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1、净水除磷小组2011年度总结报告,城市景观水体作为城市生态系统的重要组成部分在城市生态化建设中日益显示出其不可替代的功能和意义。但一般自净能力弱，容易成为居民生活污水雨水和垃圾的接纳体，导致不同程度的污染，乃至富营养化。大量的研究表明,磷是湖泊富营养化的主要限制因子。水体中有机磷的污染主要来自农药、生物代谢的植磷酸和生物体腐烂的有机质等,由于污水除磷体系主要通过除磷微生物利用水中可溶性磷酸盐来降低水中的磷含量,因此筛选高效的磷降解菌可以降解水体中的磷,使水体中的磷在有氧阶段被微生物本身代谢,进而改善水体环境,同时也能够提高污水除磷体系中的生物除磷效率。又由于水体中的有机磷酸盐不能被微生物所利用
2、,会引起水体发臭。进而加剧水体环境恶化，因此降解水体中的有机磷酸盐是治理水体污染必要的步骤。有机磷解磷菌能够把有机磷酸盐降解成可溶性磷酸盐,从而减少水体中有机磷酸盐的含量。,聚磷菌：也叫做摄磷菌，是传统活性污泥工艺中一类特殊的兼性细菌，在好氧或缺氧状态下能超量地将污水中的磷吸人体内，使体内的含磷量超过一般细菌体内的含磷量的数倍，这类细菌被广泛地用于生物除磷。解磷菌：能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态，具有这种能力的微生物叫做解磷菌或溶磷菌（phosphate-solubilizing microorganisms）。,一方面，本研究分别从河南城建学院月牙湖污水中和平顶山污水处理场
3、活性污泥中两处分别富集和分离菌株。其中河南城建学院污水中分离出11株菌，只有 5 株解磷效果比较好。在平顶山污水处理厂活性污泥中暂时筛选出5株有除无机磷功能的菌株，11株除有机磷菌株，它们的除磷功能待定。另一方面，经一年的探究工作，本小组又对08年筛出的P13和P24菌株进行了功能测试和紫外诱变育种，其中P13除磷率为83%，最佳诱变时间为15s；P24除磷率为34%，最佳诱变时间为20s。本实验将在筛选新菌株的同时，继续探究这两株菌的生理生化特性及合适的诱变育种方式。,利用富集培养的方式，对自然界的样品进行处级筛选，初步挑出有聚磷效果的聚磷菌。钼锑抗法测试菌株除磷效率，挑选出除磷效率高的菌株
4、。对挑出的菌株人工诱变育种，培育新的高产菌株，使其除磷率高于90%。在除磷效果比较理想的基础上培养基优化，优化菌株的生长环境，以便生产应用。,1、样品采集2、样品预处理3、富集筛选4、稀释涂布平板法初筛5、平板划线分离纯化7、钼锑抗法测除磷率8、紫外诱变9、高效菌株培养基优化培养 10、扩大培养，应用生产实际,采集地点：河南城建学院月牙湖和平顶山市污水处理厂取样方式：用塑料瓶从藻类生长旺盛或污染严重的水域取样，但是在污水处理厂取活性污泥即可（此样品无需预处理）。样品预处理：用漏斗和滤纸将样品过滤除去样品中的沙石和漂浮的细小垃圾，将过滤后的样品分装于250ml锥形瓶中，每瓶100ml。样品采集后
5、应该立即进行处理，防止由于放置时间防止过长导致微生物代谢凋亡，影响实验。,第一次驯化：样品：培养基=1:2混匀（接种量大是为了富集出数量多质量好的菌株），分装3瓶各100ml于三角瓶中，30150r/min摇床培养24h。第二次驯化：将上述菌液以10%接种量加入第二次富集驯化培养基中。培养条件及时间不变第三次驯化：操作同第二次，但培养基变成第三次驯化所用量,除无机磷方向：以磷酸三钙为富集因子，三次富集时，磷酸三钙的量逐次递增，三次富集量分别为第一次1%、第二次1.5%、第三次2%除有机磷方向：卵磷脂为富集因子，三次富集时，卵磷脂的量逐次递增，分别为第一次0.02%、第二次0.03%、第三次0.
6、04%,将富集后的菌液稀释涂布平板，稀释梯度为10-5,10-6,10-7，每个梯度三个平行涂平皿。将培养基放入培养箱中30培养48h，期间每隔一段时间观察并记录菌株生长状况。挑选形态不同的单菌落进行平板划线，观察菌株有无分离。如果分离，则需挑分离后的菌落再次平板划线纯化。如果没有分离现象，则需再次划平皿进行平板保藏。对每个平皿均进行以上处理和重复分离纯化，直至菌种没有分离现象。最后对平皿上的纯种聚磷菌先进行试管斜面保藏。,首先给挑选出的单菌落命名每种菌株5支斜面保藏，备用。注意：本实验的目的是找出除有机磷和 除无机磷的菌株，以上操作只针对其 中一种的菌株来说。所以实际操作时 所用试剂、仪器和
7、器材都是加倍的。,原理：水中总磷的测定可以根据水质分析规定方法进行。水中的含磷化合物,在过硫酸钾的作用下,转变为正磷酸盐。正磷酸盐在酸性介质中可同钼酸铵和酒石酸氧锑钾反应,生成磷钼杂多酸。磷钼酸能被抗坏血酸还原,生成深蓝色的磷钼蓝。在700nm波长测定样品的吸光度。从用同样方法处理的校准曲线上,查出水样含磷量,计算总磷浓度,用P,mg/L表示。,方法与步骤：分别取0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、36h、48h、72h样 品离心取上清5ml，加过硫酸钾0.8ml，121消解30min，冷却后先加入钼酸盐，30s后再加入抗坏血酸，静置15分钟，测 OD值。根据磷标准曲线找出OD值
8、对应的 磷含量，计算结果。除磷率=(初始磷浓度 最低磷浓度)/初始磷浓度,诱变育种（mutation breeding）：指用物理、化学因素诱导动植物的遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求的单株/个体，进而培育成新的品种或种质的育种方法。它是继选择育种和杂交育种之后发展起来的一项现代育种技术。实验室中常采用物理诱变和化学诱变的方法育种，其中物理诱变中紫外线诱变最为常见。紫外线诱变机理：紫外线诱变处理的有效波长20030010nm，最适为254nm(此为核酸的吸收高峰)。dna和rna的嘌呤和嘧啶吸收紫外光后，dna分子形成嘧啶二聚体，二聚体出现会减弱双键间氢键的作用，引起双链结
9、构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，还会妨碍双链的解开，影响dna的复制和转录.总之紫外辐射可以引起碱基转换、颠换、移码突变或缺失，即所谓的诱变。,诱变方法：诱变在暗箱中进行。先将一 定数量的种子用紫外线照射一段时间，然后再将种子培育出来，观察种子生长 状况，发现产生了需要的性状后将该菌 株保留。注意：前期进行诱变的种子数 量一定要多，因为种子发生突变的概率 很小。,培养基优化：培养基优化，是指面对特定的微生物，通过实验手段配比和筛选找到一种最适合其生长及发酵的培养基，在原来的基础上提高发酵产物的产量，以期达到生产最大发酵产物的目的。对于本科研筛选出的菌株采用正交试验的方法优化培养基。,1、从本
10、校湖水中共筛选出11株菌，5株除无机磷菌，6株除有机磷菌。钼锑抗法测功能之后发现，5株除无机磷菌为解磷菌（能够将植物难以吸收利用的磷转化为可吸收利用的形态），6株除有机磷菌几乎没有除磷功能（水中总磷在加入菌液前后几乎没有变化）。将5株除无机磷菌暂时斜面保藏和甘油保藏。2、从平顶山污水处理厂筛选出5株除无机磷菌，11株除有机磷菌株，试管斜面保藏备用,筛选菌株时应尽量加大关键因子的量，这样才可能筛出目的菌较好的菌株。平板划线纯化菌株时，一般至少经过三次纯化才可能获得纯种的目的菌，又由于很多菌株菌落形态在初始培养时相同，往往需培养三天以上才能有明显的变化，而菌株在30培养两天就已基本停止生长，所以在
11、分离时需要耐心等待，不能过早下结论。有些菌株在生长前期、中期及后期菌落形态稍有变化，这需要经过多次重复平板培养才能鉴定。,菌株筛选出后要尽快测功能，防止由于传代次数过多导致菌株性能衰退。如若时间来不及，则必须进行试管斜面短期保藏，不能在室温下放置时间过长。再次拿出来使用菌株时，必须先进行平板复壮，以恢复菌株活力。,理论上认为，不能用同一因子长时间对同一种子进行诱变，这样会减低诱变效率，增强负突变发生，减少正突变，建议实验室诱变育种采用物理突变和化学突变相结合。实验室诱变用的紫外灯功率为15w，照射距离30cm，种子液密度数量级应达到108。因为DNA光修复的存在，所以诱变后的种子不能见光，实验
12、操作需要在红外线下进行。（可以紫外线照射与见光相互交替，增大突变率。突变率一般以75%80%为宜，高于这个数值活菌太少，低于这个数值突变率较低，都不利于种子筛选。,目前，测水中总磷有很多方法，钼锑抗法是最为精准的和简便的，本标准适用于地面水、污水和工业废水。取25mL试料，本标准的最低检出浓度为0.01mg/L，测定上限为0.6mg/L。在酸性条件下，砷、铬、硫干扰测定。实验时，注意不要超过检出限，如若水中磷含量较高，则应先稀释再加试剂。聚磷菌的功能曲线为倒“U”，这是因为菌株在生长高峰期利用磷用于自身代谢，使数据下降，在其衰亡后，微生物有机体裂解，释放磷，又使水中总磷升高。由于菌株分为除有机
13、磷和除无机磷两种，所以测水中磷含量变化时也分无机磷和有机磷。实验时注意区别。,有机磷培养基以卵磷脂为变量，卵磷脂时脂 溶性物质，80变性，不溶于水，常温下，将卵磷脂加入水中后，半个小时后就可以乳 化于水。磷酸三钙是不溶于水的无机物，化学性质稳定，长时间浸泡水中仍不分解，但是聚磷菌可以将 固体的磷酸三钙分解为可溶于水的磷酸盐，供 自己或者水中其他微生物植物利用。,未来展望,有氧反硝化细菌、自养反硝化细菌和脱氮 除磷细菌的发现丰富了反硝化细菌的研究 内容,也增加了对反硝化过程新的认识,同 时也为有效控制反硝化活性及污水脱氮开 拓了新的途径。通过研究反硝化细菌的生 态及生物学特性,改变环境条件,使反硝化 细菌充分发挥作用,将对于提高污水脱氮 水平发挥重要作用。,目前国内污水处理厂的污泥大都没有得到充分利用,因此从污泥中筛选出具有较强聚磷能力的聚磷菌具有一定的实践意义。近年来,虽然发现了不同类型的聚磷菌,但这些聚磷细菌如何成为反应体系中的优势种群而发挥作聚磷用以及如何根据这些新的聚磷细菌的生物学和生态学特性建立新的工艺是问题的关键所在。因此,开展聚磷细菌进行聚磷作用的分子机理、生物学特性和生态学研究,可为使其成为污水处理系统中的优势种群而奠定理论基础。,未来展望,
