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1、,MicroRNAs in Renal Cell Carcinoma:DiagnosticImplications of Serum miR-1233 Levels血清miR-1233对肾细胞癌诊断意义Lena M.Wulfken1Rudolf MoritzCarsten Ohlmann,Stefan HoldenriederVolker Jung,FrankEdwin HerrmannGisela Walgenbach-Bru nagelBeckerAlexander von RueckerStefan C.Mu ller,肾癌病理类型：1透明细胞癌(clear cell renal car
2、cinoma)为最常见的类型，占肾细胞癌的70%80%。2乳头状癌(papillary carcinoma)占肾细胞癌的10%15%。包括嗜碱性细胞和嗜酸性细胞两个类型。3嫌色细胞癌(chromophobe renal carcinoma)在肾细胞癌中约占5%。肾癌的类型还包括集合管癌（collecting duct carcinoma）和肾癌未分类（renal cell carcinoma,unclassified）。,肾癌无论体积大小，约80%的患者早期可无任何症状，只是在普查和因其他原因作体格检查或B超检查时才被发现其肾脏有占位病变或触摸到腹部包块。有些患者肾脏原发癌灶很小，无泌尿系或肾
3、内症状，却首先表现出远处转移癌的症状。如发现患者腋下、腹部肿块，为找原发病灶才发现为肾癌。所以及时的了解肾癌症状是非常重要的。但是目前还未发现用于诊断肾癌的血清标志物。,已有研究发现在癌细胞中微小RNA表达水平发 生了改变，因此微小RNA有可能作为癌症患者的诊断或预后的标志物，我们的研究旨在分析肾细胞癌患者循环血清中微小RNA的水平变化。,miRNA是一类长约 1924 nt的非编码单链小RNA分子,在动物中,绝大多数miRNA可以通过与靶基因 3 UTR区互补结合,抑制靶基因翻译成蛋白质,进而在细胞、组织或个体水平上影响生物体的生长发育,并参与多种疾病过程。已有研究证实正常组织和肿瘤组织中m
4、iRNA表达明显改变.miRNA在不同肿瘤中具有特定的表达模式.这些特点也使miRNA有可能成为肿瘤诊断的新的生物学标记和治疗药物作用的靶标。,MethodsObjectives：迄今为止，还没有对肾癌患者循环中微小水平进行研究的报道。我们设计了用低密度芯片（TaqMan Low Density Array）技术检测并且用传统的 real-time PCR在一独立组中证实了最有趣的microRNAs，,Participants：我们收集了肾肿瘤患者的血清，包括肾细胞癌和良性肾肿瘤（大嗜酸粒细胞瘤oncocytoma，血管肌脂肪瘤Angiomyolipoma），选取了非恶性疾病的手术患者作为对照
5、组，表，我们收集来自、三所大学泌尿外科至这些患者术前的血液样本。从血液样本中分离出血清。We also analyzed formalin-fixed,paraffin embeddedtissue from six patients stored in the archival files of the Institut furPathologie at the,RNA isolation：提取血清中提取病理组织切片中的,Low Density Arrays：Quantitative Real-Time PCR：,Statistical methods：real-time PCR得出的数据用
6、SDS software v2.4分析，microRNA 水平用RQ Manager计算出,数据分析用DataAssist v2.0，数据统计用SPSS17.软件，microRNA 水平的特异性、灵敏性用分析，,ResultsPhase-1:标志物的发现,载样缓冲液作用：1）增大样品密度，以确保DNA均匀进入样品孔内为了使样品能沉入胶孔，需加入适量的蔗糖、聚蔗糖400或甘油以增加比重2）使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利3）含有指示剂，在电场中能以可预知速率向阳极泳动,指示剂,电泳过程中，常使用一种有颜色的标记物以指示样品的迁移过程。核酸电泳常用的指示剂有两种：溴酚蓝(bromopheno
7、l blue Bb)呈蓝紫色，二甲苯青蓝(xylene cyanol，Xc)呈蓝色。0.5TBE做电泳液时溴酚蓝的泳动率约与长300bp的双链DNA相同，二甲苯氰（蓝）则与4kbp的DNA相同。所以根据分离样品中DNA分子的大小，可以参照指示剂Bb和Xc的迁移情况决定是否停止电泳,3 琼脂糖(Agarose)凝胶的制备,制好的凝胶,水平电泳槽,A 通常将溴化乙锭EB(0.5微克毫升，母液10mg/ml）)渗人到凝胶和电泳缓冲液中。B 也可使凝胶在不加溴化乙锭时进行电泳，电泳结束后再柒DNA。在室温下将凝胶浸埋在含溴化乙锭(0.5微克毫升)的电泳缓冲液或水中45分钟。C 而其他系列染色剂，例如S
8、YBRGreen，GelRed，虽然毒性小，但价格昂贵。,4、琼脂糖凝胶中DNA的染色,溴化乙锭(Ethidium bromide,EB)染色,EB嵌入DNA碱基对之间,会被紫外光激发而放出约600nm的荧光.,EB为致癌物，操作时务必戴上手套!,SYBR-Green 染色,SYBR-Green灵敏度比EB高25100倍SYBR-Green：荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中SYBR-Green的不会发射任何荧光信号SYBR-Green：广泛用于检测琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的RNA或单链DNA。,SYBR-Green I,5、加样,6、凝胶成像,1）以紫外光做为光源.
9、,2）需使用红或黄色滤光片去除光源干扰.,3）操作时须小心EB,务必戴上手套.,估计DNA分子量,1353,1078,872,603,310,281/271,234,194,118,72,0,1,2,3,4,5,6,M,1,2,2,1,DNA粗略定量,20kb,12kb,10kb,6kb,1.2kb,0.8kb,1.将准确称量的粉状琼脂糖加人已定量的电泳缓冲液中；2.在沸水浴中或微波炉中将糊状物加热直至琼脂糖完全溶解；3.将溶液冷却至50-60 oC，再加入溴化乙锭(取自贮存在4 oC避光瓶中500毫克毫升水中的母液)至终浓度为0.5微克毫升；5.将琼脂糖溶液灌注入制胶模具中，并立即插入梳子，
10、使其齿在靠近胶一端的位置形成加样的孔格。6.当凝胶完全凝固后(在室温下30一45分钟)，小心取出梳子，将胶安放在电泳槽中；7.加恰好足量的电泳缓冲液(若需要可加0.5微克毫升的溴化乙锭，使胶埋在溶液中深约l毫米处。,8.加样样品与载样缓冲液混合后，加样品到已浸埋在缓冲液中的凝胶孔格中。载样缓冲液：通常制成6倍的浓缩液，与样品混合后，用微量移液器加样。9.电泳电压：5v/cm，DNA向正极泳动直至溴酚蓝和二甲苯青蓝在凝胶中迁移出适当的距离。10.检测 紫外灯，凝胶成像系统。防止EB污染！,六、聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）,1
11、、概述1)支持介质：聚丙烯酰胺凝胶 单体：丙烯酰胺单体（acrylamide，Acr）交联剂：N，N-甲叉双丙烯酰胺（methylane bisacrylamide，Bis）单体与交联剂在催化剂作用下聚合为凝胶是目前生化实验室最常用的支持介质,CH2=CH,C=O,NH2,CH2=CH,C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH,-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH-C=O C=O NH2 NH CH2 NH C=O-CH2-CH-CH2-CH-nCH2-CH-C=O C=O NH2 NH2,丙烯酰胺（Acr）,N,N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）,聚丙烯酰胺,2、聚丙烯酰胺凝胶电泳
12、分类,1）根据凝胶系统的均匀性，可分为连续性和不连续性聚丙烯酰胺凝胶电泳。连续性：整个电泳系统中所用的凝胶网孔、缓冲液及pH都是相同的，电泳时沿电泳方向的电势梯度均匀分布，简单易行；不连续性：系统中采用了两种或两种以上的缓冲液、pH和凝胶孔径，电泳过程中形成的电势梯度不均匀，能将较稀的样品浓缩成密集的区带，从而提高分辨率。,2）根据凝胶溶液和电泳缓冲液对样品构象的影响，可分为变性电泳和非变性电泳两类。非变性：用于双链DNA片段的分离和纯化、有功能蛋白的分离与纯化。,变性：凝胶在尿素等抑制核酸碱基配对的试剂或蛋白变性剂SDS（如SDS-PAGE电泳)的存在下发生聚合。用途包括单链DNA的分离，如
13、放射性DNA探针的分离、DNA测序反应产物的分析。SDS-PAGE用于蛋白质分子量的测定。,3）根据在样品缓冲系统中是否加入还原剂-巯基乙醇或二硫苏糖醇，可将聚丙烯酰胺凝胶电泳分为还原电泳和非还原电泳。在前者中蛋白质的二硫键将被破坏，而在后者中则可以保留。如果蛋白质的二聚体或寡聚体是由链间二硫键来维系的，那么用该系统还可以区分目的蛋白的亚基聚合形式。,4）根据凝胶形状的不同还可以将聚丙烯酰胺凝胶电泳分为圆盘电泳和平板电泳。前者指在圆形玻璃管内制胶，电泳后形成的区带为圆盘状；而后者是指凝胶的形状为平板状，有水平和垂直两种。平板电泳可同时进行多个样品的比较，而且还可作双相电泳，分辨率更高。,3、聚
14、丙烯酰胺凝胶较之琼脂糖凝胶有如下优点,（1）在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好（2）分辨率极高，可分开长度仅相差0.1的DNA分子，即1000bp中相差1bp（3）比琼脂糖凝胶的载样量大，在1cm 1mm的胶孔中能上样到10g的DNA样品，而分辨率并无明显下降（4）回收的DNA样品纯度极高，可用于要求非常严格的实验，如转基因动物实验，引物合成后的分离纯化（5）经常被用作分离蛋白质，且分离效果好。,4、PAGE 的 聚 合,需要催化剂氧化还原系统作用，使Acr单体带有游离基，从而与Bis进行聚合。,（1）化学聚合：AP-TEMED系统,过硫酸胺(NH4)2S2O8（Ammonium pe
15、rsulfate，AP）作为催化剂，四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂。,AP在水溶液中能产生游离基SO42-，使丙烯酰胺单体的双键打开，活化形成自由基丙烯酰胺，然后游离Acr和Bis作用就能聚合形成凝胶。TEMED的游离碱基能促进AP形成SO42-。注意：TEMED量多少都会影响催化作用，须在碱性条件下聚合 分子氧存在，聚合不完全，须去除分子氧，隔绝氧 升高温度能提高聚合，降低温度能延迟聚合,（2）光聚合：核黄素-TEMED系统,核黄素（riboflavin）在光照下（可见光或紫外光）分解，其黄素部分被还原成无色型，但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游离基的黄素，其也能使Acr和Bis聚合形
16、成凝胶。注意：分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚合，凝胶的孔径受光照强度与时间的影响，导致孔径大小不同，从而影响蛋白质的分离。,聚合影响因素,大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解的空气。在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。低温、低pH都会减慢聚合反应速度。有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制聚合反应。,凝胶的物理性质如筛孔大小、机械强度、弹性、透明度都取决于凝胶总浓度（T）和Acr与Bis两者之比。凝胶总浓度（T）和交联度（C）的计算公式分别为：,5、PAGE的浓度与孔径的关系,Acr/Bis：2
17、040 完全透明且有弹性；10 很脆，易碎，不透明；100 糊状不成形，易破碎。,要制备透明而有弹性的凝胶，Acr/Bis要控制在30左右。T在25时，Acr/Bis 20左右；T在510时，Acr/Bis 40左右；T在1520时，Acr/Bis=125200左右。T在325的范围内，凝胶易发生聚合。,标准胶：在总浓度为7.5%的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。对于一个未知样品，常用7.5%的标准胶或4%-10%的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。,6、分离效应,其分离效应包括：浓缩效应(不连续系统中)电荷效应分子筛效应,不连续垂直柱状聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应,
18、系统的不连续性表现在以下方面：1）凝胶由上、下两层凝胶组成上层为大孔径的浓缩胶下层为小孔径的分离胶 2）缓冲液离子组成、各层凝胶的pH不同电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。3）在电场中形成不连续的电位梯度,（1）凝胶孔径不连续性：在电场作用下，颗粒在大孔胶中泳动遇到的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，颗粒泳动受到的阻力大，移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带,HCl在溶液中解离出Cl-，在电场中迁移率快前导离子或快离子。甘氨酸在pH8.3的电
19、极缓冲液解离出NH2CH2COO-，在电场中迁移率很慢尾随离子或慢离子。电泳开始时，在电流的作用下，浓缩胶中Cl-有效泳动率超过蛋白质，很快泳动到最前面，蛋白质紧随于其后，而NH2CH2COO-在最后面。,（2）缓冲体系离子成分及pH值的不连续性：,快离子向前移动，而在快离子原来停留的那部分区域则形成了低离子浓度区，即低导区。低导区有较高的电势梯度，迫使蛋白质离子与慢离子在此区域加速前进。由于蛋白质样品的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，因此也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩形成一个狭小的中间层.,低导区,电荷效应,当样品进入分离胶后，由于每种蛋白质所带的电荷多少不同，因而迁移率也不同。电荷
20、多的，分子小的泳动速度快，反之，则慢。于是，各种蛋白质在凝胶中得以分离。,分子筛效应,分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，此即分子筛效应。颗粒小，形状为圆球形的样品分子，通过凝胶孔洞时受到的阻力小，移动较快；反之，颗粒大，形状不规则的样品分子，通过凝胶的阻力较大，移动慢。,制胶玻璃板,SDS（十二万及磺酸钠)是阴离子表面活性剂，与蛋白质结合形成SDS-蛋白复合物，蛋白质分子即带大量的负电荷，并远远超过原来所带的电荷，使天然蛋白质分子之间的电荷差别降低，甚至可以忽略 同时蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋向一致，因此，排除了蛋白质的
21、电荷和结构差异，SDS-蛋白质复合物在电泳时的泳动差异就由蛋白质的分子量所决定。,（电荷效应）,7、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),蛋白质样品用SDS处理后亚基的解聚和分子形状的改变,SDS-PAGE主要用途：分离蛋白质 蛋白亚基分子质量的测定,SDS-PAGE电泳过程（一）试剂配置 1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 为29:1）：称取丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1g，用水溶解并稀释至100ml，贮棕色瓶中于4保存，可用一个月。（Acr和Bis有神经毒性！）2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：取1mol/L HCL溶液48ml、三
22、羟甲基甲烷（Tris）36.6g，加水至80ml使其溶解，调pH至8.8，然后用水稀释至100ml，置棕色瓶中，4贮存。,3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：取1mol/L HCL溶液48ml，Tris5.98g，加水至80ml，调pH6.8，用水稀释至100ml，置棕色瓶中，4贮存。4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液：称取Tris 6g、甘氨酸28.8g，加水850ml，调pH至8.3，加水到1000ml，4贮存。用时可做10倍稀释。5、10%过硫酸铵（AP）6、10%SDS（十二烷基磺酸钠）称取 SDS 10g，加水100ml使其溶解。（戴好口罩）,7、四甲基乙二胺（TEME
23、D）8、上样缓冲液：取1.0mol/L pH6.8Tris-HCl缓冲液6.25ml，蔗糖10g，SDS 2.3g，1g/L溴酚蓝10ml，加蒸馏水溶解，混合至100ml。9、考马斯亮蓝染色试剂 考马斯亮蓝R250染色液：浓度为2.5g/L，用甲醇醋酸蒸馏水=515的溶液配制（V/V）。10、脱色液：取冰醋酸7.5ml、甲醇5ml，加蒸馏水至100ml。11、样品,（二）灌胶 1、先将胶板（590mm）封好，将配制好的分离胶液按配方灌注入胶板内，约70mm高度（掌握分离胶的高度），在凝胶表面轻轻加一层正丁醇液（约34mm）。用于隔绝空气，使胶面平整。室温下静置约3060min。观察胶和正丁醇之
24、间的界面，判断胶是否凝固。要在确认分离胶彻底凝固后才开始配制浓缩胶。,2、分离胶凝固好后，倒掉覆盖在分离胶表面的正丁醇，并用去离子水冲洗一次，倒置吸净残留的水。将配制好的浓缩胶液灌注入胶板内（约15mm），插入合适的梳齿，室温下静置约3060min。观察胶界面，判断胶是否凝固，准备加样。,（三）样品预处理和加样 1、取蛋白（如血清）0.1ml、适量上样缓冲液，混匀，在沸水中煮沸5min。2、将胶板放入垂直电泳槽中，夹紧，将Tris-甘氨酸电泳缓冲液加入上、下槽中，电泳缓冲液要盖过胶板口，然后用微量加样器（或注射器）将适量样品加到加样孔内。,（四）电泳 上槽接负极，下槽接正极，先调电流为18mA
25、/浓缩胶，开始电泳，当指示染料进入分离胶后，将电压调至20mA/分离胶，继续电泳直至染料抵达距分离胶下端约1cm处，停止电泳，断开电源。电泳时间约1.01.5h。,（五）考马斯亮蓝染色：电泳结束后，取出电泳胶板。用剥胶器轻轻撬起薄板的一头，一边用水轻冲，一边拿掉薄板，用细小水流推胶至至大培养皿中。然后将凝胶板浸入考马斯亮蓝染色液中0.5-1h，再用脱色液脱色12天，至背景无色为止。区带可作定性或定量分析。,（六）分子量测定：精确量取并记录染色后、各标志蛋白质和各待测蛋白质区带的迁移率。通过作图求出目标蛋白分子量。,（七）常用的分子量标准蛋白,凝胶浓度与蛋白分离范围,（八）蛋白质电泳结果染色方法
26、,1）考马斯亮蓝R250(coomassie brilliant blue R250，简称CBB R250)2）考马斯亮蓝G250(简称CBB G250)3）银染色法考马斯亮蓝染色方法最为普遍，灵敏度较高，操作方便银染灵敏度很高，操作繁琐,考马斯亮蓝R250（三苯基甲烷）,考马斯亮蓝G250（二甲花青亮蓝）,1）考马斯亮蓝R250(三苯基甲烷，呈红蓝色)特点 该染料每分子含有2个SO3H基团，偏酸性，结合在蛋白质的碱性基团上，且染料的苯环与芳香族氨基酸结合，因此多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色。它与蛋白质结合虽然比较缓慢，但是染料可以穿透凝胶，染胶效果好，染色后为红蓝色，且可以被洗脱
27、下去，所以可以用来对电泳条带染色。,染色方法：1、在90ml甲醇：水（1:1，v/v)和10ml冰乙酸的混合液中溶解0.25g考马斯亮蓝R250，用滤纸过滤染液以除去颗粒状物质。2、用至少5倍体积的染液浸泡凝胶，放在平缓摇动的平台上于室温染色1h以上。3、回收染液，将凝胶浸泡于不加染料的甲醇-乙酸溶液中，平缓摇动4-8h进行脱色，更换脱色液三四次。,3）考马斯亮蓝G250(二甲花青亮蓝，呈蓝绿色)特点 考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；染色灵敏度不如R250,但与蛋白质的结合反应十分迅速，当与蛋白质结合后变为青色，结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与
28、蛋白质含量在一定范围内成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。G250也可染胶，但染色过程慢且染色后背景高，脱色困难。,注意：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此G250用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用r-球蛋白质为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。,4）银染色法 此法较CBB R250灵敏100-1000倍，能检测蛋白与多肽，采用银盐对电泳条带进行染色，一类使用银铵溶液；另一类使用硝酸盐。,1、搪瓷盘中倒入2000ml左右70%乙醇，把胶做好标记卸入乙醇中，摇床上固定15min。,3、190ml蒸馏水中加入3.6%的NaOH4.2ml、20%AgNO33
29、.6ml、氨水2ml混匀配成染色液。倒入染色液，染色30min。,2、回收乙醇（可重复用3-5次），蒸馏水洗2遍，每遍2-3min，尽可能把水倒净。,4、倒掉染色液，蒸馏水洗3遍，每遍2-3min，尽可能把水倒净。,5、200ml蒸馏水中加入1%柠檬酸钠1ml，甲醛100ul混匀配成显色液。倒入显色液显色至清晰。,6、倒掉显色液，加蒸馏水停显，并洗2-3遍。,分子杂交（molecular hybridization）(一)种类 1.按其分子种类划分 1）DNA杂交探针为DNA或RNA 2）RNA杂交探针为DNA或cDNA 3）蛋白质免疫分析探针为抗体,核酸分子杂交技术：具有一定同源性的两条互补
30、的核酸单链在一定的条件下(适宜的温度及离子强度等)可按碱基互补原则退火形成双链，具有高度特异性。,待测核酸序列及探针1）待测核酸序列：基因片段，基因组DNA和细胞总RNA。2）探针：用于检测的已知核酸片段称之为探针(probe),探针：为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于随后的检测。常用的标记物是放射性同位素，近年来也发展了一些非放射性标记物如地高辛、生物素等。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。,地高辛(Digoxigenin,DIG)一种从洋地黄类植物（毛地黄和毛花毛地黄）中提取的类固醇（Steroid）物质，由于洋地黄植物的花和叶片在自然界中的唯一来源，因此抗DIG的抗体不
31、会与其他的生物物质结合，从而可以满足特异性标记的需要,生物素-亲合素系统(biotin-avidin system，BAS)生物素可以与亲和素、链霉亲和素结合非常紧密,比抗原抗体之间亲和力高几百万倍。所以，生物素标记蛋白，可以用链霉亲和素标记的荧光或者二抗检测。,蛋白质免疫分析探针为抗体,2.按样品制备过程划分 1）原位杂交(in situ hybridization)i.原位菌落杂交：DNA探针与菌落DNA的杂交。ii.原位噬菌斑杂交：DNA探针与噬菌斑DNA的杂交。iii.原位细胞杂交：cDNA与细胞中的RNA杂交 iv.原位组织块杂交：DNA探针与染色体DNA杂交。以上都是原位裂解细胞，
32、不需要分离DNA，RNA或蛋白质样品，可同时处理大量样品，常用于目的基因的筛选或检测某类细胞或组织中是否存在某一特定的DNA、RNA或蛋白质序列。,2）斑点杂交(dot hybridization)先分离DNA，RNA或蛋白质，然后将样品液直接点在固体基质上进行杂交，不能测定分子量大小。,3）转移杂交或印迹杂交(blotting hybridization)膜上印迹杂交是指将待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。,最常用的几种固相支持物,硝酸纤维素滤膜(Nitrocellulose filter,NCF),可与
33、三类大分子结合，但是不能结合小分子DNA，RNA和蛋白质（20,000）,尼龙膜尼龙膜是目前较理想的一种核酸固相支持物它有多种类型，除网眼大小不一样外，有的尼龙膜未经特殊处理，有些则是经过了正电荷基团的修饰，这种修饰的尼龙膜结合核酸的能力更强。,(三)分子杂交的一般程序 1)DNA和RNA的杂交 制备DNA或RNA样品与固定基质结合80真空固定预杂交加入标记探针杂交洗涤放射自显影或显色反应。2）蛋白质的免疫分析 制备蛋白质样品与固定基质结合常温空气中固定封闭剂封闭 一抗反应洗涤二抗-酶偶联物反应洗涤显色反应（EIA）或 一抗放射标记物洗涤放射自显影（RIA）,（四）常见几种核酸分子杂交技术 1
34、）Southern blotting：1975年由E.Southern首先设计出来的一种用于检测DNA样品中特异序列及其位置的技术。,2)Western blotting杂交,杂交对象是蛋白质，是通过抗原抗体的免疫反应，从混合样品中检测出特异的目的蛋白。,先将蛋白质混合物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳展开，然后将凝胶中的蛋白质条带转移到固相膜上。2 用待测目标蛋白的抗体（一抗）与固相膜上的蛋白质相互作用。3 经辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的第二抗与第一抗反应后的固相膜作用，如果一抗能与目标蛋白结合，则二抗可以和第一抗结合，那么二抗连接的标记酶与显色底物反应呈现颜色，从而可以确定固相膜上目标蛋白的位置
35、及分子质量大小。,Western Blot一般流程,蛋白样品的制备（定量）SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳,转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色,转膜,半干法将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转1030min。湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。,转膜后检测,丽春红S染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。,封闭,脱脂奶粉（5）BSAWestern Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）,一抗、二抗孵育,把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。3
36、7，1小时，4 过夜。倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，37,1小时，4 过夜。倒掉二抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。,二抗与底物反应显色,辣根过氧化物酶法（HRP）碱性磷酸酶法（AP）化学发光法（ECL)ECL是指酶催化底物发荧光，荧光可使X光片曝光,检测的下限可达到pg水平),三、DNA核苷酸序列的测序,1 Sanger的双脱氧终止法,2 Maxam-Gilbert 化学修饰法,3 DNA序列的自动化分析,测序技术的建立 DNA测序即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。1963年，Sang
37、er第一次完成胰岛素51个氨基酸的序列测定 70年代后期，Sanger和Maxam-Gilbert等人又建立了核酸序列测定的方法，Sanger双脱氧链终止法和Maxam-Gilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。,脱氧核苷酸的连接,1、Sanger的双脱氧终止法,脱氧核苷酸的连接,1,2,3,4,5,X,双脱氧核苷酸,?,在PCR时加入扩增终止剂，比如ddATP,ddTTP,ddCTP,ddGTP（相应于4种碱基）双脱氧核苷酸的两个作用：可以当作正常碱基参与复制一旦链
38、入DNA中，其后就不能再继续连接电泳谁终止，碱基就是谁此方法获1974年的Nobel奖,ATGCGGTACCAT,5,3,测序模板,5,四套反应体系,1-dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddATP2-dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddCTP3-dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddGTP4-dATP,dCTP,dGTP,dTTP.+ddTTP,TA,5,TACGCCA,5,TACGCCATGGTA,TAC,TACGC,TACGCC,第一套反应,第二套反应,ATGGTACCGCAT,TACCATGGCGTA,模板互补序列,待测序列,Sanger法测序产物的平均链长取
39、决于ddNTP与dNTP的比例，比例高时，得到较短的产物,直读碱基序列,手工测序结果,2、Maxam-Gilbert化学裂解法,化学裂解法是Maxam和Gilbert等人1977年创建的，用来测定DNA序列。化学法是用化学试剂在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE胶电泳后，可以直接读出DNA的顺序。,化学裂解法测序的原理,1、将标记DNA分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系2、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物3、电泳分离，得到互相错落的梯形图谱
40、，即可读出DNA序列,碱基特异性化学切割反应：硫酸二甲酯（DMS）：使DNA分子中鸟嘌呤（G）上的N7原子甲基化。肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶环断裂；但高盐条件下，只C断裂，而不与T反应。哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。,G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落。G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和G嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落。T+C反应：肼（低盐）C反应：肼（高盐）测定DNA长度250bp。,化学裂解法测序的原理示意图,原理 基于 Sanger 双脱氧链终
41、止法的原理，只不过用四种不同的荧光染料分别标记 ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP，延伸中的 DNA 互补链分别终止于不同荧光标记的 ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP。这四种荧光染料在激光激发下发出不同波长的荧光，因而每一种荧光代表一种碱基。,3、DNA序列的自动化分析,荧光检测探头,电泳，看谁跑得快,除核苷酸序列文本文件外，全自动测序仪还提供曲线图。,四 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）1、基本原理：基于DNA的半保留复制，两条链都可以作为模板。在体内，DNA复制是周期性的，所以基因扩增的数量有限；PCR技术在体外利用人工
42、合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合适的底物和因子，通过对温度的控制，使DNA不断位于变性、复性和合成的循环中，达到扩增DNA的目的。,PCR概念的提出,1983，Kary Mullis Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，不耐高温。,thermus aquaticus,Taq DNA多聚酶的发现,1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。热稳定的聚合酶对简化PCR过程非常重要。,此酶具有以下特点：耐高温，在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。大大提
43、高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。在1989年，Science将PCR中的Taq DNA聚合酶命名为当年的风云分子。,2、PCR技术的过程,反复进行三步骤的循环过程：热变性退火引物延伸1）热变性：基因组DNA在95度下加热5分，双螺旋结构被热变性解链为两股单链。2）退火：将反应混合物降温至55摄氏度，引物与上述单链DNA上互补的序列杂交在一起，即退火，形成模板引物复合物。,3）引物延伸：在DNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，从引物3端开始，沿着53的方向，按照模板链的序列，合成一条新DNA链，其序列与模板序列互补。经上述变性-退火-引物延伸这一循环，双链DNA拷贝数
44、增加一倍。进行n次循环，拷贝数将增加2的n次方倍，如进行2530个循环，拷贝数即扩增上百万倍。,模板：单链或双链DNA 引物：16-30 bp合成的寡核苷酸 DNA聚合酶：耐热的DNA聚合酶 底物：四种脱氧三磷酸核苷酸（dNTP:dATP、dTTP、dCTP、dGTP)Mg2+：DNA聚合酶的激活剂,PCR基本要素,9496 30-3 预变性（使模板DNA充分变性）94 30 变性50-60 30-1 复性（使引物与模板充分退火）72 n(按1扩增1kb计算）延伸 72 3-7 总的延伸（使产物延伸完整）4-10 保存,PCR反应程序,3、PCR过程中注意事项：1）复性和延伸温度 复性的温度是
45、 PCR 扩增是否顺利的关键因素，通常在 50-60 之间。具体的温度主要由引物的 Tm 值决定（低于Tm 值2-3）。延伸温度绝大多数设定为 72。如果复性的温度很高，可以将延伸温度和复性温度设置成同一温度，变成二步法 PCR。,2）反应时间 变性一般使用 30 秒钟，如果模板的 G+C 含量较高，或直接用细胞做模板，变性时间可适当延长。复性时间有 30 秒种一般是足够的。延伸时间由扩增产物的大小决定，一般采用 1kb 用 1 分钟来保证充足的时间。,3）循环次数 循环数通常为 2535 次。平台效应（plateau effect）：PCR 扩增过程后期出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的
46、现象。原因：底物和引物的浓度已经降低，dNTP 和 DNA 聚合酶的稳定性或活性降低，产生的焦磷酸会出现末端产物抑制作用，非特异性产物或引物的二聚体出现非特异性竞争作用，扩增产物自身复性，高浓度扩增产物变性不彻底。,4）引物设计的一般原则,长度：至少 16bp，通常为 18-30bp。更短的引物一般会降低扩增的特异性，但会提高扩增的有效性。引物的解链温度：两个引物之间的 Tm 值差异最好在 2-5。对于小于 20 个碱基的引物其 Tm 值可用简易公式计算，即 Tm=4（G+C）+2（A+T）。对于 20-70 个核苷酸的引物可用 以下公式计算。Tm=81.5+16.6（1gK+）+0.41（G
47、+C）%-（675/N）N 表示引物的核苷酸数目，K+表示单价离子即钾离子的浓度 避免引物内部或引物之间形成引物二聚体（特别是引物的 3端）。G+C 含量：尽量控制在 40%至 60%之间，4 种碱基的分布应 尽可能均匀。尽量避免嘌呤或嘧啶的连续排列，以及 T 在 3 末 端的重复排列。引物的 3 末端最好是 G 或 C，但不要 GC 连排。6 限制性酶切位点之前加保护碱基,总体积 50-100 l 缓冲液 dNTP（底物）引物 模板 DNA聚合酶,4、反应体系,注意：最后加入 DNA 聚合酶，防止非特异性扩增,缓冲液：提供合适的pH值和DNA聚合酶的激活剂10mM TrisHCl（），1.5
48、mM MgCl2，50mM K+dNTP（底物）：等摩尔浓度的 4 种 dNTP，终浓度一般为 200mM（即饱和浓度），dNTP 的浓度会影响扩增的产量、特异性和忠实性。引物：1M/L,模板：单、双链DNA均可。模板的数量会直接影响扩增的效果。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。DNA聚合酶：最常用的是Taq DNA聚合酶，最适反应温度75。Pfu DNA聚合酶：是目前使用最广泛的具有 3-5 外切活性的 PCR 酶，目前为止错配率最低的高温DNA聚合酶。酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,5、PCR产物的克隆,1添加限制性酶切位点 1）通过引物设计引入酶切位点 2）酶切位点
49、应加在引物的5端 3）添加的酶切位点在扩增的DNA片断内部是否存在 4）由于添加的酶切位点位于DNA片断的末端，因此必须考虑末端长度对切割的影响。,E H,E H,2T/A 克隆1）PCR产物：主要适用于Taq DNA聚合酶扩增产物。Taq DNA聚合酶具有末端转移酶的活性，可在DNA片断的3末端添加一个核苷酸，通常为A。,2）T-载体,pMD18-TVector是一种高效克隆PCR产物的专用载体。本载体由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3端添加“T”而成。载体特点：将普通的克
50、隆载体切成线状，并使之3末端含有一个突出碱基T.可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。,6、PCR技术的特点,a 高度的灵敏性,b 特异性,c 操作简便易行,d 用途广泛,生命学科医学工程遗传工程疾病诊断法医学考古学,1)长片段DNA的PCR扩增 常规PCR长度为2kb以下，长片段PCR扩增存在的问题；（1）随着扩增片段的延长，扩增效率降低；（2）高温会损坏模板DNA和PCR产物；（3）长片段DNA分子的变性比短片段困难，DNA聚合酶与模板DNA的趋近和接合变得困难。,7、PCR的类型,改进方法：采用混合DNA聚合酶 主体使用扩增效率高，延伸能力强的Taq DNA聚合酶；少量使用具有35外切
