动物微生物学实验.ppt

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1、,动物微生物学实验,课程安排本实验课程共20学时，进行以下10个实验：实验一 显微镜油浸系的使用及细菌基本形态观察实验二 细菌抹片的制备及染色实验三 培养基的制备实验四 细菌的分离培养及培养性状的观察实验五 真菌的分离培养及形态观察实验六 细菌的生化试验实验七 动物试验法实验八 凝集试验实验九 沉淀反应实验十 主要病原菌的认识,实验一显微镜油浸系的使用及细菌基本形态观察,一.目的要求1正确掌握使用及护理显微镜的方法，特别是油浸系的使用及护理。2认识细菌的基本形态和构造。,二、油浸系的原理使用原理是：由于香柏油与玻璃的折光率相似（香柏油为1.515，玻璃为1.52）。镜检时，滴加香柏油的作用是使

2、光源尽可能多的进入物镜中，避免光线通过折光率低的空气（折光率为1.0）而散失，因而能提高物镜的分辨率，使物像明亮清晰。,三 实验器材普通光学显微镜、标准细菌片、香泊油、擦镜纸等 四 操作步骤(一)、普通光学显微镜的构造普通光学显微镜包括机械部分和光学部分两部分。机械部分包括镜座、镜臂、镜筒、载物台、物镜转换器、粗调节螺旋、细调节螺旋、标本夹等。光学部分包括接目镜、接物镜、反光镜、光圈（虹采）、聚光镜（集光器）等（图1-1）。,（二）、使用方法镜检者需姿势端正，一般用左眼观察，右眼用于绘图和记录，两眼同时睁开，以减少疲劳。对光 将光圈完全开放，升高聚光镜与载物台同高，置标本片于载物台上，在低倍镜

3、下对光，用手转动反光镜以调节之，至视野最亮时为止。光线强弱可通过放大或缩小光圈、升降聚光镜、旋转反光镜调节之。,加油 将标本放在载物台上，染色部位正对集光器的中央，用标本夹固定好，滴加香柏油1滴，用油浸镜检查，使油镜头浸入油滴中，几乎与标本面接触为度，然后由接目镜注视镜内，同时慢慢转动粗调节螺旋提起镜筒（绝对不能下降镜筒！）至能模糊看到物像时，再转动细螺旋（细螺旋转动一般不超过一周），直至物像清晰为止。,(四)、细菌正常形态的观察练习显微镜油浸系的使用，观察已制好的细菌染色标本，如葡萄球菌、链球菌、魏氏梭菌、大肠杆菌、枯草杆菌、炭疽杆菌及细菌的荚膜、芽胞和鞭毛，并进行绘图。,大肠杆菌 炭疽杆菌

4、,链球菌,葡萄球菌,五.显微镜的使用操作及注意事项1.从镜箱内取显微镜时，应以右手持镜臂以水平方向慢慢抽出，不得碰镜，再以左手托镜座，保持镜体平行，以防反光镜及接目镜滑落。2.显微镜各镜头绝对不可用手指拭抹，应用擦镜纸或用绸布轻拭之。油镜用过后，立即用擦镜纸拭之，若油渍已干，则需用擦镜纸蘸二甲苯拭之，然后用干燥镜纸轻拭之。镜体可用软布轻拭，以保持清洁。,3.用过后应将显微镜各部复位，尤其注意不要让接物镜对集光器，同时把集光器下降，以免发生碰撞，然后置镜箱内锁好。4.注意防潮，勿靠近热源及有腐蚀性的化学药品。显微镜各零件不要任意拆卸，尤其是光学部分，以免损坏。,六.思考题显微镜油浸系的使用原理?

5、,实验二 细菌抹片的制备及染色,一.目的要求1掌握细菌抹片的制备方法和几种常用的染色方法。2认识革兰氏染色的反应特性。,二.革兰氏染色法原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。,该染色法所以能将细菌分为G+菌和G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色

6、。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。,三 实验器材1、活材料：培养12-16h的大肠杆菌（Bacillus thuringiensis）及链球菌.2、染色液和试剂：结晶紫、革兰氏碘液、95%酒精、碱性复红、二甲苯、香柏油3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜,四.操作步骤染色是细菌学上一个重要而基本的技术。由于细菌个体微小，且半透明，如不经染色往往不易识别。因此，借助于染色法可使细菌着色，与背景形成鲜明的对比，便于在显微镜下进行观察。也可根据不同的染色反应，作为鉴别细菌的一种

7、依据。,(一)、载玻片处理载玻片应清晰透明，清洁而无油渍，滴上水后，能均匀展开，附着性好，如有残余油渍，可按下列方法处理 1.滴上95酒精23滴，用清洁纱布擦拭,然后以钟摆速度通过酒精灯焰34次。2.若上法仍未能除去油渍，可再滴上12滴冰醋酸，用纱布擦净，再在酒精灯火焰上轻轻拖过。,(二)、涂片方法1.菌落涂片方法 2.菌液涂片法 3.血液涂片方法 4.组织涂片方法(三)干燥(四)固定1.火焰固定 2.化学固定,(五)染色 1.单染色法 美蓝染色法 2.复染色法 a.革兰氏染色法 草酸铵结晶紫染色液-革兰氏碘液-95酒精-10倍稀释石炭酸复红液 b.抗酸染色法c.瑞特氏染色法d.姬姆萨氏染色法

8、e.荚膜染色法f.芽胞染色法g.鞭毛染色法,革兰氏染色,五 注意事项1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。2.染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。,六 实验结果革兰氏阳性菌染为兰紫色,革兰氏阴性菌为红色,七 实验作业给出链球菌和大肠杆菌的形态图，并注

9、明两菌的革兰氏染色的反应性。,实验三 培养基的制备,一目的要求1.掌握一般培养基制备的原则和要求。2.熟悉一般培养基制备的过程。,二.原理牛肉膏蛋白胨培养基是培养腐生性细菌的常规培养基，也是微生物实验室中常备培养基，为天然培养基。它含有牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、其中牛肉膏为微生物提供碳源和能源，磷酸盐，蛋白胨主要提供氮源、NaCl提供无机盐。牛肉膏 5.0g 食盐 5.0g pH 7.2-7.4 蛋白胨10.0g 自来水1000mL(加入1.5%-1.8%琼脂即成固体培养基),三 仪器材料 微波炉、高压灭菌器、玻璃器皿、PH试纸、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、氯化钠、氢氧化钠。,四 操作步骤一)、培养基

10、的制备原则和要求1.药品纯净,称量准确。2.所用器皿须洁净3.准确测定调节pH值.4.过滤培养基5.严格控制灭菌时间和温度.二)、培养基制备过程及方法称量-加热溶化-过滤-PH滴定-分装-灭菌,1)肉浸液肉汤（普通肉汤）的制法蛋白胨 10g，氯化钠 5g，磷酸氢二钾 2g。牛肉粉或牛肉膏3g,水1000ml.PH7.47.6 121.3度15磅高压15钟.2)营养琼脂培养基（普通琼脂）的制法 普通肉汤 1000ml 琼脂粉15g PH7.47.6121.3度15磅高压15钟.3)半固体培养基的制法4）鲜血琼脂的制法,PH的滴定:1.酸度计法2.PH比色计法:,五 注意事项1.称量准确 2.加热

11、搅拌3.补足水分 4.容器适合5.高压彻底 6.空白培养,六 作业与思考题（1）为什么微生物实验室所用的移液管口或滴管口的上端均需塞上一小段棉茬再用报纸包起来，经高压蒸汽灭菌后才能使用?（2）配制培养基时为什么要调节pH?（3）制作平板培养基的注意事项是什么?（4）培养基配好后，为什么必须马上进行高压蒸汽灭菌?如不能及时灭菌时，应将培养基暂时放置何处?,实验四 细菌的分离培养及培养性 状的观察,一.目的要求1学习、掌握需氧菌和厌氧菌分离培养的基本要领和技术。2了解细菌的菌落形态及其在各种培养基上的培养性状。3了解培养性状对细菌鉴别的重要意义。4掌握钓菌、纯培养及移植技术。,二、基本原理将细菌经

12、过适度的稀释,接种于培养基上,会出现典型的培养特征,所谓培养特征是指微生物在培养基上所表现的群体形态和生长情况。细菌培养特征的常规检验包括平皿培养基上的菌落特征；斜面培养基上的菌苔特征；液体培养时的生长特征。菌落是指个体微生物在固体培养基上生长繁殖成的肉眼可见的群落。在表面生长的菌落叫表面菌落；在培养基中生长的菌落叫埋藏菌落。在一定培养条件下，不同的微生物形成的菌落其性状是不相同的，它是鉴别各种微生物的依据之一。,三、器具材料1.器材：接种环、酒精灯、火柴、无菌培养皿、无菌吸管(1rnL)。2.培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基及其培养液，试管斜面培养基，三角瓶装100m1无菌生理盐水(内放玻璃珠

13、)。3.菌种：大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、钾细菌、金黄色葡萄球菌斜面菌种各1支。,四.操作步骤一)需氧性细菌分离培养法1.平板划线分离法,2.倾注平皿分离法 3.芽胞需氧菌分离培养法 4利用化学药品的分离培养法5.实验动物分离法6.琼脂斜面分离法 7.琼脂平板涂布分离法 8.营养肉汤分离法 二)、厌氧性细菌分离培养法1.生物学方法 厌氧肉肝汤法,2.化学方法 a.焦性没食子酸法 b.连二亚硫酸钠 c.硫乙醇酸钠法 3.物理学方法 a.厌氧罐法 b.真空干燥器法 c.加热密封法 d.高层琼脂柱法,三)、兼性厌氧菌的分离培养方法(二氧化碳培养法)四)、细菌的钓菌、纯培养和移植,五)、穿刺培养,六

14、)、细菌培养性状的检查,五 注意事项注意：细菌的培养特征随培养基成分，培养时间和温度的变化可能发生变化。所以利用培养特征识别细菌时务必考虑这些因素。,六 实验结果 观察如下图,琼脂斜面直线接种培养的菌落表现 琼脂柱穿刺培养,七 思考题1.将观察结果记述下来。2.了解细菌的培养特征有什么用途?观察时应注意哪些问题?,实验五 真菌的分离培养及形态观察,一.目的要求1掌握真菌分离培养方法。2认识真菌菌落的特征，比较与细菌菌落有何不同。3了解真菌载片培养法。4掌握观察真菌的基本方法，并观察其形态特征。,二 基本原理霉菌的营养体是菌丝体，分为基内菌丝和气生菌丝。生长到一定阶段时，气生菌丝中又可分化出繁殖

15、菌丝。不同的霉菌其繁殖菌丝可以形成不同的孢子或子实体。霉菌菌丝有无横隔膜，其营养菌丝有无假根、足细胞等特殊形态的分化，其繁殖菌丝形成的孢子着生的部位和排列情况，以及是否形成有性孢子等，是鉴别霉菌的主要依据，镜检时应仔细注意观察。霉菌菌丝生长比较松散，其菌落多呈大而疏松的绒毛状或棉絮状等特征。,酵母菌为不运动的单细胞真核微生物，细胞呈圆形、卵圆形或假丝状等形态，菌体较细菌大。繁殖方式也较复杂，分为无性繁殖和有性繁殖。形成的菌落与细菌菌落相似，但比细菌菌落大而且较丰厚。菌落呈圆形、湿润具有粘性、不透明、表面光滑、有油脂状光泽，多数白色或乳白色，少数红色。与培养基结合不紧，易被挑取。当培养时间较长时

16、，菌落颜色变暗，有特殊的酒香味。,三.试剂与器材1.器材显微镜、解剖针、接种环、镊子、载玻片、盖玻片、灭菌玻璃纸、酒精灯、无菌平皿、手持放大镜。2.培养基马铃薯蔗糖琼脂培养基(灭菌备用)、灭菌麦芽汁琼脂培养基 3.菌种在马铃薯蔗糖琼脂平板上培养3-5d的根霉、毛霉、青霉及曲霉。黑根霉(+)和(-)各一管。啤酒酵母。4.试剂及染色液 乳酸、石炭酸、棉兰染色液,四.操作步骤（）、真菌的分离培养方法1.平板划线分离法2.稀释分离法（二）、真菌培养性状观察（三）、真菌的形态观察,五 注意事项注意整个操作过程需要无菌操作.,六 实验结果 如下图,霉菌的菌落,酵母菌的菌落,啤酒酵母,菌丝分枝顶端细胞或菌丝

17、分化来的分生孢 子梗的顶端细胞分割而成的单个或成簇孢子。,Conidiospores,Conidiospores,黑曲霉,黑曲霉（可引起烧伤病人皮肤感染或真菌性肺部感染,青霉菌,七、作业与思考题1.绘出青霉、根霉、毛霉、曲霉的个体形态及根霉接合孢子的形态图。2.简述细菌、放线菌、酵母菌、霉菌菌落形态的区别?3.将本次实验结果填入下表,4.描述你所观察到的酵母菌菌落特征。5.绘制你在显微镜中所观察到的酵母菌个体形态(特别是假丝酵母形态)。6.酵母菌与细菌在其培养特征和个体形态上有何区别?为什么?,实验六 细菌的生化试验,一、目的要求1通过本试验加深对细菌生化反应原理和意义的理解；2掌握常规细菌生

18、化试验操作方法。,二.原理糖发酵试验是最常用的生化反应，在肠道细菌的鉴定上及酿造工业中鉴别培养酵母和野生酵母的一种重要方法。绝大多数微生物能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖并产酸(如乳酸、醋酸、丙酸等)和气体(如氢、甲烷、二氧化碳等)；有些细菌只产酸不产气。如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气，伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。酵母菌能分解葡萄糖、蔗糖生成乙醇和CO2，不能分解乳糖。,M.R试验:某些细菌(如大肠杆菌、志贺氏菌、产气杆菌等)在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再

19、进一步分解为乙酸、乳酸、琥珀酸等。酸类增加愈多，则使培养基中的pH值愈下降，当降至pH4.5以下时，指示剂甲基红则呈红色，即为阳性反应。如pH值高于4.5时则指示剂呈黄色，即为阳性反应。因此,在培养物中加入1滴甲基红试剂，立即可以观察到上述结果之一。.,乙酰甲基甲醇试验(V-P反应)某些细菌（如产气杆菌）在糖代谢过程中，利用葡萄糖产生丙酮酸，再将丙酮酸缩合。脱羧而成为中性的乙酰甲基甲醇，该物质在碱性条件下能被空气中的氧气氧化生成二乙酰。二乙酰能与培养基中含胍基的化合物发生反应，立刻或于数分钟内生成红色化合物；即为V-P试验阳性。如果培养基含胍基太少，可加入肌酸或肌酐酸等含胍基化合物。当加入-萘

20、酚时也可使反应加速进行。,靛基质试验原理某些微生物如大肠杆菌，变形杆菌，霍乱弧菌等含有色氨酸酶，能分解培养基中的色氨酸，产生靛基质(indolo)。当它与对二甲氨苯甲醛作用，形成玫瑰靛基质而呈红色,硫化氢试验原理 某些微生物(如沙门氏菌、变形杆菌等)能分解蛋白质中的含硫氨基酸(如胱氨酸，半胱氨酸等)产生硫化氢，硫化氢遇到铅盐或铁盐，则发生作用而生成黑色的硫化铅或硫化铁。,三、试剂与器材1.器材：恒温培养箱，接种环，酒精灯2.培养基及试剂：蛋白胨水培养基，柠檬酸铁铵，吲哚检验试剂，缓冲葡萄糖蛋白胨水液体培养基8管(灭菌备用)，甲基红试剂，肌酸，40%KOH液，6%-萘酚酒精溶液,分别装有乳糖发酵

21、液，葡萄糖发酵液，蔗糖等发酵液的试管(内装有倒置的德汉氏小管)若干支。3.菌种：沙门菌，大肠杆菌,四 操作步骤（以大肠杆菌和沙门菌为例）1、糖类发酵（分解）试验2、VP试验（二乙酰试验）3、甲基红（MR）试验4、淀粉水解试验5、枸橼酸盐利用试验6、吲哚试验7、三糖铁试验,五 注意事项1.培养时间要充分.2.甲基红指示剂不可加得太多，以免影响实验结果.3.注意无菌操作.,六 实验结果 看下面图表.,三糖铁试验,生化实验,七 作业与思考题1.记录所有试验结果。2.这些反应对微生物的研究有何作用?,实验七 动物试验法,一、目的要求掌握实验动物的保定、接种、采血以及剖检的方法,二、操作步骤（一）、实验

22、动物保定法1.小白鼠保定法 2.豚鼠保定法 3.家兔保定法,(二)、实验动物接种法1.皮下接种 2.皮内接种 3.肌肉接种 4.腹腔内接种 5.静脉接种 6.脑内接种,(三)、实验动物采血法1.家兔采血法 2.豚鼠采血法 3.小白鼠采血法 4.绵羊采血法 5.鸡采血法,(四)、实验动物尸体剖检法思考题:实验动物必须具备条件?实验动物接种方法及注意事项?,实验八 凝集试验,一、目的要求二、操作步骤,一、目的要求1.熟悉平板凝集反应和试管凝集反应的操作技术，通过对凝集结果的观察和记录，了解凝集的判定和对被检牲畜试验结果的判定。2.了解间接血凝反应试验过程和操作方法。,二 原理颗粒性抗原与相应抗体相

23、遇后在电解质存在情况下出现肉眼可见的颗粒现象.,三 试剂与器材：试管架、凝集管、吸管、生理盐水、玻板、被检血清、布病平板抗原、试管抗原、布病阳性血清、阴性血清、恒温箱、玻璃铅笔等。,四操作步骤1.平板凝集反应（以布氏杆菌为例）按下列标准记录反应强度+：出现大的凝集块、液体完全透明。+：有明显凝集块、液体几乎完全透明，即75%凝集。+：有可见凝集片，液体不甚透明，即50凝集。+：液体混浊，有小的颗粒状物，即25凝集。：液体均匀混浊，无凝集物。牛、马和骆驼的血清在0.02ml处或以上凝集，而绵羊、山羊和猪的血清在0.04ml处或以上凝集，判为阳性反应；牛、马和骆驼的血清在0.04ml处凝集，绵羊、

24、山羊和猪的血清在0.08ml处凝集时判为可疑反应。,2.试管凝集反应 判定结果时用“十”表示反应强度：+：液体完全透明，菌体完全被凝集呈伞状沉于管底，振荡时，沉淀物呈片状、块状或颗粒状（即100的菌体被凝集）。+：液体略混浊，菌体大部分被凝集于管底，振荡时呈片状或颗粒状（75菌体被凝集）。+：液体不透明，管底有明显凝集片，振荡时有块状或小片絮状物（50菌体被凝集）。+：液体不透明，仅管底有少许凝集，其余无显著的凝集块（25菌体被凝集）。：液体混浊，管底无凝集，菌体不被凝集，但由于菌体自然下沉，在管底中央可见圆点状沉淀，振荡后立即散开呈均匀混浊。,五.注意事项1.抗原抗体要比例合适2.加样时注意

25、换枪头.3,抗原抗体混匀.,六.思考题:1.平板凝集与试管凝集反应结果判定方法.2.凝集反应的用途.,实验九 沉淀反应,一、目的要求1了解沉淀反应在预防医学和兽医学中的意义。2初步掌握炭疽沉淀原的制备和环状沉淀反应，琼脂扩散反应的操作方法。原理 将可溶性抗原与相应的抗体混合，在适量电解质存在下，经过一定时间，即可形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。参与沉淀反应的抗原称为沉淀原，抗体称为沉淀素。沉淀反应通常都是利用已知抗体检查未知抗原，以诊断传染病。但也用于以已知的抗原测定未知的抗体，以测定免疫血清的效价和诊断疫病。,二.原理可溶性抗原与相应抗体相遇后,出现肉眼可见的凝聚物.,三 试剂与器材Na

26、HPO412H2O,KH2PO4,脱脂棉，琼脂,NaCl,硫柳汞,平皿,打孔器,培养箱,加样器,酒精灯等.,四、操作步骤1.环状沉淀反应（以炭疽为例)沉淀原的制备 方法与判定.2.琼脂扩散沉淀反应（以炭疽为例）,五.注意事项1.向加样孔中加待测样品及标准对照时注意换加样器枪头.2.注意反应条件和时间.3.注意平板的放置环境的湿度,六 琼脂扩散沉淀反应结果,七.思考题（1）琼脂双相扩散试验操作过程。（2）沉淀反应操作注意事项。,实验十 主要病原菌的认识,一、目的要求认识链球菌、葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏杆菌、炭疽杆菌、魏氏梭菌和多杀性巴氏杆菌的形态染色特性和培养特性。,二 原理 根据每种细菌的形态,染色,培养特性以及生化特性差异,来鉴别不同的细菌.,三.试剂与器材显微镜,擦镜纸,几种细菌的标准片,各种细菌培养特性观察,血平板,鉴别培养基,香泊油等.,四、操作步骤1.链球菌 2.葡萄球菌3.大肠杆菌 4.沙门氏杆菌5.炭疽杆菌 6.魏氏梭菌7.多杀性巴氏杆菌,五.实验结果观察下面的各种细菌形态及培养特性:,链球菌,溶血性,三种溶血性,炭疽的“串珠反应”,大肠杆菌在麦康凯和伊红美兰上的培养特性,六 思考题1.链球菌有几种溶血现象?2.如何区别大肠杆菌与沙门菌?,The End,制作人:杨霞,