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1、实验四 线粒体和液泡系的超活染色与观察,一、实验目的,学习并了解线粒体和液泡系超活染色的基本原理、方法和注意事项；了解植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布；,二、实验原理,活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。,根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的
2、。体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。,活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的“电化学”特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但不是任何染料皆可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性较小的染料，而且总是要配成稀淡的溶液来使用。一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质（如卵磷脂、胆固醇等）的特性，易于被细胞吸收。詹姆斯绿B（Janus green B）和
3、中性红（neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。,詹纳斯绿 B是线粒体的专一性活体染色剂，线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态（即有色状态）呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。,中性红为弱碱性染料，3-氨基-6甲氨基-2-甲基吩嗪盐酸盐。对液泡系的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。,线粒体是细胞内重要的细胞器，线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶能使詹姆斯绿B保持在氧化状态，呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而细胞质中的染料被还原成无色。液泡是细胞内
4、浓缩产物的主要场所，有十分重要的功能。中性红是液泡的特殊染色剂，将液泡染成红色。在活细胞中，细胞质和细胞核不着色。如果细胞死亡，染料会弥散开来，使核着色。,三、实验用品,（一）器材显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、载玻片、载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸等。,（二）试剂,1、Ringer 溶液 氯化钠0.85g（变温动物用0.65g）；氯化钾 0.25g；氯化钙 0.03g；蒸馏水100ml2、10%、1/3000中性红溶液 称取0.5中性红溶于50ml Ringer溶液，稍加热（3040度）使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力
5、。临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml，加入29ml Ringer溶液混匀，装入棕色瓶备用。31%、1/5000詹姆斯绿B溶液 称取50mg詹姆斯绿B溶于5ml Ringer溶液中，稍加 微热（3040度）使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。取1%原液1ml加入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液，装入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。,（三）材料,人口腔上皮细胞小麦根尖细胞,四、实验步骤,（一）线粒体的超活染色与观察1、线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和数量虽不同物种、不同组织器官和不同的生理状态而发生变化。1）人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察
6、取清洁载玻片放在37恒温水浴锅的金属板上，滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液。,实验者用牙签宽头在自己口腔颊部粘膜处稍用力刮取上皮细胞，将第一次刮下的粘液状物洗去，将第二次刮下的粘液状物放入载玻片的染液滴中，染色1015min（注意不可使染液干燥，必要时可再加滴染液），盖上盖玻片，用吸水纸吸去四周溢出的染液，置显微镜下观察。在低倍镜下，选择平展的口腔上皮细胞，换高倍镜或油镜进行观察。可见扁平状上皮细胞的核周围胞质中分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构，即线粒体。,四、实验步骤,二、液泡系的超活染色与观察,中性红为弱碱性染料，对液泡系（即高尔基体）的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红
7、色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。,小麦根尖细胞液泡系的中性红染色观察,实验前，把小麦培养在培养皿内潮湿的滤纸上，使其发芽，胚根生长到1cm以上备用。用双面刀片把小麦幼苗根尖（约12cm长）小心切一纵切面，放入载玻片上的1/3000中性红染液滴中，染色510min。吸去染液，滴一滴Ringer液，盖上盖玻片，并用镊子轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察。在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。在成熟区
8、细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分空间，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。,小麦根尖液泡系（1）,小麦根尖液泡系（2）,六实验中的注意事项,1、詹姆斯绿B溶液现用现配，以保持它的充 分氧化能力。2、实验中速度要快，以免组织细胞死亡。,细胞生物学实验绘图方法与要求1、在仔细观察的基础上，选择典型结构进行描绘，要求真实、准确（注意各部分结构的比例关系）。2、用铅笔绘图，线条要明确清晰，图的深浅明暗一律以点的疏密来表示，点要圆而一致，不得涂暗影或进行其它美术加工。3、各部结构名称要在图的一侧引直线注明。各引线要平行不得交叉。4、每幅图的大小、位置在纸面上必须安排得当，并注意纸面的整洁。,实验报告,实验目的实验用品实验原理实验方法思考题,思考题,1.绘洋葱表皮细胞线粒体的形态与分布2.绘示小麦根尖液泡系的形态与分布3、什么是活体染色？要想获得体外活体染色成功，我们应注意哪些问题？,活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法，其目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何理化变化以致引起细胞死亡。要想获得体外活体染色成功，我们应注意：（1）保证所取材料的活性。通过控制温度和加入缓冲液实现。（2）保证染色剂的状态。可以通过现用现配和棕色试剂瓶保存来保证染色剂的化学性质不发生变化；用浓度较低的染色剂来保证对细胞无毒或伤害较小。,
