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1、单克隆抗体制备过程,临床兽医系:吴黎明学号：,单抗技术的基本原理 小鼠骨髓瘤细胞能在动物体外无限繁殖和分泌无抗体活性的免疫球蛋白，而免疫小鼠脾细胞具有产生抗体的能力，但不能无限增殖，又能产生特异性抗体，可通过有限稀释法经筛选培育成由单个细胞增殖而成的克隆株。该克隆株如不发生变异，就可大批量的生产高特异性和高纯度的单抗。,单克隆抗体的优越性1.目的性明确 人们可以在动物体内或体外按自己的需要生产不同类型的单抗。任何抗原、半抗原，包括各种细菌、病毒、激素、酶类、氨基酸序列、核酸，还有其它异体蛋白或糖蛋白等均可以用来免疫动物，利用杂交瘤技术获得相应的单抗。,2.特异性高单抗是针对某一种特定抗原或抗原
2、上特定决定簇制备的，与其它抗原无交叉反应性。与其它常规免疫血清相比，单抗的特异性高、效价高、质地均一，便于精制浓缩，应用单抗可以提高检测方法的敏感性和特异性。同时，他又可作为提纯抗原、制备疫苗、生产生物制剂和用于基础研究的重要手段。3.生产简单，易于标准化 一旦选育成功一株高效价的杂交瘤细胞株，经鉴定合格后可置液氮中长期保存。如不发生变异，染色体不丢失，就可长久源源不断的大批生产高特异性和高纯度的单抗,单克隆抗体制备示意图,一、细胞融合前准备,(一)免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗
3、原的特性不同而定。可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。,初次免疫 Ag150g加福氏完全佐剂皮下多点注射(一般0.81ml0.2ml点)3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip)(ip剂量不宜超过0.5ml)3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip(57天后采血测其效价，检测免疫效果)23周后加强免疫，剂量50500g为宜，ip或iv(静脉内注射)3天后取脾融合,(二)饲养细胞在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂
4、交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。,小鼠腹腔巨噬细胞的制备小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLbc小鼠610周龄拉颈处死浸泡于75酒精，消毒35分钟用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜用无菌注射器注入68ml培养液反复冲洗，吸出冲洗液放入10ml离心管，1200转分离心56分钟用20小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数110ml加入96孔板，100l孔放入37CO2孵箱培养,一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得58106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5106ml，小鼠脾细胞为1106ml，小鼠的成纤维细胞(3
5、T3)1105ml，均为100l孔。,(三)骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP20、X63 Ag8.653等。,骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在1020，细胞的最大密度不得超10ml，一般扩大培养以110稀释传代，每35天传代一次。细胞的倍增时间为1620小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。,一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，
6、每36月应用8AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变。保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95，也是决定细胞融合的关键。在细胞融合的前一天用新鲜培养基调细胞浓度为2105/ml，次日一般即为对数生长期细胞。,(四)免疫脾细胞免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的倍，细胞数为10左右。,二、细
7、胞融合，选择杂交瘤,(一)细胞融合流程(1)取对数生长的骨髓瘤细胞SP20，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。(2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。(3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按110或15的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。(4)弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。(5)轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。(6)在室温下融合可先以预热40:30秒内加入预热的1ml45PEG(Merek,分子量4000)含5DMSO，边加边搅拌。作用90秒钟，若
8、冬天室温较低时可延长至120秒钟。加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。,(7)离心，800rpm，6分钟。(8)弃上清，先用6ml左右20小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。(9)根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。(10)将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100l孔，37、5CO2孵箱培养(一般一块96孔板含有1107脾细胞)。（11）第3、6、9、10日换入含HAT的完全1640培养液。注意轻轻吸取上清液，勿将固定于孔底的细胞吸出，根据需要
9、加入适量的饲养细胞。（12）于第12、15日加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前用倒置显微镜观察，大约在10天左右就可观察到杂交瘤细胞生长出来。大多数杂交瘤细胞在1020天内出现，但也有在1个月左右才能出现的。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液，检查抗体。（13）对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，依情况取消HAT液和完全1640液而代之以10%FCS1640液。同时保存于液氮和进行克隆化，在这期间每代都要检查抗体，以防止产生抗体细胞的变异和丢失。,(二)HAT选择杂交瘤一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50贮存，用时1ml加入50ml20
10、小牛血清完全培养液中。因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200l孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为，融合后最初补加的量可用全量的23进行选择，可得到满意的筛选结果。50HATH:510-3MA:210-5MT:810-4M一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。,三、抗体的检测,筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底110面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。,四、杂交瘤的克隆化和冻存,克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。经过
11、HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。,1.有限稀释法的程序制备饲养细胞悬液(同融合前准备)阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1510ml取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞ml，100l孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完
12、全培养液,细胞数为10个ml，100l孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个ml，100l孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。培养45天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200l孔。第89天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。,2.软琼脂法软琼脂的配制含20FCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI16401琼脂水溶液：高压灭菌，42预热。0.5琼脂：由1份1琼脂加1份含20小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42保温。用上述0.5琼脂液(含有
13、饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。按100ml，500ml或5000ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。1ml 0.5琼脂液(42预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固，孵育于37，5CO2孵箱中。45天后即可见针尖大小白色克隆，710天后，直接移种至含饲养细胞的24孔板中进行培养。检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。,(二)杂交瘤细胞的冻存及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞
14、的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而全功尽弃。杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿。细胞冻存液:50小牛血清40不完全培养液10DMSO(二甲亚砜),五、单克隆抗体的大量生产,大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：1.体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为1060gml，如果大量生产，费用较高。2.体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。实体瘤法对数生长期
15、的杂交瘤细胞按13107ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2 ml,共24点。待肿瘤达到一定大小后(一般1020天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mgml。但采血量有限。腹水的制备常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石腊于BaLbc鼠，12周后腹腔注射1106个杂交瘤细胞，接种细胞710天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获110ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml，这是目前最常用的方法，还可将腹水中
16、细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。,六、单克隆抗体的鉴定,对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定:1.抗体特异性的鉴定：除用免疫原(抗原)进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。,2.McAb的Ig类与亚类的鉴定：一般在用酶标或荧光素标记的
17、第二抗体进行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验时，如加入适量的PEG(3)，将有利于沉淀线的形成。,3.McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。4.McAb识别抗原表位的鉴定：用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。5.McAb亲和力的鉴定：用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。,
