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1、重组DNA技术,第二章,重组DNA技术又称DNA克隆或分子克隆,DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone,1944年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验:,从S型细菌中分别抽提出DNA、蛋白质和荚膜物质，并把每一种成分同活的R型细菌混合，悬浮在合成培养液中。结果发现只有DNA组分能够把R型细菌转变成S型细菌,重组DNA技术的发展史,1865年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验。O.T.Avery（1944年）证明，遗传信息的携带者是DNA；J.D.Watson和F.H.C.Crick提
2、出了DNA分子的双螺旋结构模型（1953年）M.Meselson和F.W.Stahl证实了DNA的半保留复制（1958年）F.H.C.Crick提出遗传信息传递的“中心法则”（1958年）F.Jacob和J.Monod提出了调节基因表达的操纵子模型（1961年）M.W.Nirenberg等人破译了氨基酸的64个遗传密码（1966年）1972年，P.Berg等率先完成了DNA体外重组(1980年诺贝尔化学奖)1973年，S.Cohen等进一步实现了重组DNA的转化1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。1980年 开始建造第
3、一家应用重组DNA技术生产胰岛素的工厂。1982年，美国食品与药物管理局批准首例基因工程产品-人胰岛素1997年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉。,人体生长激素释放激素(SS),抑制和调节多种激素的作用,相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体基本原理 重组DNA技术与医学的关系,主要内容：,第一节、重组DNA技术相关概念 Concept Associated to Recombinant DNA Technology,克隆(clone):是指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的群体,获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。,（
4、一）DNA克隆,技术水平：分子克隆(molecular clone)（即DNA 克隆）细胞克隆 个体克隆（动物或植物）,是在体外将不同来源的特异基因或DNA片段插入病毒、质粒或其它载体分子，构建重组DNA分子，然后将重组DNA导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖（称之为“克隆”），筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子(recombinant DNA,chimera DNA），即DNA克隆，因此DNA重组技术又称为DNA克隆（DNA cloning）。,DNA克隆,生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等,基因工程(genetic eng
5、ineering)实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学或重组DNA技术(recombination DNA technique)，基因操作(gene manipulation)、遗传工程(genedc engineering)。,(二)目的基因,进行DNA重组的目的主要有两方面：分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）这些使我们感兴趣的基因或DNA序列就是目的基因(target DNA)。目的基因有两种类型：cDNA(complementary DNA):在体外经反转录合成的与mRNA互补的DNA。基因组DNA(Genomic DNA)
6、:代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。,(三)载体,一.表达载体(expression vector):为使插入的外源DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。二.克隆载体(Cloning vector):为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。,第二节 重组DNA技术操作的基本过程,基本原理,重组DNA技术操作的主要步骤,重组DNA技术操作过程可形象归纳为：,目的基因,基因载体,重组体,分,切,接,转,筛,表,总体技术路线,以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程,第二节 重要的工具酶,限制性核酸内切酶 DNA聚合酶 逆转录酶 T4
7、DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶,重组DNA技术中常用的工具酶,一.限制性核酸内切酶(restriction endonuclease),限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,+,Bam H,定义：,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。,命名：,Hin d,Haemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶,、（基因工程技术中常用型）,分类：
8、,型限制性核酸内切酶的作用特点 回文结构(palindrome)大部分型限制酶能够识别由4个8个核苷酸组成的特定序列。型酶识别具有回文结构的核苷酸序列（图2-2）。“回文”意为顺读和倒读都一样的词语,切口：平端切口、粘端切口,Bam H,+,Hind,+,平端切口,粘端切口,来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。,+,Bam H,+,Bst,同功异源酶：,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。,Bam H,Bg l,+,+,同尾酶,限制性内切核酸酶,二、D
9、NA连接酶(基因工程的“缝纫针”)：1.T4噬菌体DNA连接酶：两个不同片段双链DNA存在互补粘性末端（Km=0.6mol/L)或平末端(Km=50mol/L)。DNA连接反应都是由T4DNA连接酶介导 2.大肠杆菌DNA连接酶:不能催化平末端DNA分子的连接 三、DNA聚合酶1.大肠杆菌DNA聚合酶I及其大片段(Klenow片段):大肠杆菌DNA聚合酶I具有三种酶活性。Klenow片段具有二种酶活性（去除5 3外切酶活性）。2.Taq DNA聚合酶:耐热（75-80），分子量65kD,也具5 3外切酶活性。反转录酶(RDDP):多功能酶，无3 5DNA外切酶活性，具有3 5RNA外切酶活性。
10、,第四节 常用载体,定义载体是携带目的基因进入宿主细胞扩增和表达的工具。具备的条件:具有自主复制能力有多个单一限制性内切酶的酶切位点（MCS）具有选择性遗传标记分子量小拷贝数高（10个200个/细胞）具有较高的遗传稳定性。,常用载体:质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA,质粒(plasmid):是细菌内携带的染色体外的小型双链环状DNA，能独立进行复制。,特点:1.分子量相对较小能在细菌内稳定存在，能在宿主细胞内独立自主复制；有较高的拷贝数。2.具有一个以上的遗传标志，便于在宿主细胞进行选择。3.具有多个限制性酶的单一切口，称为多克隆位点。便于外源基因的插入。,常用质粒载体,（一）pBR322质粒
11、：由一系列大肠杆菌质粒DNA通过重组技术构建成，长度为4.36kb，特点：（1）含有复制起始点和复制调节信号；（2）有单个EcoRI酶切位点，可切开插入目的基因；（3）有抗四环素基因Ter+和抗氨苄青霉素基因 Amp+，便于重组体细胞的筛选。,（二）pUC系列载体:,由pBR质粒与M13噬菌体构建而成，长度为2.674kb，特点：具有更小的分子量和更高的拷贝数。“蓝白斑”筛选:pUC载体中的LacZ基因可编码-半乳糖苷酶（-Gal）N端的-肽链，该-肽与宿主细胞(如E.coli JM109）中F因子上的LacZM15基因（-肽缺陷型）的产物互补，产生完整的、有活性的-半乳糖苷酶，分解生色底物（
12、X-gal）形成蓝色菌落。当外源基因插入MCS后，LacZ-肽基因的读码框被破坏，不能合成完整的-半乳糖苷酶分解底物X-gal，菌落呈白色。称为“蓝白斑”筛选。,EcoRSacKpnSmaBamHXbaSalPstSphHind,ori,pUC19质粒载体图,（三）其它质粒载体,1能在体外转录克隆基因的质粒载体:T7、SP6的启动子(RNA聚合酶附着位点)2穿梭质粒载体（shuttle plasmid vector）:具有两种不同复制起点和选择标记,在原核和真核细胞之间往返穿梭.,（四）T-A克隆载体,多克隆位点两侧的3末端携带有未配对的T碱基。由于许多耐热的DNA聚合酶（如Taq、Tth等）
13、扩增时都有在PCR产物3末端加上A碱基的特性，因此在连接酶的作用下可直接将PCR产物插入到T-A载体中。获取、连接外源DNA不受酶切位点的限制。,二、噬菌体载体,噬菌体是一类细菌病毒。（一）噬菌体载体1噬菌体的特点 线状双链DNA，全长48 502bp，由左右两臂组成，两端为12碱基组成的彼此完全互补的5单链突出黏性末端，称为cos位点。感染细菌后，可进入溶菌生命周期及溶源生命周期。优点：可插入较大外源DNA片段（可达23kb）；感染效率远高于质粒载体。,2噬菌体载体的构建,优点：可插入较大外源DNA片段（可达23kb）；噬菌体的感染效率高,噬菌体作为载体用于分子克隆的示意图,DNA重组,体外
14、包装,携带外源DNA有感染性的病毒颗粒,感染大肠杆菌,（二）粘粒载体,结构与特点：1含有cos黏性末端及与噬菌体包装有关的短序列 2含有抗药性标记（如Ampr基因）和自主复制成分 3具有限制性内切酶位点 4粘粒分子小 如pJB8为5.4kb，所以可插入大片段的外源DNA（可达45kb）5某些粘粒若接上能在真核细胞生活的元件及选择标记，便可作为穿梭载体在真核细胞中生存及表达。,（三）M13噬菌体载体,M13是一种丝状单链噬菌体，6 407bp，为闭环单链DNA。M13只能感染具有F伞毛的雄性大肠杆菌，在细菌内复制时形成双链DNA，这种复制型（replication form，RF）M13相当于质
15、粒，可用作基因克隆载体。,三、人工染色体载体,酵母人工染色体载体（yeast artificial chromosome vector，YAC）是第一个成功构建的人工染色体载体,主要包括以下调控元件：着丝粒（centromere，CEN），以保证染色体在细胞分裂过程中正确地分配到子代细胞；端粒（telomere，TEL），作为染色体复制所必需的成分，可防止染色体被核酸外切酶降解而缩短；复制起始点和限制性酶切位点；选择标记；原核序列及调控元件：复制起始点、Ampr基因等，以便于在大肠杆菌中操作。,EcoR和BamH双酶切,EcoR酶切,连接,YAC结构图及基因克隆过程,四、病毒载体,质粒载体、噬
16、菌体载体主要以原核细胞作为宿主细胞。为实现真核基因表达或基因治疗的需要，已发展了用动物病毒改造的病毒载体等。有两类：整合型和游离型。,（一）反转录病毒载体,单正链RNA病毒特点：具有广泛的哺乳动物细胞宿主；可主动感染分裂细胞,反转录生成双链DNA，可整合到宿主染色体中，持续表达外源基因局限性：只能感染并整合到增殖分裂期的细胞；装载容量比较小，仅达8kb；有诱变危险,（二）腺病毒载体,腺病毒是无包膜的线性双链DNA病毒优点：可插入大片段外源基因，可达35kb；宿主范围广，尤其人类是其自然宿主；可感染分裂期和非分裂期细胞；不整合，瞬时表达，因而安全性好。不足：病毒基因组较大，构建载体较复杂；几乎可
17、感染所有细胞，缺乏特异性；载体不发生整合，只能短暂表达。,第五节 目的基因的获取和体外重组,化学合成法：较短的基因（60-80bp）要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。基因组DNA文库(genomic DNA library):cDNA文库(cDNA library):聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR),一.目的基因的获取:,1.化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。,较短的基因（60-80bp）用途：PCR引物,测序引物,定点突变,核酸杂交探针,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分
18、子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,2.从基因组DNA文库获取目的基因,基因组DNA(genomic DNA):指代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列,用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库,3.从cDNA文库获取目的基因,cDNA:指经反转录合成的、与RNA(mRNA或病毒RNA)互补的单链DNA。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA,PCR技术的基本过程,模板DNA dNTP 引物Buffer,预变性,模板DNA dNTP 引物Buffer,TaqDNA聚合酶,循环仪,94oC5,9
19、455 72,4.PCR技术获取目的基因:,二.外源基因与载体的连接:体外重组,方式：(1)同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接,粘性末端连接,DNA体外重组本质上是一个酶促反应过程，在DNA连接酶的催化作用下，将外源DNA分子与载体DNA分子连接成一个重组分子的过程。连接方式:（一）黏性末端连接（二）平末端连接（三）同聚物加尾连接（四）人工接头连接（五）T-A克隆,Bam H切割反应,T4 DNA连接酶15C,同一限制酶切位点连接,不同限制酶切位点的连接,平端连接,限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端,适用于：,在末端转移酶(terminal transferase)
20、的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。,同聚物加尾连接,DNA连接酶,同聚物尾巴,同聚物加尾法连接重组DNA分子,由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。,人工接头(linker)连接,利用人工合成的接头连接重组DNA分子,（五）T-A克隆,T-A克隆策略是一种直接将PCR产物插入到载体中的方法。,一、重组DNA分子的导入选定的受体细胞应具备的条件：1.易于接纳重组DNA分子导入；2.对载体的复制、扩增和表达无严格限制；3.不存在特异性降解外源DNA的酶系统；不对外源DNA进行修饰；能表达重组体分子所提供的某种表型特征。常用的导入
21、方法:（一）转化（transformation）（二）转染（transfection）（三）感染（infection）,第六节 重组DNA分子的导入和筛选与鉴定,2）转化方法,1.氯化钙法：细菌处于低温、低渗CaCl2溶液中，菌细胞壁通透性增加，菌体膨胀成球形，经短暂热休克后重组DNA易进入2.电穿孔法：除特殊仪器外比氯化钙法更简单，使用时注意电场强度、电脉冲长度、DNA浓度等参数。,特殊处理,受体细胞,细胞膜特性改变,CaCl2处理,受体细菌,50-100mmol/L,CaCl2,感受态细菌,重组体转入细菌,转染 将表达载体导入真核细胞的过程,方法：磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔
22、:操作简单且转染效率高，几乎可转染任何细胞用于瞬时表达或稳定表达。但是它需要专门仪器，确定最佳实验条件。脂质体转染:脂质体（liposomes）是一种人造类脂膜.用脂质体包裹DNA，瞬时表达和稳定表达，操作简单，转染效率高，重复性好，且毒性低、包装容量大，昂贵。显微注射:转染效率高，但需要一定的仪器和操作技巧。主要用于稳定表达,(一）根据重组载体的遗传表型进行筛选 1根据载体的抗药性标记筛选 2根据载体的抗药性标记插入失活选择3根据-半乳糖苷酶显色反应筛选 4根据插入的外源基因性状进行筛选（二）限制性核酸内切酶酶切鉴定（三）核酸分子杂交法（四）PCR法（五）免疫化学检测法(六)DNA序列检测,
23、二.重组体的筛选与鉴定,1.抗药性标记选择,Ampr,Tetr,BamH位点,BamH酶切,BamH酶切,DNA连接酶,目的DNA,重组质粒,大肠杆菌,含Amp平板,含Amp平板,含Tet平板,2.抗药性标记插入失活选择,3根据-半乳糖苷酶显色反应筛选:标志补救,（LacZ基因 N端序列）,插入片段,（LacZ基因失活）,LacZ基因 N端序列,LacZ酶,互补,利用互补原理筛选重组体pUC18,（二）限制性核酸内切酶酶切鉴定,凝胶电泳检测,加样孔,DNA Marker,空质粒,重组质粒,重组质粒酶切,重组质粒的PCR扩增片段,原位杂交,（三）核酸分子杂交法:菌落杂交筛选法,（四）PCR法,某
24、些载体的MCS两侧存在保守的序列，如pGEM系列载体的MCS两侧是T7及SP6启动子序列，可根据此序列设计引物，对提取的重组质粒进行PCR扩增，不但可快速扩增插入的目的片段，而且可以直接进行DNA序列分析。如果已知目的基因的全序列或其两端的序列与全长，可设计合成一对引物，以转化菌的质粒DNA为模板进行PCR扩增，若PCR产物与目的基因的预期长度相一致，那么即可初步筛选出含重组体的阳性菌落。,鸡的肌球蛋白的克隆和检出,(五)免疫化学检测法,(六)DNA序列检测,表达体系的建立：表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化,第七节 克隆基因的表达,标准：选择标志 强启动子 翻译调控序列多接头
25、克隆位点 E.coli表达体系的不足：不宜表达真核基因组DNA；不能加工表达的真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体(inclusion body)；很难表达大量可溶性蛋白。,1.原核表达体系(E.coli表达体系最为常用),大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌,优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点：操作技术难、费时、经济,2.真核表达体系（酵母、昆虫、乳类动物细胞）,表达载体pFASTBACI 的物理图谱,表达载体YEpI PT的物理图谱,真核表达载体大多是穿梭载体,通常包括以下元件：1启动子 包括SV40、CMV、RSV及LTR等。
26、2增强子 3剪接信号4终止信号和PolyA化信号5遗传选择标记 胸苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因（dhfr）、氯霉素乙酰转移酶基因（cat）、新霉素抗性基因（neor）等。新霉素抗性选择系统 新霉素的类似物G418（geneticin）对真核和原核细胞均有毒性。表达载体中携带的neor基因编码的磷酸转移酶能使G418失活，所以当真核细胞中导入了含neor基因的载体后，转染细胞就可以在含有G418的培养基中生长而得以筛选。该选择系统适用于所有真核细胞。,1.目的基因表达产物的检测,蛋白质的PAGE,对照 样品 Marker,2.目的蛋白的分离纯化,分子筛亲和柱离子交换抗原抗体,目的蛋白,
27、重组DNA技术与医学的关系非常密切并前景远大,DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective,一、疾病基因的发现与克隆,疾病基因发现的典型例子:,脆性X综合征:脆性 X 染色体是指在 Xq27 Xq28 带之间的染色体呈细丝样，由于这一细丝样部位易发生断裂。故称脆性部位（fragile site）。其典型的特征为中度到重度的智力障碍，巨睾丸大耳朵、语言障碍、智力低下，智商（IQ）为 0 50。由于女性有两条 X 染色体，多为携带者，其中 2/3 智力正常，1/3 有轻度智力低下。分子遗传学诊断:已基本取代染色体分析,主要检测FMR1 基因CGG重复扩展及甲基化状况。目前有两种方法:多聚酶链反应(PCR)和Southern 印迹,二、生物制药,利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为21世纪的支柱产业。,美国Eli Lilly公司于1982年首先利用重组DNA技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有50多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。,重组DNA医药产品,
