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1、1,药物发现技术Techniques applied in the drug discovery,杜冠华药物筛选中心,2,药物发现的技术概况,起源：人类主动寻找药物是创造和应用药物发现技术的开始发展：药物发现技术随科学技术的进步而发展特点：创造性的应用各学科的知识、技术是药物发现的基本特征内容：药物筛选技术是药物发现技术主要组成部分,3,药物发现技术主要类型,4,高通量药物筛选主要研究内容,药物靶点（Drug targets）基因组学，蛋白质组学，细胞组学提供了条件筛选技术(techniques)方法创新，技术整合，条件优化先导评价(Evaluation of lead compounds)活
2、性评价，ADME/T评价，释药系统评价筛选策略(Strategy for drug discovery)新学科的交叉，多学科的结合，生（药）物信息学,5,1、药物靶点（Drug targets）研究,基因组学（genomic）功能基因筛选技术，RNAi技术，transgenic techniques蛋白质组学(protenomic)2D电泳技术，疾病相关蛋白，药物差异蛋白，细胞组学(cytanomic)细胞功能信号传导系统研究技术药物靶点研究成为生物、医学、药学研究的热点,6,基因功能筛选程序,基因质粒 细胞 克隆筛选（时程变化）,功能检测 表达产物,蛋白功能筛选,基因蛋白功能,7,药物靶点（
3、Drug targets）研究,药物靶点研究存在的问题 功能基因是否可以成为药物靶点？功能蛋白是否为就是药物靶点？如何判定药物靶点？认识药物靶点是研究药物靶点的关键 已知靶点分析,8,Figure 3.Molecular targets of drug therapy.Classification according to biochemical criteria.Based on a modern standard work of pharmacology,the molecular targets of all known drugs that have been characterize
4、d as safe and effective have been collected and listed according to their biochemical nature(62).Jrgen Drews.Drug Discovery:A Historical Perspective.Science 2000;287(5640):1960-1964,已知药物靶点生物学分类,9,已知药物靶点基本特点,10,药物靶点的基本特点,药物靶点根据目前已经认识的约500种药物靶点进行分析，药物靶点必须具备的生物学特征主要表现在以下方面：1、属于生物学大分子（通常为蛋白质），可以单独存在或形成聚
5、合体存在；2、具有可以与其他特定结构的物质（外源性或内源性物质，主要为小分子）相结合的部位或位点；3、该物质的结构可以发生变化，而且是在与具有特异性结构的物质结合后发生变化，正常情况下，这种变化通常是可逆的；,11,药物靶点的基本特点,药物靶点4、该大分子可以通过结构的变化，在生理条件下发挥生理调节功能，引起机体某些功能或表现的变化；5、该物质结构状态变化产生的生理效应在复杂调节过程或作用通路中具有主导作用；6、病理条件下该物质的表达量、活性、结构或特性可以发生变化，这种变化可以是原发性的量变，也可以是继发性的。7、在体内可能存在内源性与之结合的小分子（内源性配基）或外源性配基，其配基具有药理
6、作用且已经被认识。,12,药物靶点研究的基本过程,研究结论：药物靶点（drug targets）符合全部上述条件候选药物靶点（candidate of drug targets）符合除第7条以外的全部条件潜在药物靶点（potential drug targets）符合部分3条以上上述条件功能蛋白（functional peotein）符合3条以下上述条件,13,药物靶点研究的基本过程,药物靶点的发现和确证（identification and validation）转基因技术的应用RNA干扰技术的应用配基研究及配基功能研究其他综合技术（靶点确证已成为生物科学研究重点）,14,2、HTS筛选技术
7、,HTS 设备的更新(操作系统)样品处理，筛选操作；大规模微量系统,15,2、HTS筛选技术,HTS 设备的更新(检测系统)成象检测，数字检测，多层次检测,动态检测（分子、细胞、组织、整体）,16,HTS筛选技术,均相检测体系成为发展趋势SPA技术的应用荧光技术的应用 FP技术 时间分辨荧光 能量转移荧光生物芯片技术逐渐成熟高内涵筛选开始应用,17,Ideal,Assay theoryCompetitive displacement FP assay,18,Detecting parameters,Low Polarization,High Polarization,Low Polarizat
8、ion,19,To determine the concentration of FITC-SR-1,20,To determine the time of incubation and stability of the signal,21,Displacement assay,22,Evaluating the FP-based HTS:Z value:0.75,Maximally bound,Fully displaced,23,Screening results,24,3、生物芯片技术,生物芯片技术 受体蛋白芯片 反向蛋白质配基筛选芯片 酶活性化合物阵列芯片,25,Surfaces mo
9、dified with polysaccharide film,Reaction of modification,The desired combination of properties of the multiplex receptors,26,Figure 1.Fluorescence images of opioid R-(A)and androgen R-LBD(B)microspots after incubation with solutions containing naloxone-FITC and FluormoneTM AL Green respectively at t
10、he concentration of 1 nM in the absence(i)and presence(ii)of 3%BSA for blocking nonspecific absorption.,(A)(i)(ii)(B)(i)(ii),Smoothing disadvantage of 3D matrix,27,Figure 3.Lox-1 receptor functional protein microarrays and the Signal density dependence of concentration.The Signal density of Dil-LDL(
11、fixed concentration is 0.04mg/ml)in microspots are shown for different concentrations of Lox-1 receptor(2,1,0.5,0.25,0.125 mg/ml from left to right).,Concentration dependence assay,28,Figure 4.Saturation profiles of adrenergic R-2 with TMR-CGP12177.Rainbow colors(blue red)symbol RFU.(i)RFU of total
12、and nonspecific blocks incubation with TMR-CGP in concentrations(50.02 nM)in the absence and presence of unlabeled propranolol(1M).(ii)Dose-dependence curve iii)Scatchard analysis for estimation of the dissociation constant for CGP.,(i)total nonspecific,29,Figure 5.Saturation experiment demonstrated
13、 by membrane receptor,opioid receptor-.(i)Fluorescence images after incubation with naloxone-FITC at different concentrations(0.2048 20 nM)in the absence and presence of unlabeled naloxon(1M).(ii)Dose-dependence curve.iii)Scatchard plot.,(i)total nonspecific,30,Figure 6.Nuclear receptor estrogen rec
14、eptor-.(i)Fluorescence images after incubation with solutions containing estradiol-BSA-FITC at different concentrations(0.2048 20 nM)in the absence and presence of unlabeled diethylstilbestrol(1M).(ii)Plot of the fluorescence intensity.iii)Scatchard plot for estradiol-BSA-FITC.,(i)total nonspecific,
15、31,Figure 7.Androgen receptor LBD and Kd value.(i)Fluorescence images after incubation with solutions containing Fluromone at different concentrations(0.2048 20 nM)in the absence and presence of unlabeled diethylstilbestrol(1M).(ii)Plot of the fluorescence intensity.(iii)Scatchard analysis for Kd.,(
16、i)total nonspecific,32,4、HCS筛选技术,高内涵（HCS）筛选开始应用,33,HTS筛选技术,高内涵筛选,34,HCS筛选技术,高内涵筛选,First“modern”high content static cell analysis systemVery high content Moderate speedVery high data storage requiredData-base friendly,35,5.模型评价,信本比：S/B信号窗：SW信噪比：S/N信号本地变异系数：CVZ因子：,36,Evaluation parameter,Z=1-,3*(free+
17、bound),mPbound-mPfree,free:SD of MP under fully free;bound:SD of MP under maximally bindingmPbound:MP under maximally bindingmPfree:MP value under fully free,37,6.先导化合物评价(Evaluation of lead compounds),先导化合物评价关键问题：什么是先导化合物？Penicillin,Cortin,Propranolol,Salicylic acid,38,先导化合物评价(Evaluation of lead com
18、pounds),先导化合物的基本条件：肯定的药理作用特性的明显不足或更高期望结构的可改造类型?,39,先导化合物评价(Evaluation of lead compounds),活性评价：分子细胞功能评价 生理作用评价 药理学作用评价 病理条件下评价,40,先导化合物评价(Evaluation of lead compounds),ADME/T评价 活性化合物的ADME/T优势,41,先导化合物评价(Evaluation of lead compounds),ADME/T评价,42,先导化合物评价(Evaluation of lead compounds),释药系统评价适合于筛选过程的释药系统
19、,43,先导化合物评价(Evaluation of lead compounds),系统评价：靶点作用强度靶点选择性相应作用表现ADME/T品质已知同类研究地位整体动物实验观察,44,7.筛选策略研究(Strategy for drug discovery),1.随机筛选策略：具体评价，积累资料，形成资源，谋取长期发展积累HTS的早期研究策略，希望通过但一靶点的筛选获得药物或先导事实证明，这种方法成功率并不高，但筛选的资料和后期结果具有非常重要的意义。数据库的建立已经开始表现出发展的优势。,45,筛选策略研究(Strategy for drug discovery),2.集中目标化合物筛选策略
20、 主要集中目标化合物，提高成功率，技术和方法:通过计算机辅助筛选，排除法优于挑选法。,46,筛选策略研究(Strategy for drug discovery),集中目标化合物筛选策略,47,筛选策略研究(Strategy for drug discovery),3.集中目标疾病的治疗药物策略：针对疾病进行多方面和多靶点的筛选，通过综合评价的方法获得理想的筛选结果。该策略一般以具体的疾病或某一方面的症状为主要目标，筛选相应的化合物。,48,筛选策略研究(Strategy for drug discovery),4.活性提示天然产物研究策略：快速分离、HTS活性评价、提供可能信息、获得明确的活
21、性成分。该策略从1999年开始策划，2000年开始准备和尝试；大规模进行小量连续分离和HTS活性筛选，积累了大量资料；根据活性研究活性化合物，经3-5个循环，已经获得活性化合物。已经被国际社会接受并应用。,49,筛选策略研究(Strategy for drug discovery),50,筛选策略研究(Strategy for drug discovery),51,筛选策略研究(Strategy for drug discovery),5.特定目标策略：如增效减毒药物筛选，有效剂量下浓度与待筛选药物联合作用，观察药物作用效果获得能够增加疗效或作用，能够降低毒性或不良反应的药物,52,筛选策略研
22、究(Strategy for drug discovery),6.生物信息学策略：数据的挖掘和利用全面制订符合信息学要求的药物发现参数，用于挖掘的结果。,53,筛选策略研究(Strategy for drug discovery),7.从基因到药物研究策略：基因转染功能变化药物干预发现活性药物相互作用发现靶点和药物,54,基因功能筛选、功能研究与药物发现 from Gene to Drug,基因 细胞 转染细胞(功能变化指标)药物筛选 功能基因研究 活性化合物 功能基因(蛋白)药物/靶点/功能蛋白综合分析,55,筛选策略研究(Strategy for drug discovery),8.系统生物学与药物发现系统功能药物发现组织功能药物发现基于靶点药物发现多靶点药物发现系统生物学与药物发现,56,谢谢,思考题：高通量药物筛选常用技术及其特点？如何评价药物筛选模型？药物发现策略的意义是什么？,
