G1期CKIS有2个蛋白家族：（一）INKs：p15、p16、p18、p19 是CDK4和CDK6的特异性抑制物。（二）CIP KIPs：p21、P27、p57等
14、，抑制各种cyclin-CDK复合物，阻止CDK激酶的激活，或阻止活化的CDK激酶活性。,1、P16 p16INK4又称多肿瘤抑制基因(multiple tumor suppressor MTSI)，是CDK4的特异性抑制物，可与cyclin D竞争与CDK4或CDK6的结合，抑制CDK4对细胞生长分裂的正向作用，参与抑制细胞周期G1S的转化。p16在缺乏功能性Rb的细胞中水平上升，提示Rb可能抑制p16的表达，同时Rb刺激cyclin D的表达。2、p15INKB p15INKB与p16一样属抑癌基因。3、P27 P27可能是最直接地影响G1/S期限制位点的调控。广泛抑制cyclinCDK复
15、合物。正常情况下P27在G0G1时表达增高，进入S期后表达下降。人的p27cDNA全长594bp，编码198个氨基酸，是高度保守的蛋白分子。其N末端介导抑制CDK，约12-87氨基酸主序列与p21同源。,p27表达水平受多种因素调控，如有丝分裂原、抗增殖信号因子、细胞因子、癌基因子及接触抑制等。TGF-和接触抑制能共同调控转录 p27和p15，其负调节信息的共同通路是抑制CDK和G1cyclin功能，发挥CKI抑制作用。TGF-对p27表达的影响是双相的，在大多数细胞中，TGF-可诱导p27的表达，但是在正常垂体前部和垂体瘤细胞中，TGF-可下调p27mRNA及蛋白的表达。PDGF、EGF等也
16、可下调p27的表达。p27对细胞周期的调控主要依赖于其蛋白表达水平，而非基因突变。p27的表达下降或缺失会引起基因组不稳定，甚至导致肿瘤发生。,4、p21 p21基因位于染色体6p212，第17-71氨基酸含有cyclin结合抑制区。p21可能阻碍细胞进入S期；能抑制SAPK(stress-activated protein kinase)，参与细胞应激状态时的信号转导级联系统的调节。,细胞受丝裂原刺激后合成cyclin的时序和相对浓度,Cyclin B的降解途径,细胞周期素及与之对应的CDKs,细胞周期的调控可分为外源和内源性调控,外源性调控主要是细胞因子以及其它外界刺激引起；内源性调控主要
17、是通过CyclinCDKCDI的网络调控来实现。,调控中各元素间的相互作用,图1.cyclin、CDK及CDKI 相互关系,各种细胞周期蛋白随特定细胞时相而出现。G1早期，cyclinD表达并与CDK2或CDK4结合，成为 始动细胞周期的启动子；G1晚期、进入S早期后cyclinE表达，并与CDK2结合，推动细胞进入S期；进入S期后，cyclin A表达，cyclinD、cyclin E降解；S晚期、G2早期，cyclIin A、cyclin B表达，并与cdc2(CDK1)结合，促进细胞进入M期。,cyclin A 和CDK2相结合可以调节S期进入G2期；cyclin Bl2可与CDKl结合
18、并在G2M转化期间活性达到最高峰；与cyclin C匹配的CDK及其酶解底物尚不清楚；cyclinH与cyclinC有较高的同源序列，可以和CDK7装配成全酶对细胞周期各阶段行使调节作用。,细胞转录因子（E2F）在许多DNA合成基因和细胞生长调控基因的启动子中均含有E2F的位点，E2F可以直接活化这些基因，启动DNA合成使细胞进入S期。在E2F基因活化转录功能区内有一段18个氨基酸的序列可与Rb结合，Rb通过与E2F功能区的结合遮盖其功能区，抑制其活性转录功能，抑制DNA合成。E1A的介入，释放出更多的游离E2F，影响着一些与转化表型有关的特定基因表达。,Rb基因 Rb基因位于人类染色体13q
19、14，其转录产物Rb蛋白是主要的转录信号连接物，在细胞周期中起制动器功能。它能与转录因子E2F结合并阻止相应基因转录表达，从而抑制细胞生长。cyclin D是Rb调节细胞周期的基础。cyclin D1-CDK4复合物可看做G1期Rb蛋白激酶，它能结合Rb的N末端，磷酸化Rb蛋白，使转录因子释放，导致G1S转化。,cyclin D1与Rb的功能是相互依赖的 低磷酸化的Rb还可刺激cyclin D1的转录，使其合成增加，并活化再导致Rb磷酸化，这样形成负反馈环以调节cyclin D1的表达。CyclinE-CDK2的作用是通过正反馈以促进Rb磷酸化和E2F的释放。,P21和p27抑制cyclin-
20、CDK复合物的负性调节作用 P21结合并抑制多种cyclin-CDK复合物，负性调节CDK功能，实验证明，正常细胞多数cyclin-CDK复合物都与p21结合，而多数转化细胞中则不结合。P21是P53作用的靶点，p21启动子含有P53结合位点。G1期DNA损伤可激活p53，诱导P21转录，导致cyclin D-CDK4和cyclin E-CDK2抑制，从而阻止细胞进入S期，使损伤DNA得到修复。p21在p53介导的DNA损伤所致的G1期停滞中起重要作用。,P53 P16 介导 抑制CDK4 p21 CDK4 cyclinD1 抑制CDK4 活化CDK4 P cdk介导的磷酸化 Rb Rb P
21、E2F 无活性复合物 E2F启动 DNA转录 G1 S DNA转录,CDK活性状态是以磷酸化形式存在的。CAK（CDK激活酶）可诱导CDK磷酸化，而p27通过与CDK亚单位的结合，使CAK不能与CDK直接发生作用。非活化的CDK不能使Rb蛋白磷酸化，使细胞停留在G1期，对细胞周期进行负调控。P27还可阻止Rb蛋白磷酸化，其过度表达能抑制细胞进入G1期。p27在调节细胞进入和退出M期中起重要作用，抗丝裂原环境中细胞生长停滞与p27CDK2复合物的量相关。,细胞周期阶段 cyclin-CDK复合物 抑制因子 P16 P21 P27 G1 cyclinD1-CDK4 G2/S cyclinE-CDK
22、2+S cyclinA-CDK2+G2/M cyclinB-CDK2+,问题与展望 细胞周期通常受到信号传导途径和反馈环路的精确调控,其正常与否和细胞以及个体的生长、分化、衰老和癌变密切相关。经过一个完整的细胞周期后，有的细胞继续增殖,有的细胞可能暂不增殖或永不增殖。决定细胞周期后各类细胞命运的关键则是细胞周期的调控。目前对细胞周期的调控研究已作为生命科学研究的热点，随着研究的深入将进一步揭示细胞周期调控的分子机制、细胞信号传导途径、恶性肿瘤癌变机制，将对认识细胞生长的动力学、有目的的调控细胞周期、对肿瘤的防治干预具有重要的指导意义。,生长因子与生长因子受体周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶,细胞增
23、殖的调控,细胞增殖与医学,肿瘤的恶性增殖：有机体局部器官组织的细胞超常增殖，其所形成的赘生物称为肿瘤。肿瘤组织的细胞也有三种增殖状态：、增殖型、暂不增殖型、永不增殖型,细胞周期和肿瘤治疗 1、0期的肿瘤细胞对化疗药物不敏感，又具有肿瘤复发的潜在危险性。根据细胞增殖的调控机理，可以利用血小板源生长因子激活0期细胞，将它们驱入期，进入增殖状态，再用理化疗法就可以收到较为理想的效果。、细胞周期和用药 根据细胞周期代谢活动特点选用不同的治疗药物是临床治疗的常规方法。、用细胞或基因植入进行治疗 抑癌基因的导入或原癌基因的置换等进行基因治疗被认为有深远前景。,三、细胞周期的检查机制,细胞周期最主要的任务是
24、将其基因组DNA在DNA合成期(S期)完整地复制成两份拷贝,然后在分裂期(M期)将这两份拷贝正确无误地分配给两个子代细胞。细胞在长期的进化过程中发展出了一套保证细胞周期中DNA复制和染色体分配质量的检查机制,通常被称为细胞周期检查点(check-point)。细胞检查机制的含义是细胞周期内部事件的有序进行基于一种依赖关系，即下游事件的启动依赖于上游事件的完成，当下游事件完成后产生一个信号，然后由细胞周期上游的应答元件作出反应，故也称为反馈机制。细胞周期检查机制障碍与肿瘤、衰老、凋亡等的发生有密切关系。,细胞周期检查点分为：,G1/S检查点（start）：负责监控细胞的大小和环境是否合适，DNA
25、有无损伤,也称为DNA损伤检查点(DNA damage check-point);S期检查点：负责DNA复制的进度,称为DNA复制检查点(DNA replication check-point);G2/M期检查点：监控复制完的染色体是否还有损伤，细胞的体积是否足够大等。M中期/后期检查点：监控纺锤体是否组装完成，管理染色体的正确分配与否,也称为纺锤体组装检查点或纺锤体装配检查点(Spindleassemmblycheckpoint),因为染色体的分配主要依赖于纺锤体的作用。检查点的实质是细胞内感受异常事件的信号传导通路。,DNA损伤检查点(DNA damage check point),一般认
26、为,DNA损伤的出现可以迅速地激活DNA损伤检查点。由于DNA损伤可以发生在细胞周期的任一个时期,包括G1期、S期、G2/M期中,且DNA损伤有许多种类,所以存在多种探测DNA损伤的手段。它们可以在不同的时期对特定的DNA损伤进行检测。在G1期DNA损伤时,可以引起p53的积累和活化;p53则可以诱导p21的转录。p21蛋白结合在Cdk4/6或Cdk2上,造成G1期的休止。最近又发现p53和p21的活性对于维持G2期的休止也是必需的。,DNA复制检查点(DNA replication check-point),DNA复制检查点在检测DNA复制的完成情况时,常常是通过参与DNA复制的蛋白质来进行
27、。有实验表明,DNA合成酶Pol和复制因子RFC的亚基Rfc5就负有探测的功能。DNA复制检查点的机理研究发现,其工作方式也主要是采用磷酸化。检查点除了要停止细胞周期的运行外,还需要修复损伤或排除故障。PCNA是DNA复制机器中一个重要的辅助蛋白。越来越多的研究表明,PCNA既可以同检查点蛋白如p21结合,又能与DNA修复蛋白或DNA连接酶I结合。通过这种连接,细胞就能修复DNA损伤。,纺锤体组装检查点(Spindle assemmbly checkpoint),染色体的移动依赖于纺锤体微管蛋白结合在着丝点上的运动。参与该检测点最重要的2类基因是MAD和BUB。MAD2和BUB1存在于尚未结合
28、微管的动粒上,这两种蛋白在着丝点上可以探测动粒与微管的结合。研究证实，用激光特异地破坏尚未与微管联结的动粒，发现尽管染色体依然滞后，细胞周期却可以随之向下一阶段转化。提示未与微管联结的动粒确实可以发出抑制信号，抑制细胞周期向下一阶段运转。,细胞周期检查点的特点,首先,检查点的机制很保守,从酵母到哺乳动物细胞都很相似,许多酵母细胞的检查点蛋白质都有哺乳动物细胞的同源蛋白质。其次,蛋白质的磷酸化调控被细胞周期检查点用作信号传递的主要方式。最后,检查点通过关闭细胞周期的引擎CDK来中止细胞周期的运行。,思考题,1、细胞周期各时相的特点。2、简述细胞周期的cyclins-cdks-ckIs网络调控系统概念。,
