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1、细菌内毒素检查法（凝胶法）,苏州大学 卫生与环境技术研究所,细菌内毒素,细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的产物,它主要化学成分是脂多糖。细菌在生活状态下不会释放出来，只有当细菌死亡后才会表现出毒性。内毒素为外源性热原物质，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。,细菌内毒素的单位,EU称为“内毒素单位”,是专指内毒素的活性单位。IU 称为”国际单位”是经由国际协商规定出的标准单位。,细菌内毒素的生物活性,1、致热性。2、致死性毒性。3、白细胞减少。4、激活凝血系统。5、降低血压，休克。6、Shwartzman反应。7、刺激淋巴细胞有丝分裂，等等。,细菌内毒素
2、的耐热性,细菌内毒素具很强的耐热性，一般的高压灭菌不能去除细菌内毒素，需250至少30分钟以上的干热灭菌才能使其灭活。,实验用器具的处理,内毒素试验中使用的器皿都要经过处理去除可能存在的外源性内毒素。耐高温的玻璃器皿等置于电热干烤箱内180干烤至少2h或者250干烤至少30分钟；塑料器皿置于30双氧水中浸泡4h，再用细菌内毒素检查用水充分冲洗，60烘干备用。,细菌内毒素与热原的区别与联系,热原包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。一般来说内毒素是热原,但热原不全是内毒素。在药品生产质量管理规范（GMP）条件下，药品生产的质量控制一般可以接受的观点是：不存在细菌内毒素意
3、味着不存在热原。,细菌内毒素检查法概念,本方法是利用鲎试剂检测由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度测定法，由于凝胶法操作简单快捷、灵敏度高，并且药典规定当不同试验方法的结果存在争议时，除另有规定外，以凝胶法为准，所以凝胶法被广泛应用。,凝胶法概念,凝胶法是通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内毒素的方法。,凝胶法中用到的仪器和器皿,1.超净工作台,凝胶法中用到的仪器和器皿,2.恒温培养箱 孵育样品浸提液以及培养试验结果。,凝胶法中用到的仪器和器皿,3.干烤箱 用于实验用耐高温器皿的去热源，温度范围要
4、求至少300,凝胶法中用到的仪器和器皿,4.移液器和无热源的移液尖（或者去热源的刻度吸管）5.试管,凝胶法中用到的试剂,1）鲎试剂（由海洋生物鲎的血液提取制成的冻干粉末）2）细菌内毒素工作品 3）细菌内毒素检查用水（内毒素含量小于0.015EU/ml的无菌水）,鲎试剂灵敏度复核试验,当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。,鲎试剂灵敏度复核试验,根据鲎试剂灵敏度的标示值（）,将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混匀15分钟,然后制成2、1、0.5和0.25四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀3
5、0秒钟。,鲎试剂灵敏度复核试验,取复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管各加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入371的适宜恒温器中，保温60分钟2分钟。,鲎试剂灵敏度复核试验,结果观察 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180时，若管内形成凝胶，且不从管壁滑脱者为阳性；若不形成凝胶，或形成凝胶但倒转180后从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阴性结果。,鲎试剂灵敏度复核试验,若最大浓度2.0管均为阳性，最低浓度0.25管均
6、为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（c），计算方法见中国药典。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。当c在0.52.0（包括0.5和2.0）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。,凝胶法的试验步骤,下面我们结合中国药典2010、GB 14233.2医用输液、输血、注射器具检验方法 以及GB 15810一次性无菌注射器 来学习具体试验方法。,实验步骤,样品处理方法：a）管类和容器类器具用细菌内毒素检查用水浸泡器具内腔，在（371）恒温箱中孵育不少于1h，取浸提液进行试验；b）小型配件或
7、实体类样品置无热源玻璃器皿内，加入细菌内毒素检查用水振荡数次，在（371）恒温箱中孵育不少于1h，取浸提液进行试验。制备的供试液储存不应该超过2h。一般要求供试液的PH值在6.08.0之间，如不在该范围内，可用鲎试剂厂家提供的PH缓冲液调节浸提液的PH值。,实验步骤,浸提介质（细菌内毒素检查用水）体积计算公示：V浸提介质体积，单位为（ml）；L产品细菌内毒素限值（该产品允许含有的细菌内毒素的量），单位为EU/件；鲎试剂灵敏度的标示值，单位为EU/ml。,实验步骤,实验步骤,检测方法:1、A溶液：在注射器中抽取细菌内毒素检查用水至总刻度容量,放置37保温不少于1小时。2、复溶细菌内毒素工作品，得
8、到浓度为10EU/ml的工作品溶液。3、B溶液：用样品浸提液制备1EU/ml浓度的样品阳性对照液。4、C溶液：用检查用水制备1EU/ml浓度的内毒素溶液，作为阳性对照。5、加样反应，取 8 支0.5EU/ml的鲎试剂，各加0.1ml的细菌内毒素检查用水复溶。然后分别加A、B、C、D溶液0.1ml，四种溶液各做两个平行管。6、放到37度水浴或恒温培养箱中反应60分钟，观察结果。,结果观察,B、C溶液的反应管必须要阳性，就是轻轻倒转180度过来，鲎试剂安瓿里的反应溶液形成了凝胶体，不滑落。而D溶液，就是细菌内毒素检查用水那2管，必须要阴性，3个条件都满足，就说明试验结果是可信的。最后看A溶液的反应
9、情况：阳性就说明原套器具每件大于20EU，判定为不合格；阴性就说明小于20EU,结果是合格的；1管阳性、1管阴性则要重新复查，复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性则判断合格；否则判断为不合格。,注意事项,1.每批鲎试剂在用于试验前首先要进行灵敏度的复核试验；2.安瓿开启前应先用砂石划痕(不管是色点或包环易折安瓿)，用手半拉半掰将颈部折断，千万不能用镊子敲击，防止碎玻屑掉入安瓿。3.在鲎试剂的溶解、样品的稀释及加入时，取样均应准确，缓缓加入避免气泡。4.保温过程中不可随时取出观察，防止形成的凝胶受到振动后变形而误判为阴性。,注意事项,5.冻干的鲎试剂应存放在2-8下；避免长时间放置在高于25的温度条件下。已复溶的鲎试剂在间歇使用过程中最好放在2-8的冰箱里，可存放24小时，在-20以下，可存放四个星期，鲎试剂只能冻融一次。,谢 谢,鲎,返回,
