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1、绿色荧光蛋白将色彩引入生命科学研究,GFPBring the Colors to the Study for Life Science,南京师范大学生命科学学院张朝,2011.11.9,绿色荧光蛋白的分子生物学及其应用,The Nobel Prize in Chemistry 2008,for the discovery and development of the green fluorescent protein,GFP,Osamu Shimomura,Martin Chalfie,Roger Y.Tsien,Marine Biological Laboratory,Woods Hole,
2、MA,USA;Boston University Medical School Massachusetts,MA,USA,Columbia University New York,NY,USA,University of California San Diego,CA,USA;Howard Hughes Medical Institute,2008年诺贝尔化学奖获得者及其贡献,下村修，日本人，名古屋大学理学博士毕业后赴美，先后在美国普林斯顿大学、波士顿大学和伍兹霍尔海洋生物实验所工作。1962年从一种水母中发现了荧光蛋白，被誉为生物发光研究第一人。,钱永健，美籍华裔，现为美国加州大学圣迭戈分校
3、生物化学及化学系教授、美国国家科学院院士、国家医学院院士，2004年沃尔夫医学奖得主。其主要贡献在于利用水母发出绿光的化学物来追查实验室内进行的生物反应，他被认为是这方面公认的先驱。,马丁沙尔菲，美国哥伦比亚大学生物学教授，他获奖的主要贡献在于向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光的遗传标签的作用，这一技术被广泛运用于生理学和医学等领域。,1962年Shimomure等首先从维多利亚水母(Aequorea Victoria)中分离出了GFP(Green-Fluorescent Protein)。,绿色荧光蛋白的研究史,维多利亚水母(Aequorea Victoria),A test tube con
4、taining a sample of a cyan(greenish-blue)fluorescent protein from a sea anemone illuminated by ultra-violet light from below.,水母体内有一种发光蛋白Aequorin，它与钙离子结合时会发出蓝光，这道蓝光立刻被一种蛋白吸收，从而发出绿色萤光。这种捕获蓝光、发出绿光的蛋白质，就是GFP,水母发光蛋白发出的蓝光通过能量转移激发GFP发出绿光水母发光蛋白 脱辅水母发光蛋白+氧化荧光素+蓝光绿色荧光蛋白 绿光水母素在钙离子的刺激下发光，其能量可转移到GFP上，刺激GFP发光。这是
5、物理化学中已知的荧光共振能量转移（FRET）在生物中的发现。,钙离子,蓝光,发光过程,下村修,下村修因此成为首位从水母中分离出GFP，并发现这种蛋白质在紫外光下呈亮绿色的科学家，他被誉为生物发光研究的第一人,1992年Prasher等克隆了GFP基因的cDNA，并分析了GFP的一级结构。,绿色荧光蛋白的研究史,马丁沙尔菲,如果说下村修是绿色荧光蛋白的“接生婆”，沙尔菲则是绿色荧光蛋白的价值发现者。马丁沙尔菲等对实现GFP的基因表达做出了突出的贡献他获奖的主要贡献在于向人们展示了绿色荧光蛋白作为发光的遗传标签的作用。,绿色荧光蛋白的研究史,1994年Chalfie等首次在大肠杆菌细胞和线虫中表达
6、了GFP，开创了GFP应用研究的先河。,钱永健,钱永健在改造GFP方面取得了卓越的成就。1995年，他完成的单点突变（S65T）显著提高了GFP的光谱性质，起荧光强度和光稳定性也大大增强。钱永健的主要贡献在于利用GFP来追踪追踪多种生物细胞进行的生物反应，他是这方面公认的先驱。,之后很快发现GFP能在多种异源细胞中表达，GFP在细胞学、分子生物学和医学、病毒学等领域中迅速掀起了一股热潮。1997年10月18-22日在美国New-Jersey专门召开了一次关于GFP的国际会议。,绿色荧光蛋白的研究史,2007年1月7日，东北农业大学刘忠华教授主持的转基因克隆猪课题获得成功。中国首例绿色荧光蛋白转
7、基因克隆猪成功产下2头具有绿色荧光遗传特征的小猪。这是继美国、韩国、日本之后第四例成功通过体细胞核移植方式生出的绿色荧光蛋白转基因克隆猪。,绿色荧光蛋白的研究史,绿色荧光蛋白的结构解析,绿色荧光蛋白的结构解析,维多利亚水母 GFP的cDNA编码区全长717nt,绿色荧光蛋白的结构解析,维多利亚水母 GFP由 238 aa组成，分子量约 27 kD,绿色荧光蛋白的结构解析,GFP 晶体结构显示,蛋白质中央是一个罐形结构,长 420 nm,宽 240 nm,由 11 个围绕中心螺旋的反平行折叠组成,荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,罐的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖,底部由一个短的垂直片段覆盖,
8、对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。,绿色荧光蛋白的结构解析,A topology diagram of the folding pattern in GFP.The-sheet strands are shown in light green,a-helices in blue,and connecting loops in yellow.The positions in the sequence that begin and end each major secondary structure element are also given.The anti-parallel stran
9、ds(except for the interactions between strands 1 and 6)make a tightly formed barrel.,The green fluorescent protein GFP consists of 238 amino acids,linked together in a long chain.This chain folds up into the shape of a beer can.Inside the beer can structure the amino acids 65,66 and 67 form the chem
10、ical group that absorbs UV and blue light,and fluoresces green.,绿色荧光蛋白的罐形结构,绿色荧光蛋白的结构解析,The dimer contact region.The two polypeptide chains associate over a broad area,with a small hydrophobic patch(in the yellow box)and numerous hydrophilic contacts.The two-fold symmetry axis is in the plane of the
11、 page,and is marked by the red arrow.The polar residues are marked with red atoms for oxygen and blue for nitrogen.,绿色荧光蛋白的结构解析,绿色荧光蛋白的发光特性,GFP吸收的光谱,最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder)。,绿色荧光蛋白的发光特性,GFP的光谱特性与荧光素异硫氰酸盐(FITC)很相似，因此为荧光素FITC设计的荧光显微镜滤光片组合也适用GFP观察。尽
12、管450490nm(蓝光)是GFP的副吸收峰，但由于长波能量低，细胞忍受能力强,因此更适合于活体检测。GFP荧光极其稳定，在激发光照射下，GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素(fluorescein)强，特别在450490nm蓝光波长下更稳定。,GFP需要在氧化状态下产生荧光，强还原剂能使GFP转变为非荧光形式，但一旦重新暴露在空气或氧气中，GFP荧光便立即得到恢复。而一些弱还原剂并不影响GFP荧光。中度氧化剂对GFP荧光影响也不大，如生物材料的固定、脱水剂戊二酸或甲醛等。但GFP对某些封片指甲油特别敏感。GFP荧光在pH7.0-12.0稳定，在pH5.5-7.0开始受到
13、影响，高温(70)、极端pH或胍基氯化物条件下，GFP会变性，荧光消失，一旦外界条件恢复正常，荧光将部分恢复。,绿色荧光蛋白的发光特性,GFP发色团的骨架在左边。蛋白质链形成一个圆柱形罐头（蓝色），子链的一部分直接从中间穿过（绿色），发色团刚好在罐头盒的中间，它被保护起来以免受周围环境的影响。这种保护对于发射荧光是必需的。一但发色团吸收一个光子，激活的水分子通常就会夺取它的能量。但是在蛋白质内部改为发射能量稍低的光子来释放能量，使它得到了保护。发色团（右图）由蛋白质链上的三个氨基酸：甘氨酸，酪氨酸和苏氨酸（或丝氨酸）自发形成。,绿色荧光蛋白的发光基团,GFP 荧光的产生主要归功于分子内第 65
14、、66、67 位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色团的功效。,GFP荧光生色团,翻译出的蛋白质折叠环化之后,在 O2 存在下，分子内 Gly 67的酰胺对第 Ser 65的羧基的亲核攻击形成第 5 位碳原子咪唑基,Tyr 66的2键脱氢反应之后，导致芳香团与咪唑基结合。这样,GFP 分子中形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团,该过程可以自动催化完成。,绿色荧光蛋白的发光基团,Stereo view of the fluorophore and its environment.His148,Gln94 and Arg96 can be seen on opposite ends of the fluoro
15、phore and probably stabilize resonant forms of the fluorophore.Charged,polar,and non-polar side chains all contact the fluorophore in some way.,绿色荧光蛋白的发光基团,Gln94,Arg96,Model of the fluorophore and its environment superposed on the MAD-phased electron density map at 2.2 resolution.The clear definitio
16、n throughout the map allowed the chain to be traced and side chains to be well placed.The density for Ser65,Tyr66 and Gly67 is quite consistent with the dehydrotyrosine-imidazolidone structure proposed for the fluorophore.Many of the side chains adjacent to the fluorophore are labeled.,绿色荧光蛋白的发光基团,目
17、前对GFP的荧光发光机制还不清楚，Morise等人曾提出一个能量传递模式图来解释水母的发光机制，但并未获得认同。Chattoaj等对GFP进行了光谱分析，结合前人工作提出，GFP有两个明显的吸收带，对应于GFP的两种不同构象的基态A和B。基态A对应于395nm的吸收峰，基态 B对应于475nm的吸收峰，基态A占优势，基态B的分子数量约是基态A的1/6，两种基态间能缓慢地转换，但激发态(*)之间的转换很快且发生了质子转移，A*快速高效地衰变至另一激发态，应该存在一个中间过度态I，质子转移使A*转变成I*,I*回迁到基态I时产生发射峰504nm的荧光，构象改变使I*转变成B*，由B*到B发射荧光而
18、不发生质子转移。目前，对于GFP的作用机理较为认同的仅仅是：GFP是生物发光过程中的能量受体，并且是最终的发光体，不同的生物发光机制各不相同，不同的突变体发光机制也有很大差异。,绿色荧光蛋白的发光机制,在离体状态下GFP对高温(70OC)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶(链霉蛋白酶除外)有较强抗性GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高，抗光漂白能力强，因此更适用于定量测定与分析。但因为GFP不是酶，荧光信号没有酶学放大效果，因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白。由于GFP荧光是生物细胞的自主功能，荧光的产生不需要任何外源反应底物，因此GFP作为一种广泛应用的活体报告
19、蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。,GFP的其他生化特性,GFP作为标记蛋白的优点,荧光稳定,检测方便,无种属特异性，也无有细胞种类和位置的限制,GFP对受体细胞基本无毒害,易于构建载体，不受假阳性干扰,不需任何反应底物和辅助因子,可制成永久标本,灵敏度高,GFP基因的改进,更换GFP生色团氨基酸改变碱基组成除去GFP基因中隐蔽剪接位点插人植物内含子更换强启动子等突变体GFP对密码子进行优化修饰增加荧光强度和热稳定性，促进了生色团的折叠,Zolotukhin等（1996）改变了wtGFP基因编码区中88个密码子中的92个碱基而用人类基因组中常用的密码子代替，将GFP的荧光强度提高2
20、2倍，适合在哺乳动物细胞中高效表达。,人工GFP,Guohong Zhang等（1996）将GFP的荧光强度提高了35倍，转染16h24h后仍可稳定地测定荧光。,增强型GFP,将wtGFP中的Ser65用 Thr替代，得到突变体。S65T-GFP，激发谱 中只有一个峰，且红移至490nm，用蓝光即可激发RSFP，使之更适于普通荧光显微镜观察。,红移荧光蛋白,双突变体Y66H/Y145F能在381nm光的激发下产生445nm的蓝光，故称BFP。这种蓝光能进一步激发GFP产生绿光，即发生荧光共振能量转移现象（FRET）。,蓝色荧光蛋白,EBFP：增强蓝色荧光蛋白；ECFP：增强蓝绿色荧光蛋白EGF
21、P：增强绿色荧光蛋白；EYFP：增强黄色荧光蛋白,绿色荧光蛋白变异体的发色基团结构,基于GFP的传感器,一种被修饰过的用来感应锌离子浓度的蓝色荧光蛋白：当红色的锌离子连接到蓝色的被修饰过的发色团上后，蛋白质会发出亮度增强一倍的荧光从而形成容易被检测到的可见信号。,Crystal structure of a Cu-bound green fluorescent protein Zn biosensor,Crystal structure of a Zn-bound green fluorescent protein biosensor,锌离子GFP传感器,88mM FIP-CBSM and 8
22、8 mM CaM(panels AC)88mM FIP-CBSM alone(panels DF).,钙离子GFP传感器,pH titrations of GFPs.(A)Fluorescence and absorbance of GFP-S65T as a function of pH.Data were fitted to Eq.1 with pKa and nH parameters given in the text.For comparison,fluorescence titration for fluorescein is shown(-).(B)Fluorescence of
23、 GFP-F64L/S65T,GFP-Y66H,and GFP-T203I as a function of pH with curve fits as in A.,pH-GFP传感器,GFP在生物研究中的应用,GFP在动物学研究中的应用,GFP作为新型报告基因用于转基因研究 作为报告基因构建基因工程载体。以GFPS65T基因作为筛选标记的新型克隆载体，以绿白斑筛选法筛选阳性重组子，替代Lacz蓝白斑筛选，不需X一gal。GFP融合蛋白用于研究蛋白质定位、移动及相互作用 Hale C.A.等利用 GFP标记，研究了可溶性微管蛋白FtsZ与其内膜受体ZipA间的相互作用，发现，ZipA-GFP融
24、合蛋白在细胞壁溢缩前和溢缩过程中均位于FtsZ与膜相关的特殊环中。,GFP作为一种新型免疫标记物 利用GFP的发光特性使免疫反应呈绿色荧光从而可以直接观察，可望取代传统的标记技术，建立特异、灵敏、简便和快速的免疫诊断新方法。岳莉莉等成功地实现了gfp与HBVe抗原基因融合后在大肠杆菌和昆虫细胞中高效表达，得到既能发射荧光又具有抗原性的双功能融合蛋白，为获得一种新型发光免疫诊断试剂奠定了基础。,GFP在动物学研究中的应用,GFP在植物研究中的应用,作为报告基因用于转基因植物研究 GFP作为新型报告基因用于植物的遗传转化，可以替代与筛选有关的抗生素或抗除草剂标记基因，既优化植物遗传转化过程，又使转
25、基因植物更安全。用于植物基因表达调控研究 基因的表达可进行活体检测，利用GFP基因可以很方便地研究基因表达的时空性。Aspuria等(2002)将GFP与受生长素诱导的启动子重组后导入植物，用生长素诱导后，通过观察侧根的分生组织中是否有 GFP的积累来证明生长素的时空表达。,The photograph was taken 6 days post-inoculation using a DR Hand Lamp.The green fluorescent spots(against a background of red chlorophyll fluorescence)show the ex
26、panding foci of virus-infected cells.,病毒介导的EGFP在烟草中的表达,RNA silencing of green fluorescent protein(GFP)(center)in leaves from Nicotiana benthamiana is suppressed by an animal(left;B2 protein of flock house virus)or a plant(right)viral suppressor,leading to enhanced GFP expression(lighter green/yellow
27、 areas).,GFP用于植物RNA沉默研究,用于植物信号转导研究 GFP结合荧光共振能量转移(FREP)为研究植物信号转导也提供了新方法。例如：Allen等用 YEP-GFP-Ca2+传感器检测拟南芥保卫细胞内Ca2+浓度的变化，结果表明，外源的Ca2+和 ABA都能引起保卫细胞内Ca2+浓度的变化。这和过去用荧光染色法观察到的结果一致。,GFP在植物研究中的应用,GFP在微生物研究中的应用,GFP用于微生物与宿主相互作用研究 利用GFP 标记基因可以研究病毒、细菌和真菌等侵染植物的过程和机制。Bowyer 等在小麦病原菌中构建了含异柠檬酸酶启动子的GFP 基因，监测到T.yall und
28、ae 侵染小麦时的碳代谢过程。GFP用于检测环境微生物的迁移 Leff 等将GFP克隆到基因工程菌中,监测其在水环境中的存活和去向。Scott 等以GFP 红移突变体作为标记基因,有效地追踪了乳酸细菌在复杂厌氧系统中的运移。,GFP在微生物研究中的应用,GFP微生物传感器 将报告基因转入污染物代谢基因的启动子中可设计出生物传感器,当特定的污染物存在时即启动。Ikeno等分别以GFP 和Ps 作为报告基因和启动子，转入E.coli 重组子中，用以检测水体中微量的苯衍生物。Roberto 等以GFP 作为报告基因，设计出可检测环境中亚微克级含量的砷和砷酸盐的生物传感器。,Moller 等研究发现G
29、FP 标记的P.putidaRI 细菌主要聚集在生物膜的表层，而Acinetobacter sp.C6 则附着在生物膜底层生长。,研究生物膜的生长特性及其菌落特性,C6:red R1:blue,GFP在微生物研究中的应用,GFP在真菌研究中的应用（1）GFP基因通过随机插入真菌基因组的方法,已经被成功地用来研究真菌的生态、生防菌对病原菌的侵染模式及病原菌与其寄主的关系等（2）GFP基因通过与目标基因融合的方法,则被广泛地用于真菌的基因转录规则、蛋白质及细胞器定位、细胞亚结构和蛋白质功能等研究.,GFP在生物医学中的应用,药物筛选 利用GFP荧光探针，从数量众多的化合物中判断出那些化合物具有与信
30、号分子相似的，能引起配体-受体复合物迁移并介导生理反应的功能。如介导糖皮质激素受体（hGR)迁移药物的筛选模型的成功构建。用于临床检验示踪病原菌,GFP在肿瘤研究中的应用,GFP在肿瘤研究中的应用,GFP在蛋白质细胞定位中的应用,An image of a single mamalian cell with green-to-red fluorescent Dendra marking fibrillarin,a protein concentrated in nucleoli,which are small,round bodies in the cells nucleus,composed
31、 of protein and RNA.,科学使用绿色荧光蛋白跟踪大脑细胞的活动,随着病毒在宿主体内不断扩散，通过跟踪发出的绿光就可观察病毒的扩散途径；或者把它接合到一种蛋白质上并通过显微镜观察它在细胞内部的移动。,a.线粒体；b.肌动蛋白；c.微管蛋白d.高尔基体；e.纽蛋白；f.组蛋白,Localisation of the ER targeted form of GFP,Roots from Arabidopsis plants transformed with a construct containing the cyclin B1;1promoter,cyclinB1;1 gene
32、fused to GFP.Cells fluorescing in green are in mitosis,GFP转基因生物,发绿光的老鼠,1997年7月日本大阪大学的科研人员首次培育出能够夜里发光的含有绿色荧光蛋白的老鼠。,1998年，Eduardo Kac通过转基因技术培育出第一条可以发出绿色荧光的狗。,发绿光的狗,转GFP基因的蜜蜂,转GFP基因的蝾螈（斑马鱼）,转GFP基因的兔子,GFP基因在蛾子的眼部表达,2004年7月12日韩国科学家成功培育出身体可发出荧光的转基因鸡。,发荧光的鸡,发红光的猫,韩国科学家采用基因工程技术克隆的“荧光猫”2007年登上世界各大媒体的头条新闻。一旦暴
33、露在紫外光线下，这种克隆猫就能发红色的荧光。,我国首例荧光转基因克隆猪产下荧光猪崽,2007年1月7日，东北农业大学刘忠华教授主持的转基因克隆猪课题获得成功。中国首例绿色荧光蛋白转基因克隆猪成功产下2头具有绿色荧光遗传特征的小猪。,中国第一例转基因猴子在昆明落地,南方都市报 发布时间：2010-11-12 08:31,The head of a barley plant transformed with a gene for green fluorescent protein(GFP)using the gene gun.(The red head is untransformed;the g
34、reen head is transformed),基因枪介导的GFP在小麦中的表达,GFP canola(left)with a wild-type plant(right)under UV light.,发绿光的油菜,“艺术”中的GFP调色板,Bacterial colony using various GFP and GFP-like proteins(from Tsien lab Web site).,钱永健实验室,细胞里的彩虹,用产生不同颜色荧光蛋白的细菌创作的图画,科学家用九十多种颜色的荧光蛋白“标记”的小鼠大脑中神经细胞就像一个个五颜六色的风筝，又像彩虹。,大脑里的彩虹,神经胶质
35、细胞，像这些星细胞，重点照顾思考神经元的身体，包括饮食和保护。,大脑彩虹图象抽象画,此混杂又浓密的神经元位于脑干的听觉区,这些位于大脑皮层的神经元就是通常所说的大脑灰质，参与思考和各种感觉。,此细胞图像正在向小脑传送信息，告诉它肌肉要怎么做,一个脑干神经元（红色）被来自其它神经元的残余信号（蓝黄色）所包围,大脑彩虹图展示神经活动,美国哈佛大学分子与细胞生物学教授杰夫李其曼在其显微镜前,大脑里的彩虹,绿色荧光蛋白为什么重要？,钱永健如是说在追踪細胞內移动的分子上，綠色荧光蛋白是非常方便的道具，有助于追踪脑神经细胞的发育过程及癌细胞的扩散情況，一举一动都逃不过科学家的眼睛，这回拿下诺贝尔奖，也象征医学科技又向前迈进一大步。,谢谢！,
