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1、粪便标本的细菌学检验,第八组,目的与要求,掌握粪便标本的方法掌握粪便标本的细菌学检验程序与方法,Background,正常人的肠道中栖居大量的不同种类的微生物，组成人类健康极为重要的体内微生态环境参与营养、消化、吸收及清洁肠道，维护健康的作用。腹泻因病原菌或病毒在在肠道繁殖引发，引起 腹泻细菌种类多。本实验主要介绍疑为沙门菌或志贺菌属感染者 或带菌者的粪便标本（或直肠拭子）中致病菌 的分离和鉴定。,由于肠道中存在大肠埃希菌等很多条件致病菌，其与肠道致病菌的主要区别之一是：大多数条件致病菌可分解乳糖，而绝大多数肠道致病菌则不分解乳糖。分离肠道致病菌多用含乳糖的弱选择性鉴别培养液（如麦康凯琼脂等）
2、以及对大肠埃希菌等条件致病菌有较强抑制作用、而又有利于肠道某些致病菌（如沙门菌及志贺菌属）生长繁殖的强选择性鉴别培养液。,Background,Background,粪便标本常见的病原菌：G菌：葡萄球菌属、白色假丝酵母菌、艰难梭菌、结核分枝杆菌、蜡样芽孢杆菌G菌：志贺菌、沙门菌、致病性大肠埃希菌、霍乱弧菌、亲水气单胞菌、类志贺邻单胞菌、弯曲菌、小肠结肠炎耶尔森菌,试剂与器材,菌株：伤寒沙门菌 培养基：麦康凯和SS琼脂平板 各种生化反应培养液及革兰氏染液等试剂（可参见微生物的自动分析及附录）沙门菌多价“O”（A-F组）及单价“O”诊断血清、“H”因子诊断血清,标本的采集,由于粪便中细菌种类很多，
3、故应根据检查目的的不同选择适宜的培养液或用适当方法处理，尽可能地抑制杂菌，以利于病原菌的检出。不能认为粪便中细菌含量多，粪便标本的采集就无须无菌操作。粪便标本的采集也应遵循无菌操作的原则。若便器或标本容器不洁而污染了变形杆菌，就可能影响病原菌的分离检出，甚至把污染菌误报，造成误诊。,标本的采集,采样的时期应合适。疑似痢疾患者应在发病初期、用药前采取标本。粪便标本采集时应挑取无尿液污染的有脓血、黏液部分的粪便23g（液状粪便可挑取絮状物），盛于无菌容器内送检。在无法获得粪便时，可采用直肠拭子，即用灭菌棉拭子经0.9%氯化钠溶液或增菌培养液湿润后，插入肛门内)45cm处，轻轻转动一圈后取出，插入无
4、菌试管（Cary Blair系统运送管）或保存液中送检；疑似伤寒患者应在发病23周内采集粪便标本。,标本的采集,在无法获得粪便时，可采用直肠拭子，即用灭菌棉拭子经0.9%氯化钠溶液或增菌培养液湿润后，插入肛门内)45cm处，轻轻转动一圈后取出，插入无菌试管（Cary Blair，卡布系统运送管）或保存液中送检；应采集可疑粪便，如立即患者粘液脓血便、霍乱患者的米泔水样便等。以为换乱患者，硬质碱性蛋白胨水中。除婴幼儿外，不推荐用棉拭子做常规病原菌培养。粪便标本如不能立即送检，可将标本放入甘油盐水保存液中，或保存于冰箱内（勿超过2小时）。,粪便标本的细菌学检验程序,粪便标本或肛拭子道标本,涂片,增菌
5、培养,直接分离,报告,革兰染色；动力学观察与制动试验（KIA、MIU）,初步报告,需氧培养,GN增菌液或亚硒酸增菌液,碱性蛋白胨,TCBS平板或其它碱性平板分离,SS平板MAC平板EMB平板,副溶血性弧菌选择平板,菌落形态生化反应,菌落形态、生化反应、抗血清凝集药敏,菌落形态、生化反应、抗血清凝集药敏,步骤与方法,革兰氏染色志贺菌与沙门菌：急性腹泻患者的粪便标本划线接种于SS平板和MAC平板。慢性腹泻患者志贺菌或携带者应接种GN增菌液，沙门菌接种亚硒酸盐增菌液，再转种SS平板与MAC平板，观察小的、透明或半透明、无色或浅黄色的可以菌落生长，有时SS平板可见中心黑色菌落（H2S）。挑选三个可疑菌
6、落分别接种三支KIA、MIU培养基，观察结果。挑取菌落进行革兰氏染色，观察细菌形态、排列。采用伤寒沙门菌诊断血清进行血清学鉴定。,步骤与方法,生化反应鉴定第2日观察平板上有无可疑菌落，用接种针于上述平板中挑取单个可疑菌落（无色、半透明、光滑、较小）23个，分别接种至23管双糖培养液内，置37培养1824h。第3日观察细菌生长情况，根据表102初步鉴定细菌种类，然后取双糖培养液上 的菌落进行系列生化鉴定。表 不同肠道细菌在双糖培养液培养结果（教学实验模拟标本的结果）序号 上层（乳糖）下层（葡萄糖）动力 可能结果 1+有 大肠埃希菌 2+有 伤寒沙门菌 3+无 痢疾志贺菌,步骤与方法,血清学最终鉴
7、定根据双糖培养液及系列生化反应结果判断，最后利用血清学实验对细菌进行最后的确定。如果初步鉴定结果为沙门菌属，则取双糖培养液斜面上菌苔与沙门菌多价“O”（A-F组）诊断血清作玻片凝集实验，如凝集即为沙门菌属，然后分别与A-F组的单价“O”诊断血清作玻片凝集实验定组，最后以H因子诊断血清作玻片凝集实验以定型（种），必要时可用因子诊断血清定型。如果根据双糖培养液及系列生化反应结果判断，初步鉴定结果为志贺菌属，则取菌苔与志贺菌属多价诊断血清作玻片凝集实验以定组，必要时可用因子诊断血清定种或型。,步骤与方法,若为较典型的沙门菌生化反应，但与A-F组多价“O”诊断血清又不发生凝集反应，应考虑可能为有VI抗
8、原的沙门菌，可将菌制成悬液以100加热30分钟以除去VI抗原后，再做血清学鉴定。如为较典型的志贺菌生化反应又不与其多价诊断血清发生凝集，则可用同样方法加热1001小时以破坏其K抗原，再做玻片凝集反应鉴定之。在细菌的血清鉴定中，最常使用的方法是凝集反应，其基本原理是细菌为颗粒性抗原，当与相应的抗体混合时，在一定浓度的电解质条件下，可出现肉眼可见的凝集现象。,步骤与方法,取一洁净载玻片，用记号笔划两个11.5cm的圆圈。取1：5或1：10诊断血清一接种环置于玻片左侧圈内，在右侧圈内放一接种环0.9%氯化钠作为对照。如天气炎热，环境温度高，则应适当多取血清及0.9%氯化钠，以防试剂短时间内干涸，影响
9、结果的观察。用接种环取待鉴定的新鲜细菌少许，分别研磨乳化于诊断血清及0.9%氯化钠内使之均匀混合。旋转摇动玻片数次，13分钟后观察结果。按上述操作方法，依次分别做A-E多价血清定属，特异性O因子血清定群，H因子血清定型（或种）。,结果,阴性：对照侧及实验侧均匀混浊不出现凝集。阳性：盐水对照侧呈现均匀混浊，实验侧明显凝集。自凝：对照侧及实验侧均出现凝集。,步骤与方法,取一洁净载玻片，用记号笔划两个11.5cm的圆圈。取1：5或1：10诊断血清一接种环置于玻片左侧圈内，在右侧圈内放一接种环0.9%氯化钠作为对照。如天气炎热，环境温度高，则应适当多取血清及0.9%氯化钠，以防试剂短时间内干涸，影响结
10、果的观察。用接种环取待鉴定的新鲜细菌少许，分别研磨乳化于诊断血清及0.9%氯化钠内使之均匀混合。旋转摇动玻片数次，13分钟后观察结果。按上述操作方法，依次分别做A-E多价血清定属，特异性O因子血清定群，H因子血清定型（或种）见p119。,注意事项,在细菌的血清鉴定中，最常使用的方法是凝集反应，其基本原理是细菌为颗粒性抗原，当与相应的抗体混合时，在一定浓度的电解质条件下，可出现肉眼可见的凝集现象。玻片法凝集实验是用诊断血清在玻片上与待测细菌相混合，在电解质 存在下，若出现肉眼可见的凝集小块即为阳性，表示该菌为所用抗体的相应细菌。此法是一种定性实验，方法简便快速，特异性强。可用于鉴定菌种及菌型。用于鉴定细菌的诊断血清有以下几种：多价诊断血清：即混合诊断血清。该血清含有两种（或型）以上细菌的相应抗体。一般用于细菌定群或初步分型。单价诊断血清仅含一种（或型）细菌的相应抗体。可用于细菌的定种（或型）。因子诊断血清细菌含有多种抗原成分，而且不同菌群细菌之间可有共同的抗原成分。因此，通过凝集吸收实验，将抗血清中的共同抗体除掉，仅含一种特异性抗体的诊断血清称为因子血清。可用于细菌分型。,
