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1、疯牛病与朊病毒,遗传学车建花,谈牛色变,1986年，英国疯牛病,1996,朊病毒（Prion）的发现朊病毒的分子结构及生物学和致病性特性朊病毒的致病机理朊病毒的来源朊病毒的检测方法疯牛病的防控措施,朊病毒的发现,1732年，英国牧羊人发现一种可致绵羊死亡的羊瘙痒病，亦称羊痒病。19201921年，德国两位神经病理学家 Creutzfeldt 和Jacob首先系统描述并报道了 1名22岁妇女和 6例中年人发生早老痴呆的中枢神经系统变性病，死者脑组织呈弥漫性神经元变性，后命名为克雅氏病（CJD）。1939年，英国Cuille与Chelle医生研究患羊痒病的脑组织证实传染因子存在于脑组织液中，具“类
2、病毒”的特征。,1957年，发现在新几内亚高地有食尸习俗的土著部族中流行一种震颤病，亦称库鲁病，死者脑组织呈海绵状变性。之后，分别将kuru病和 CJD死者的脑组织滤液接种于猩猩及猴均获得成功，动物染病且病原传代，从而证实羊痒病、kuru病、CJD可能为同一病原。1980年，美国神经学教授Prusine从患羊痒病的羊脑中提纯使接种小鼠全部发病的传染因子，并确定该因子是不含核酸却能不停复制而具传染性的奇特蛋白质粒子，他将该致病因子命名为prion，称此蛋白为“Prion Protain”，简称PrP)。他因此获1997年诺贝尔医学生理学奖。,到目前为止，由朊病毒引发的相关疾病主要有：,由上表可知
3、，由朊病毒引发的疾病具有一些相似的临床症状：共济失调、进行性痴呆等。此外，大部分患者脑部还具有相似的病理变化：中枢神经系统中组织淀粉样斑块变性、海绵状变性、星形细胞神经胶质增生。,神经纤维网海绵状变性,星形细胞胶质增生,左图：过碘酸希夫法染色的额皮层切片，显示海绵样变性环绕的斑聚集区(93)。右图：多斑和无定形沉积物呈现PrP免疫阳性(460)。,朊病毒的来源,朊病毒根据其感染途径分为散发性、传染性和遗传性三种。散发性：PrPc自发性转变为PrPsc，不需外源PrPsc，属偶然事件。遗传性：PrP基因病理性突变遗传，如遗传性GSS、家族性CJD。传染性：医源性传染；血液传播 摄食患病的动物制品
4、（BSE的出现及新型CJD的发现）,上图：散发性、传染性阮病毒病；下图：遗传性阮病毒病,朊病毒的结构,研究证明，“PrP”实际上有良性、恶性之分。Prusiner发现的可传染致病的PrP称PrPsc(sc取自“scrapie”的前2个字母)；另一类是在人体内神经元等细胞膜表面也存在着的一种生理性PrP，其原始一级结构、相对分子质量均与PrPsc完全相同，为示区别，特命名为PrPc(c取“cell”首字母)。,PrP的一级结构,均有约253254个AA组成，为疏水性蛋白，其N端22个AA为信号肽，第2395处有一段富含甘氨酸和Cu2+等的5个8肽重复区，第96112氨酸为转录控制区，从11313
5、6从为跨膜区(复制关键区），在179214处组氨酸残基间有1个二硫键连结，第136231 AA间有3个螺旋区。在C端第232 AA残基可连结一个糖基磷脂酰肌醇锚(glycoyl phophatidyl inositol，GPI)，插入胞膜。,PrP的一级结构示意图,N端,C端,PrP的二级结构,它们在立体结构上存在很大差别：,PrPc转化为PrPsc结构模式图,PrPc的生物学功能,PrPc是将Cu2+等从胞外运入胞内的跨膜转运载体蛋白。一般认为N端的8肽重复区是Cu的结合部位。不同pH条件下，结合能力不同，Cu2+是SOD组成部分，故PrP可保护神经元免遭过氧化攻击；PrPc可调节神经细胞内
6、钙离子浓度，而参与其信号传导；PrPc有抑制脑内一氨基丁酸(GABA)受体兴奋作用，缺如可致震颤；维持小脑皮层蒲肯野细胞活性，使机体不出现共济失调和早熟死亡；促进T淋巴细胞成熟、活化过程，可能与其C端的GPI锚有关；,PrPsc的生物学特性,既能被某些可降解蛋白的处理方法所破坏，又能部分抵抗蛋白酶。对核酸酶处理及紫外线照射均不敏感。PrPsc对热、辐射、酸碱和常规消毒剂有很强的抗性。,PrPsc的致病性特性,感染后潜伏期长(数月至数年)；宿主没有免疫应答，不破坏宿主B细胞和T细胞的免疫功能;没有发现炎症反应;慢性进行性病理变化(有淀粉样斑块，神经胶质增生等)疾病不会康复或减轻，最终归于死亡;细
7、胞不产生细胞病变，感染细胞内未发现包涵体;对干扰素不敏感，不诱导细胞产生干扰素;没有发现传染性核酸，不含非宿主蛋白;免疫抑制剂，免疫增强剂等不能改变潜伏期和病程。,PrPsc的致病机制,Prusiner等大量的研究指出，人和动物脑的退化病的发病机制是由细胞内PrPc转变为 PrPsc，PrPsc聚集，最后导致神经元-淀粉变性。Borchelt等（1990）发现朊病毒的增殖是一个指数增长的过程。目前，关于PrPsc的增殖机制有下面几种假说：Prusiner的二聚体假说、Lansbury的聚合作用假说及Fred等的构象模式假说。,二聚体假说：PrPc与PrPsc结合体，PrPc被PrPsc置换，形
8、成2个PrPsc分子，下一周期2分子PrPsc与2分子PrPc结合，置换后形成4分子PrPsc。感染就是PrPsc侵入，复制就是PrPc在PrPsc催化下，使PrPc变为PrPsc。聚合作用假说：在聚合体中，以PrPsc为核心，外面包围PrPc，PrPc对形成聚合体是必要的。感染就是PrPsc进入PrPc中。,PrPc转化为PrPsc的机制,PrPsc是PrPc的异构体，当发生感染时，PrPc中的螺旋不断向折叠转变,导致正常蛋白构象转变，形成PrPsc，其转变可被紫外线、酸碱等因素所诱导。研究表明，PrPsc和PrPsc之间存在一个高能活化能垒(energy barrier)，其自由能差G0.
9、9KJ/mol，因而使PrPsc向PrPc转化十分困难。在PrPsc的二级结构中存在4个突变区，其中3个就位于-折叠上，这可能与PrPc的感染性，潜伏期密切相关。,PrPsc易聚集的原因,Christopher提出有些蛋白容易聚集是因为结构决定的，特别是-折叠的蛋白。PrPsc及淀粉样变蛋白都属于这种蛋白，两者容易聚集成为纤维。,血液传播,近年研究证实，PrPc在人神经系统表达量最高，在外周淋巴细胞、单核细胞、造血细胞也均有较高水平表达，在心脏、骨骼肌、脾、胰、肾等组织中可检测到。在脑内，则以皮层、海马、纹状体和嗅球最为丰富，其次为中脑、丘脑和小脑。再次为脑干。在脑组织中广泛分布有PrP的受体
10、。大量研究表明，在人的外周血PrP被T、B淋巴细胞，杀伤细胞(NK)，单核细胞和树突状细胞所表达，在血小板和血浆中数量最大。近年研究及临床发现，存在血液传播的可能性。,防治措施,禁止大量进口牛、羊等动物及其肉制品、血制品、免疫制品、动物蛋白饲料等；医疗器械尽量一次性使用，以防医源性传播；非一次性器械可浸泡在1M NaOH液中1h或132以上高压消毒1h，因为煮沸、环氧乙烷、过乙酸、三氯甲烷、苯酚、甲醛、-射线、紫外线等对PrPsc均无效；病牲畜头颅、尸体的最好处理办法为焚烧，因为PrPsc在干枯的大脑中能生存2年以上，故对疑似或确诊的病人、畜尸体均不宜作地下深埋处理；尽量不用牲畜组织提取激素等
11、药物，应改用化学合成的激素等。,朊病毒的检测方法,免疫印迹分析法ELISA法（双抗夹心法）夹心免疫法免疫荧光法,免疫印迹法检测PrPsc,原理：根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。,免疫印记法检测实例：用大肠杆菌表达的牛朊病毒正常成熟蛋白免疫新西兰白兔，获得了与朊蛋白(PrP)反应的抗体T1。根据致病型朊病毒(PrPsc)能抵抗蛋白酶消化的特性，用蛋白酶K消化脑织提取物，以抗体T1进行免疫印迹反应，结果表明从接种羊瘙痒病朊病毒的金黄地鼠脑组织提取物内检测到抗蛋白酶K消化的致病型PrPsc，而正常金黄地鼠脑组织中没有抗蛋白酶消化的蛋白。,ELISA法检测PrPsc,原理：酶联
12、免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA)是在免疫酶技术(Immunoenzymatic techniques)上发展起来的一种新型免疫测定技术。过程：抗原吸附在固相载体上，这个过程称为包被，加待测抗体,再加相应酶标记抗体，生成抗原-待测抗体-酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。待测抗体的量与有色产物成正比。,ELISA法分为四种：直接法、间接法、双抗夹心法和竞争法。双抗夹心法：,夹心免疫法：使用两个单克隆抗体（是两个不同的抗原决定基Epitope）的一种夹心免疫法，第一个抗体在固相中被免疫，而第二个抗体则是用共价酶做标记，通过测量这种酶的活性来检测。,免疫荧光法检测PrPsc,原理：应用免疫学基本原理即抗原与抗体特异性结合的原理，用荧光抗体/已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体/相应抗原的方法。前者称为荧光抗体法，后者称荧光抗原法（下图）。,
