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1、免疫学进展一免疫学技术及其应用研究进展,柳忠辉吉林大学基础医学院免疫学系,免疫学技术发展的历史免疫学技术发展的现状免疫学技术研发和应用的展望,现代免疫学技术：具有高特异性、高灵敏性及其微量化检测的特点，几乎可以在体液、细胞以及组织等多个层面，进行定性、定位以及定量检测各种物质，并能高效纯化蛋白和分选细胞。已成为生物制药、研究细胞发育、分化、凋亡以及干细胞移植等领域不可或缺的实验手段。学习免疫学技术的发展历史，希望通过了解免疫学技术的创建过程，能够给从事相关研究者带来创新思维的启迪；另外，了解现代免疫学技术的进步及其在科学研究领域的应用，希望能为相关学科的研究开辟新的思路。,免疫学技术发展的历史
2、 1890年德国学者Behring和日本学者Kitasato 应用白喉外毒素免疫动物，发现在其血清中存在可与外毒素结合的物质，并命名为抗毒素。1891年Behring应用免疫动物抗血清成功治疗了一例白喉患者，这是利用抗毒素被动免疫治疗疾病的第一个实例，Behring也因此贡献，于1901年获得首届生理学医学诺贝尔奖。伴随抗体及补体的发现，定性、定量及定位检测抗原、抗体以及补体的免疫学方法逐步建立。,一、经典免疫学技术1、血清学检测技术的建立 凝集反应、沉淀反应、补体结合试验、琼脂凝胶免疫扩散技术、免疫溶血空斑试验等。1896年Max G和Herbert D发现颗粒性抗原细菌与抗血清反应，在适当
3、电解质存在条件下可以出现肉眼可见的凝集现象，即细菌凝集反应。1902年Landsteiner K建立了血型凝集试验，最终确定了人类ABO血型，奠定了同型血输血的基础，Landsteiner本人也因发现人类血型的伟大贡献于1930年获得生理学医学诺贝尔奖。,1897年鲁道夫克劳斯（Rudolph Kraus）发现细菌毒素与抗毒素作用出现沉淀反应，即可溶性抗原与抗体在电解质参与下出现的肉眼可见的沉淀现象。1948年Jacque O和Orjan O进一步建立了琼脂凝胶免疫扩散技术。,2、免疫化学研究,免疫学研究早期主要集中于蛋白质类抗原、抗体以及补体方面，因此。更多地借助于生物化学实验手段，进行抗原
4、特异性及表位分析、抗体纯化和性质研究等。1906年，Friedrich利用生物化学技术研究蛋白质抗原，发现化学处理能够改变蛋白质抗原的免疫原性。1907年斯万特阿列纽斯（Svante A）进一步提出免疫化学（Immunochemistry）的概念，利用生物化学修饰、蛋白质层析以及电泳等技术进行抗原纯度、特异性表位分析、抗体纯化和性质研究。,图2 修饰抗原与抗体反应,1939年阿恩提塞留斯（Arne Tiselius）和埃尔文卡巴特（Alvin Kabat）利用血清电泳技术确定人外周血白蛋白、及球蛋白，发现抗体结构属于球蛋白。,二、现代免疫学技术,早期的经典免疫学技术，虽然方法简捷、也具有较高的
5、免疫反应特异性，但均存在一个致命的缺点检测敏感性较低。如沉淀反应所能检测的抗原浓度通常要达到g/ml水平，虽然间接凝集抑制实验等提高了检测敏感性，但抗原浓度通常也要大于10 ng/ml水平。,1、标记抗原-抗体技术的建立1941年艾伯特孔斯（Albert H Coons）创建免疫荧光技术。1955年Coons、Leduc和Connolly等进一步发展和完善了荧光抗体免疫组织化学染色技术，免疫荧光技术通常是指利用异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）以及藻红蛋白（phycoerthrin，PE）等荧光物质标记抗原或抗体，用以检测相应抗体或抗原的技术。,免
6、疫荧光染色结果,FITC标记抗体染色 PE标记抗体染色,放射性免疫检测技术,1960年Yalow RS和Berson S创建了放射免疫检测技术（radioimmunoassy，RIA）用于血清胰岛素水平测定，Yalow也因此项技术，成为历史上第二位女性诺贝尔奖获得者。该方法具有极高的敏感性，其检测感度可达pg/ml以下；由于采用的是竞争法，只需要一个抗原表位，因此，在检测半抗原上具有不可替代的优势。,Radioimmunoassay,RIA,51Cr释放法检测细胞毒示意图,51Cr,靶细胞,效应细胞,Sternberger L建立了免疫酶技术（EIA），其原理是利用酶替代同位素标记抗原或抗体，
7、抗原与抗体反应后，通过酶作用于底物出现的颜色反应强弱，确定抗原或抗体的量。1971年Engvall和Perlaman等又创建了非均相酶免疫技术酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），其原理是利用酶标记抗原或抗体，再与结合在固相支持物上的抗原或抗体反应，由于形成的酶标记抗原-抗体复合物结合在固相支持物表面，而未结合的酶标记抗原或抗体则存留在液相中，通过洗涤固相物而将游离抗原或抗体与结合的抗原-抗体复合物分开。,酶免疫细胞化学染色结果,对照 抗体染色,1971年Faulk和Taylor将胶体金与抗体结合，再与相应抗原反应，建立了早期的免疫
8、胶体金电子显微镜技术。胶体金颗粒具有电子密度高的特点，电子显微镜下呈黑色颗粒状。研究发现胶体金颗粒的颜色与颗粒大小有关，当胶体金颗粒直径大于20nm时，呈现砖红色，颗粒更大时肉眼可见。因而利用胶体金技术相继开发出胶体金快速斑点渗滤技术，用于临床快速诊断，如在临床诊断中使用的人绒毛膜促性腺激素（HCG）快速诊断玻璃纤维滤纸。,1978年Velan和Halman又进一步建立了高敏感性的化学发光免疫测定法（chemiluminescence linked immunoassay，CLIA）。其原理是过氧化物酶可促进底物（H2O2）释放O-离子作用于鲁米诺（5-氨基-2,3-二氢-1,4酞嗓二酮），在
9、碱性溶液中激发形成的氨基肽酸盐产生能量，以可见光的形式迅速释放，借助光学仪器可以检测到发光强度，该强度与抗原标记的酶的多少有关，即与抗原-抗体结合水平有关。,随着现代分子免疫学技术的发展，1981年美国斯坦福大学的Stark G等在DNA杂交技术的基础上，发明了蛋白质印迹技术（Western blotting），该方法是利用聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨率与免疫反应高特异性于一体的蛋白质分析技术,1992年，日本学者Takeshi S借助分子生物学PCR技术，创建了免疫-PCR（Immuno-PCR），其原理是利用DNA标记检测抗体，通过PCR扩增目的DNA反映抗原-抗体结合的一种方法。免疫-PC
10、R同时具有抗原-抗体反应的特异性和PCR的高敏感性、适合于微量抗原的检测，并且可以直接检测细胞上抗原。但由于检测步骤过多，而且检测结果还需进行PCR产物定量，因此该方法已极少使用。,免疫PCR基本原理,1891年科赫（Koch）在发现结核杆菌后，曾利用结核杆菌给患者皮下接种以期达到免疫的目的，但却发现结核杆菌注射后可引起局部组织坏死，即科赫（Koch）现象。直到1942年，Landsteiner和Chase M等才发现结核杆菌免疫的豚鼠血清并不能通过被动免疫引起未致敏动物结核菌素反应，而用致敏细胞转移至未致敏动物则能引起结核菌素反应，该研究充分证明结核菌素反应不是抗体介导的，而是由致敏免疫细胞
11、引起的。,2、免疫细胞学技术,免疫细胞的研究，有赖于20世纪50年代细胞生物学分离、培养单细胞技术的发展，逐步形成了免疫细胞学的检测体系。1957年，Glick AD就发现鸡的腔上囊组织可以影响机体产生抗体，1961年Miller J进一步发现胸腺的中枢免疫作用。1964年Bain B创建了混合淋巴细胞培养技术，证实免疫细胞可以增殖，并具有生物学功能。1966年Bloom B、John D等发现淋巴细胞可以分泌蛋白质类活性物质，即淋巴因子，进而建立了细胞因子生物活性分析法。,1966年Claman和Triplett，1968年Mitchell和Miller，又分别证实了T细胞亚型的存在，其研究
12、方法也是检测活化免疫细胞的基础。20世纪70年代Coombs和Brain等建立了玫瑰花结试验，利用淋巴细胞表面抗原可与绵羊红细胞结合特性，用以检测T细胞数量。1975年，Milstein C和Khler G利用细胞融合技术，创建了由单一B细胞克隆产生抗体的方法，即单克隆抗体技术，二人也因此于1984年获得生理学医学诺贝奖。,流式细胞术20世纪70年代诞生了现代免疫细胞检测技术中最具代表性的流式细胞术，该技术是利用现代计算机技术、激光技术、流体力学、免疫荧光技术于一体的特殊仪器进行细胞特性分析和分选的技术。1973年BD公司与美国斯坦福大学合作，研制生产了第一台商用流式细胞仪FACS I，从此，
13、流式细胞术进入了一个飞速发展的时代。流式细胞仪已经成为细胞发育、分化、凋亡以及干细胞移植等研究的主要工具。,免疫学技术发展的现状,现代免疫学技术不仅仅应用于免疫学研究，已经广泛渗透到生命科学研究的每个领域。一、传统技术的再发展经典免疫学的检测敏感度较低，但也有其自身的优点，就是检测程序简便、快捷，便于临床诊断使用，速率散射比浊免疫测定法、免疫乳胶浊度测定法及速率抑制免疫比浊法等。这些方法非常适合临床大样本自动化分析，已广泛用于临床补体、免疫球蛋白、循环IC以及C反应蛋白等的定量检测。,二、高敏感性、高特异性免疫技术的开发,建立在单克隆抗体基础上的双位点ELISA,电化学发光免疫分析(ECL)电
14、化学发光为电促发光，可产生稳定、高效的连续发光，而且检测方法简便，由于电化学发光易于操作、特异性强、灵敏度高、检出快速而且重复性好等优点，易于大样本检测，因而在临床应用广泛，如肿瘤标志物、C肽、生长激素、催乳素、促黄体生成素及绒毛膜促性腺激素等检测，具有非常好的发展前景。,三、复杂与简化的并存,流式细胞术（flow cytometry，FCM）是一项最具代表性的、先进的免疫学检测技术，FCM综合了光学、电子学、流体力学、细胞化学、免疫学、激光和计算机等多门学科理论和技术，对液体流中的单个细胞或微粒进行多参数定性、定量分析以及分选。免疫磁珠分选（Magnetic cell sorting）细胞具
15、有高效、简便的特性，目前广泛应用于多种细胞，,流式细胞术检测巨噬细胞吞噬荧光微球结果,免疫学技术研发和应用的展望,一、单细胞免疫功能分析最经典的单一免疫细胞功能实验，首推1963年尼尔斯杰尼和阿尔伯特诺丁建立的检测B细胞产生抗体能力的B细胞溶血空斑试验。固相酶联免疫斑点技术（Enzyme-linked Immunospot Assay，ELISPOT）是从单细胞水平检测分泌抗体细胞(ASC)或分泌细胞因子(CK)细胞的一项细胞免疫学新技术。活细胞成像（live cell imaging）技术，活细胞成像技术主要是借助显微镜系统直接观察活细胞在体外及体内生理、病理状态下的行为，通过采集图像与视频
16、信号对各种细胞生理病理行为进行分析的方法。,ELISPOT检测结果,小鼠脑血管内的白细胞招募图像（A）腹腔注射脂多糖4h后，小鼠脑血管内壁出现大量粘附和滚动的白细胞。（B）腹腔注射生理盐水4h后，小鼠脑血管中几乎观察不到粘附和滚动的白细胞。,小鼠活体成像,二、快速、简便的免疫技术研发,免疫学技术与医学联系最为密切，随着现代科学仪器设备的发展以及标记技术的进步，更敏感、特异、快速的诊断方法也在不断涌现，如速率散射比浊免疫测定法、胶体金快速诊断试纸等，可在数分钟内显示临床样本测定结果。,三、免疫疾病模型,由于人类供者以及伦理学的限制，很难找到合适的疾病模型自愿者，因此，疾病模型主要依赖动物模型。自
17、身免疫性疾病通常是多因素疾病，因此，免疫性疾病模型，多以模拟疾病形成原因的方式建立动物模型，在机制研究方面也常常借助于现代模式生物的基因敲除、敲入以及转基因动物模型。,型超敏反应疾病模型型超敏反应（type hypersensitivity）又称速发型超敏反应（immediate hypersensitivity），过敏反应（anaphylaxis）。1921年Prausnitz将其好友Kustner对鱼过敏的血清注入自己前臂皮内，经过一段时间后再将鱼提取液注入同一部位，结果发现注射局部很快出现红晕和风团样反应，这就是著名的P-K试验，也是药物皮肤过敏试验的基础。1966年日本学者Ishiza
18、ka发现引起型超敏反应的主要抗体是血清中的IgE。研究显示实验动物用于致敏试验反应程度高低的顺序是：豚鼠家兔犬小鼠猫蛙，常用豚鼠过敏试验作为型超敏反应动物模型。,胶原诱导关节炎动物模型类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是典型的自身免疫性疾病。胶原诱导关节炎（collagen induced arthritis，CIA）模型作为研究RA的疾病模型，于1977年由Trentham DE等人首次建立，其原理是用型胶原作为抗原免疫大鼠，诱导大鼠产生实验性关节炎（CIA）。1980年Courtenay等又建立了小鼠CIA模型。,正常小鼠（左）与发病小鼠（右）关节局部X线摄影
19、,实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型多发性硬化（multiple sclerosis，MS）也是一种自身免疫性疾病，实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是研究MS的经典动物模型，其髓鞘损伤是由免疫细胞或抗体介导的针对髓鞘或少突胶质细胞表面抗原直接攻击所致，与MS的病理变化极其相似。制备EAE模型的免疫原主要有髓鞘碱性蛋白（MBP）、髓鞘蛋白脂质蛋白（PLP）、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）。,型糖尿病动物模型糖尿病是临床常见疾病，分为型和型，型属于自身免疫性疾病，非肥胖性糖尿病小鼠（NOD）是常用的型糖尿病动物模
20、型。NOD小鼠是由牧野等人在1980年从Jcl：ICR远交系小鼠中筛选白内障鼠时，无意间发现的一个自发糖尿病品系。NOD小鼠也存在性别差异，如雌性NOD小鼠自发糖尿病几率为60%80%，而雄性小鼠自发糖尿病几率仅为20%30%，,免疫学技术研发和应用研究的未来,1、大通量检测技术的发展：抗体（抗原）蛋白芯片技术以及ELISA-array，伴随相应检测仪器的简化，必将逐步取代现有的单一检测抗原（抗体）的ELISA等技术。2、人源化抗体库：可以直接制备人源化抗体。20世纪90年代开始尝试构建抗体库（antibody library），发展最成熟、应用最广泛的抗体库主要是噬菌体展示抗体库（phage
21、 display antibody library），其优点是表达的抗体分子位于噬菌体表面；基因文库筛选容量大，而且稳定；可以直接筛选到编码单克隆抗体的V区基因，便于基因工程技术改造抗体；能模拟天然抗体库。,3、新的免疫干预手段和疾病生物治疗1891年Behring又首次应用免疫动物抗血清成功治疗1例白喉患者，从而开创了免疫干预与疾病治疗研究新领域。抗体、细胞因子。利妥普单抗是针对B细胞表面标志CD20的特异性人鼠嵌合型单克隆抗体，与人B淋巴瘤细胞表面CD20结合后可以导致B淋巴瘤细胞增殖抑制。CIK治疗肿瘤。新的免疫干预研究更倾向于小分子免疫激动剂、拮抗剂以及新的免疫调节剂的研发。,吉林大学基础医学院Jilin UniversityCollege of Basic Medical Sciences,谢谢,
