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1、第五章 植物花药和花粉培养,本章内容提要：一、概念二、花粉和花药培养技术三、花粉和花药培养应用,1、概念单倍体细胞(haploid cell)：植物的花粉是花粉母细胞经减数分裂形成的，其染色体数只有体细胞的一半。花粉和花药的培养(pollen and anther culture)：指花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精而发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整植株的技术。单倍体植物(haplobiont)：用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株。,2、花粉和花药培意义,诱导形成单倍体，快速获得纯系，缩短育种周期；有利于筛选隐性突变体，提高选择效率。获得无病毒个体。,3、花药培养发
2、展简史,1964年：Guha&Maheshwari南洋金花花药培养发育成胚；1967年：Bourgin&Nitsch花药培养获得烟草植株；1973年：我国首次报道了小麦花药培养获得再生植株；目前：许多农作物及经济植物通过花粉培养都能诱导成植株。,4.花药培养与单倍体育种花药培养的主要目的：培育花粉粒的单倍体植株，并使单倍体加倍，作为育种材料的来源。利用杂种花药离体培养获得的再生植株，由不同基因型的配子发育而来，具有丰富的变异类型，选择出有利的变异类型，经过经济性状鉴定后，选出优良者直接用于生产或配制杂交组合，获得优良杂交种子。构建永久性分离群体双单倍体系（Doubled haploid)，用于
3、基因定位。,大大缩短育种周期,5、花药培养技术 确定取材时间 选择大致处于所需要时期的花蕾。由于花粉发育时期和植株的某些外部形态特征之间的大致相关性，因此利用这些外部标志，选择符合条件的花蕾，经镜检确定花粉发育的准确时期。在水稻中，以单核靠边期的花粉对诱导单倍体植株较为适宜，在外部形态上可根据叶枕距为5-15cm，颖片淡黄绿色、雄蕊长度接近颖片长度的1/2这些条件鉴定。,水稻花药培养操作过程,旗叶鞘用70酒精擦洗一遍,选取主穗（一级侧枝）的花蕾，因为一级侧枝的花蕾发育良好，数量大，发育同步。操作过程中不应使花药受到损伤，若受损伤，则应淘汰，因为损伤常常会刺激花粉壁形成二倍体的愈伤组织。,花药培
4、养的条件：光照(1218h，5,00010,000 lx，28)黑暗(12-16h，22)周期交替进行。,6、影响花药诱导频率的因素1）花粉发育时期是影响培养效果的重要因素。在诱导花粉进行雄性发育(指小孢子沿孢子体途径发育成花粉植株)过程中，不同物种花粉最适的发育时期不同，对多数植物来说，单核中期或晚期的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈伤组织。如南洋金花、烟草和芍药中的最适时期是第一次有丝分裂时期或稍前后，禾本科植物在单核早期(大麦)或单核中期(玉米、小麦)反应最好，番茄在减数分裂中期时更适宜。,2）花药供体植株的生长条件对花药培养反应的影响是很大的。水稻、小麦、大麦等禾本科植物，主茎穗比分蘖穗花
5、药愈伤组织的诱导率明显地提高。同步化程度高。,3）培养基是花粉启动和再分化的重要条件我国科学工作者对水稻、小麦的花药培养基做了改进，研制出N6培养基。在N6培养基上，水稻花粉的出愈率大幅度提高。N6培养基的特点是铵离子浓度较低。随后，进一步降低铵盐和硝酸盐浓度，同时附加生物素，研制出C17和W14培养基，它们可以大幅度提高小麦的花药出愈率。马铃薯提取液为基本成分的马铃薯培养液，现在被广泛地应用于小麦花药培养，效果良好。,培养基中的植物生长物质种类会影响花粉发育的途径,一般在禾本科植物中，常用1-5mg/L 2,4-D或NAA诱导花粉愈伤组织形成，再将愈伤组织转移至降低或去除生长素或补加细胞分裂
6、素类物质的分化培养基上，以诱导器官分化和再生植株形成。,糖种类对花粉胚的诱导和分化有显著影响。,朱至清等(1990)报道在过滤灭菌的条件下，若以0.21 mg/L葡萄糖取代液体培养基中同等浓度的蔗糖，小麦花粉胚的诱导频率可增加2-10倍。一般说来，高蔗糖浓度可以抑制体细胞的生长而对花粉的生长无妨碍。烟草的最适蔗糖浓度为3，水稻为3-6，玉米则为12-15。,在培养基中加入活性炭能促进花药培养,4）低温预处理可以提高花粉胚的诱导频率 以1-5预低温处理小麦幼穗，能提高花粉愈伤组织的产量。在4下冷冻石刁柏花蕾，预处理4天、8天和12天，愈伤组织诱导率比室温对照分别提高2.4倍、1.9和1.5倍。各
7、种植物要求预处理的温度和时间不同。,培养温度是影响花药反应的一个重要因素。小麦要求先高温培养64天之后，再转入28-30下培养。一直高温培养效果并不好。较高的温度虽能诱导较高频率的花粉愈伤组织，但愈伤组织分化白化苗的频率也高。控制培养温度仍是减少白化苗的一个有效措施。,7、图示花药培养过程,花药材料的选取 关键选取处于合适发育期的花药，离体培养后才能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双核期的花药，均有可能诱导离体孤雄发育。大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期为单核期，或单核中晚期。,花粉培养过程,选幼年树花蕾,单倍体植株的二倍化花粉植株染色体可自发加倍；人工措施染色体加倍。,传统方法是用秋水仙素处理。较大浓度的秋水仙素溶液处理单倍体植株，时间为24-96 h。浸泡试管苗方法、处理芽方法、浸根方法,花药培养脱毒,1974年日本：花药培养可以脱除草莓病毒；花药采取时期 单核期：花蕾4-6mm，花药1mm花药诱导愈伤组织培养基MS+IAA4mg/L+BA2mg/L+KT2mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L增殖培养基MS+GA1mg/L+IBA0.2mg/L+BA1mg/L+蔗糖30g+琼脂7g/L生根培养基1/2MS+IBA0.2mg/L+活性炭3g/L+蔗糖20g+琼脂7g/L,作业：,1、试论述花药培养的意义。2、详细论述花药培养方法。,
