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1、基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DNA聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。,第二节 基因工程的工具酶,自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功能的酶类。这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和修复等反应中具有重要作用，有的酶还作为微生物区别自己和非己的DNA进而降解非己DNA的防御工具。在研究掌握了利用这些酶类对基因切割、拼接操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。,随着越来越多的酶分子被发现，许多厂商已将其克隆并开
2、发成产品，工具酶的数量和用途不断增加，不仅简化了分子克隆的操作，而且拓宽了研究领域。本章主要介绍用于基因工程的各种工具酶。,基因工程工具酶,限制性内切酶 连接酶 DNA聚合酶 DNA修饰酶 RNA聚合酶 磷酸激酶和磷酸酶 核酸酶,一、细菌的限制修饰作用和限制性内切酶的发现,第一节 限制性核酸内切酶,50年代后Luria和Human(1952)Bertani和Weigle(1953)发现细菌的“限制”现象.,1、细胞的限制修饰作用,仍有少量(K)可在 E.coli B中生存，是因 E.coli B对(K)进行了修饰。,细菌如何对噬菌体进行限制和修饰？,1962年W.Arber(瑞士)发现，寄主对
3、噬菌体的修饰是在Phage入的DNA上。,1965年，Arber发现修饰与的降解有关，提出：细胞中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，即细胞中有限制修饰系统(R-M Restriction-modification system)。R-M系统是细菌安内御外的积极措施。,细菌的限制修饰系统,即限制性内切酶和与其对应的甲基化酶系统，称R-M system限制性内切酶识别特异的DNA序列并打断DNA，同时对应的甲基化酶能把该段特异的序列甲基化，使得限制性内切酶无法识别。这种系统在细菌中起到了免疫的作用，即外来入侵的DNA在限制性内切酶的作用下被水解，而细菌自身的DNA在甲基化酶的作用下被保护起来。
4、,细菌的限制和修饰现象,1968年Linn和Arber从E.coli B中发现限制酶,M.Meselson和R.yuan从E.coli K中分离到另一限制性的内切酶。,1970年Smith(美)在流感嗜血杆菌又发现另一限制酶即限制酶。,限制酶的功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。,1978年W.Arber、H.O.Smith(美)，Nathans(美)因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖。,限制性内切酶的发现,二、限制性核酸内切酶,是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（48bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。,（Restriction endon
5、uclease）,2.性质,内切酶。,原核生物。,即在核酸分子链的内部制造切口的酶。,自我保护作用。,3.功能,细菌的限制和修饰系统（R/M体系）,1.来源,限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。,（1）限制（Restriction）,细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。,（2）修饰（Modification）,Dam甲基化酶(Mec甲基化酶),GATC 腺嘌呤N6位置引入甲基,Dcm甲基化酶,CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基,1973年H.O Smith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：,三、限
6、制性内切酶的命名,1.用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。,大肠杆菌（Escherichia coli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilus influenzae）用Hin表示。,4.限制酶前面要带上R（Restriction)，修饰酶前面要带上M（Modification）。（现已省略）。,2.用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。,3.如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoR I，EcoR V。,若种名头2个字母相同则其中一个可用种名的第一和第三个字母。
7、,I 型限制性内切酶,目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶。,四、限制性内切酶的类型,II 类限制性内切酶,III类限制性内切酶,首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。,（1）识别位点序列,EcoB：TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC,1.I类限制性内切酶,如 EcoB和 EcoK。,未甲基化修饰的特异序列，非对称性。,需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。,（3）作用机理,在距离特异性识别位点约10001500 bp处随机切开一条单链。,Recognize site,cut,1-1.5kb,（2）切割位点,I类酶与D
8、NA识别位点结合依赖于M亚基与辅助因子S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的相互作用，后者通过变构作用使酶处于活性状态。酶分子与识别位点结合之后，根据该位点的甲基化状态发挥相应的酶活性，或限制、或修饰、或既不限制也不修饰。I类酶的切割位点与识别位点通常相距1,000-5,000bp，切割位点的序列并不表现出严格的特异性，两条DNA链上的断裂位点相距70-75个核苷酸，因此切开的DNA分子末端是单链形式。,如果识别位点是全甲基化的，则ATP使酶-SAM复合物脱离DNA双链；如果识别位点是半甲基化的(即只有一条链甲基化)，则酶-SAM复合物在ATP的帮助下使非甲基化的DNA链甲基化，同时SAM转变为相应的S
9、-腺苷高半胱氨酸(SAH)；如果识别位点没有甲基化，ATP可使酶分子再次变构，暴露出限制性内切酶的活性部位，先释放SAM，然后以一种未知的机制在切割位点处将双链DNA切断，同时消耗ATP。,首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。,II类限制性内切酶,分离的第一个酶是Hind,该类酶是一种分子量较小的单体蛋白，其双链DNA的识别与切割活性仅需要Mg2+，且识别与切割位点的序列大都具有严格的特异性，因而在DNA重组及分子生物学实验中被广泛使用。,（1）识别位点序列,未甲基化修饰的双链DNA；四、五或六个碱基对，而且具有180旋转对称的回文结构。与DNA的
10、来源无关。,5 G C T G A A T T C G A G 3,3 C G A C T T A A G C T C 5,EcoR I的识别序列,EcoR I的切割位点,绝大多数的II类酶均在其识别位点内切割DNA，切割位点可发生在识别序列的任何两个碱基之间。一部分酶识别相同的序列，但切点不同，这些酶称为同位酶（Isoschizomers），其中识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶，如SstI与SacI、HindIII与HsuI等。有些酶识别位点不同，但切出的DNA片段具有相同的末端序列，这些酶称为同尾酶（Isocandamers）。根据被切开的DNA末端性质的不同，所有的II类
11、酶又可分为5突出末端酶、3突出末端酶以及平头末端酶三大类。,II类酶分类,（2）切割位点,切开双链DNA。形成粘性末端（sticky end）或平齐末端（blunt end）。如：,识别位点处。,（3）粘性末端（sticky ends，cohensive ends）,含有几个核苷酸单链突出的末端。,分两种类型：,5端凸出（如EcoR I切点）,GAATTC,CTTAA G,G AATTC,CTTAAG,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,CTGCAG,3端凸出（如Pst I切点）,GACGTC,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,CTGCA G,G ACGTC,连接便利
12、,（4）粘性末端的意义,i）不同的DNA双链：,只要粘性末端碱基互补就可以连接。,ii）同一个DNA分子内连接：,通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。,这比连接两个平齐末端容易的多。,补平成平齐末端,凸出的3端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。,5末端标记,凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。,粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。,识别位点的序列相同的限制性内切酶。,（5）同裂酶（Isoschizomers),完全同裂酶(同位酶)：,识别位点和切点完全相同。如Hind 和Hsu I。,Hind 5-AAGCTT-3 3-
13、TTCGAA-5Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5,识别位点相同，但切点不同。如Xma I 和 Sma I。,不完全同裂酶：,识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl、Bcl I、Xho 等,（6）同尾酶(Isocaudamers）,5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5,BamH I,Bcl I,5-TGATCA-3 3-ACTAGT-5,5-AGATCT-3 3-TCTAGA-5,Bgl,5-UGATCY-3 3-YCTAGU-5,Xho,U代表嘌呤；Y代表嘧啶。,5-GATC-3 3-CTAG-5,Sau 3A,同尾酶的粘性末端互相结合后形成
14、的“杂种位点”一般不能再被原来的酶识别。,？,5-G3-CCTAG,GATCT-3 A-5,BamH I,Bgl,5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5,BamH I,Bgl,Sau 3A,限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。,（7）限制酶的酶活性,如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，内切酶出现切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称为星号（*）活性。,所以一般使用专一的反应缓冲液。,星号（*）活性,星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。,EcoR I和BamH I等都有*活性,使用时要注意！,如：EC
15、ORI识别特异性放宽，GAATTCAATT,较高的甘油浓度（5%v/v）；酶与底物DNA比例过高（不同的酶情况不同，通常为100 U/g）；低盐浓度（pH 8.0）存在有机溶剂（如DMSO、乙醇(9)、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane(12)等）用其他二价离子替代镁离子（如Mn+，Cu+，Co+，Zn+等）,导致星号活性的因素,以下酶类易出现“星号活性”，它们是 BamH I，Bcl I，BseB I，BssA I，EcoRI，EcoR V，Hind III，Hpa I，Kpn I，NcoI，NruI，Pst I，Pvu II，Sal I，Sca I，SnaB I，
16、Sph I，Ssp I，Xba I。,以上因素的影响程度因酶的不同而有所不同。例如EcoR I比 Pst I对甘油浓度更敏感，而后者则对高pH值更敏感一些(2)。,尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入的乙醇）的污染。将离子浓度提高到100-150 mM（若酶活性不受离子强度影响）。将反应缓冲液的pH值降到7.0。二价离子用Mg+。,抑制星号活性的方法,在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。,（8）s型限制性内切酶,移动切割（shifted cleavage):,GACGCNNNNN,Hga I,CTGCGN
17、NNNNNNNNN,5,3,3.III类限制性内切酶,在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。,在基因工程操作中用途不大。,EcoP1:AGACC,EcoP15:CAGCAG,III类限制-修饰酶由R亚基和MS亚基组成，其中MS亚基具有位点识别和甲基化修饰双重活性。该类酶与DNA识别位点的结合严格依赖ATP，在与识别位点结合之后，修饰作用与限制作用取决于两个亚基之间的竞争。修饰作用在识别位点内进行，甲基化受体是腺嘌呤碱基，供体仍为SAM。切割位点位于识别位点一侧的若干碱基对处，但无序列特异性，只与识别位点的距离有关，而且不同的III类酶具有各自不同的距
18、离，从7至26bp不等。,五、影响限制性内切酶活性的因素,1、底物 DNA,1)DNA的纯度,DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。RNA 与 E 结合影响有效酶浓度；RNA影响(干扰)电泳区带。,2)DNA浓度,DNA过大，会抑制酶活(影响酶分子扩散)。,如：4g DNA/1U HPa 50l 在37下 15h,而 1g DNA/1U HPa 50l 在37下 1h,3）识别位点及邻近位点特异性序列,由于切点邻近序列不同，水解速度不同。如：DNA有5个ECORI切点，其中两个相差10倍。,pBR322 DNA 有4个Nar切点(GGCGCC)其中2个切点
19、用1U酶水解1h完全切开,2个切点用50U酶水解16h水解不完全。,Xma切点是CGGCCG，但在GGCGGCCGCC时不切割,4)DNA二级/三级结构,超螺旋DNA(病毒或质粒)比线状DNA需更多酶。,5)提取时混入杂质可改变识别特异性,如：高浓度Hg2+、酚，氯仿、乙醇、EDTA SDS、NaCl等。,大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：,2.DNA的甲基化程度,dam甲基化酶（修饰GATC中的A）；dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。,基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。,不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。,3.温度,是影响限
20、制酶活性的重要因素。,4.缓冲液(Buffer),（1）缓冲液的化学组成,金属离子,如型酶需Mg2+，若以Mn2+代替Mg2+（如Hind，ECORI）则特异性改变。,离子浓度，合适激发酶活；不合适抑制酶活。,牛血清蛋白(BSA),MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；,BSA 是酶稳定剂，机制：减少蛋白酶及非特异性吸附作用。避免热、表面张力、化学品导致的酶变性。过量BSA会引起电泳拖尾。可通过加SDS/65/5min除去。,水,无离子水，ddH2O，双蒸水。无菌、无污染、配成
21、核心缓冲液，即几种酶的相近buffer,商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。,六、限制性内切酶对DNA的消化,1.内切酶与识别序列的结合模式,1986年J.A.McClarin等通过X射线晶体衍射发现II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。,GAATTC,CTTAAG,内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。,2.完全消化,1,2,3,4,1,2,3,4,只有有限数量的酶切位点被切开。,通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。,3.局部消化,1,2,3,4,1,4,大多数酶可用65 oC温育5分钟失活。或用乙醇沉淀DNA。,4.限制酶酶切反应的终止,5.几种常用
22、限制酶识别位点,要做定向克隆，通常要作双酶切。同步双酶切是一种省时省力的常用方法。选择能让两种酶同时作用的最佳缓冲液是非常重要的一步。酶切所用的缓冲液可以从各公司的酶活性图表中选择。,6.双酶切,双酶切注意事项,选活性至少都在80以上的buffer 注意反应温度 1）温度一致时可同时进行 2）温度不一致时，先切温度低的，再切温度高的如果找不到同时适合两种酶的缓冲液，可以按两种酶的条件按顺序进行酶切反应。先用需要在低盐条件下反应的限制性内切酶来切割，然后提高盐浓度以完成第二次切割。最好先切一个，回收后再切另一个.,由于内切酶在非最佳缓冲液中进行双酶切反应时，反应速度会减缓，因此需要增加酶量或延长
23、酶切时间来提高酶切速率。,从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。,第二节 DNA 连接酶,一、DNA连接酶（ligase)的发现,DNA复制一定有断口。,DNA连接酶旧称“合成酶”。是1967年在三个实验室同时发现的，最初发现于大肠杆菌。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。,（1）大肠杆菌连接酶,1.两种DNA连接酶,只能连接粘性末端。分子量74
24、000dal,辅因子NAD+,其作用是封闭双螺旋骨架上具有5-磷酰基和3-羟基的缺口，形成磷酸二酯键。,二、DNA ligase的特点,（2）T4噬菌体的连接酶,T4DNA连接酶来自于T4噬菌体感染的E.coli，为T4噬菌体自身的表达产物。分子量6.8万dal，辅因子位ATP，该酶既能连接粘性末端，亦能连接齐平末端。,（1）必须是两条双链DNA。,（2）DNA3端有游离的-OH，5端有一个磷酸基团（P）。,（3）需要能量,动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：NAD+,2.连接条件,1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。,三、连接反应的机理,2.ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，
25、并释放出焦磷酸PPi。,3.AMP与连接酶的赖氨酸e-氨基相连。,OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+,+H3N,AMP,ATP,PPi,4.AMP随后从连接酶的赖氨酸e-氨基转移到DNA一条链的5端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。,-OH,HO-P-,AMP,-OH,O-P-,AMP,5.3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP。,用DNA连接酶，可催化外源DNA和载体分子之间发生连接作用，形成重组分子。具体做法是，在体外将具有粘性末端的DNA限制片断，插入到适当载体分子上，再用DNA连接酶连接，从而可以按照人们的意图构建出新的DNA杂种分子。,粘性末端DN
26、A片段的连接（连接酶的作用）,同种内切酶生产的粘性末端的连接,5,5,EcoRI,退火,G,CTTAA,AATTC,G,G,CTTAA,AATTC,G,T4-DNA ligase,5,5,5,5,用粘性末端构建重组体DNA的最主要缺点：1、无法控制外源基因的插入方向；2、由限制酶产生的具有粘性末端的载体DNA分子，在连接反应混合物中会发生自我环化作用，经连接酶作用，形成共价闭环的稳定环形结构。克服该缺点的方法是，用碱性磷酸酶预先处理线性的载体DNA分子，以移去末端的5磷酸基团，于是在连接反应中，它自身的两个末端之间就再也不能被连接酶共价连接起来了。,1、同聚物加尾法 是由美国斯坦福大学的P.L
27、abban和D.Kaiser1972年发展起来的，可以连接任何两段DNA分子的普遍性方法。原理：利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)转移核苷酸的特殊功能，将同种核苷酸（dNTP)加到DNA分子单链延伸末端的3-OH上。如果在目的基因两侧加polydA，则在载体两侧加polydT。长度一般1040个残基。,平末端DNA片段的连接,同聚物加尾法优点:1)首先不易自身环化.2)因为载体和外源片段的末端是互补的黏性末端，所以连接效率较高.3)用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接.缺点：1)插入的片段难以回收。2)无法控制外源基因插入方向。3)用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连
28、接.,人工粘性末端的连接 平头末端,C 3,G,G,5,G 3,C,5,C,3G,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dTTP,dATP,GTTTTTTTTTT 3,C,退火,C,3 TTTTTTTTTTG,CAAAAAAAAAA 3,G,G,3 AAAAAAAAAAC,5,5,CAAAAAAAAAAC,GTTTTTTTTTTG,C,3,5,5,CAAAAAAAAAAC,GTTTTTTTTTTG,人工粘性末端的连接 3突出末端,CTGCA 3,G,G,3 ACGTC,5,GCATG 3,C,5,C,3 GTACG,T4-DNA ligase,TdT,TdT,dCTP,dGTP,GCAT
29、GCCCCCC 3,C,退火,Pst I,Pst I,C,3 CCCCCCGTACG,CTGCAGGGGGG 3,G,G,3 GGGGGGACGTC,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGG C,G CCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,5,5,CTGCAGGGGGGCATGC,GACGTCCCCCCGTACG,Klenow,Pst I,Sph I,人工粘性末端的连接 5突出末端,5,G,CCTAG,GATCC,G,5,5,5,5 AATTC,G,T4-DNA ligase,5,
30、5,Klenow,补平,Klenow,补平,5,GGATC,CCTAG,GATCC,5,CTAGG,5,GAATT,CTTAA 5,5,5 AATTC,TTAAG,TdT,TdT,dGTP,dCTP,GAATTGGGGGG,CTTAA,AATTC,GGGGGGTTAAG,GGATCCCCCCC,CCTAG,GATCC,CCCCCCCTAGG,GGATCCCCCCCAATTC,CCTAGGGGGGGTTAAG,5,5,GGATCCCCCCCAATTC,CCTAGGGGGGGTTAAG,退火,BamH I,BamH I,EcoR I,BamH I,衔接物（linker)连接法所谓衔接物是指用化学方
31、法合成的一段由1012个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸段片断。将衔接物的5末端和待克隆的DNA片段的5末端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来，接着用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和载体分子，由此使两者都产生出彼此互补的粘性末端。优点：克隆后还可回收原插入片断。,DNA衔接物连接法尽管有诸多优点，但明显的缺点是，如果待克隆的DNA片段或基因的内部也含有与所加的衔接物相同的限制位点，这样在酶切消化衔接物产生粘性末端的同时，也会把所克隆的基因切成不同的片段，从而对后继的亚克隆及其他操作造成麻烦。,DNA接头(adaptor
32、)连接法DNA接头是由美国康奈尔大学吴瑞博士于1977年发明的，它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接后，便会使后者成为具有粘性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。问题：各个DNA接头分子的粘性末端之间，会通过互补碱基间的配对作用，形成如同DNA衔接物一样的二聚体分子，失去接头的本来意义。克服的方法是将5末端的磷酸修饰移去，其结果为暴露出的5-OH所取代。如此一来，虽然两个接头分子粘性末端之间仍具有互补碱基配对的能力，但终因DNA连接酶无法在5-OH和3 OH之间形成磷酸二酯键而不会产生出稳定的二聚体分
33、子。,连接酶反应的最佳温度是37C。,四、连接反应的温度,1.最佳温度,但在37下粘性末端的结合很不稳定。,2.实用温度,所以一般采用 416 C。,增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。,1.插入片段与载体的浓度比例,2.反应温度,五、影响连接反应的因素,1020倍。,一般1416,第三节 DNA聚合酶,一、基因工程中常用的DNA聚合酶,DNA聚合酶(全酶)(E.coli)Klenow fragment(E.coli)TDNA聚合酶(TPhage感染的E.coli)TDNA聚合酶(TPhage感染的E.coli)修饰的TDNA聚合酶(测序酶)DNA末端转移酶(小牛胸腺)反转录
34、酶(依赖RNA)聚合酶,1.共同特点,把dNTPs连续地加到引物的3OH端。,2.主要区别,T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。,其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。,二、常用的DNA聚合酶的特点,持续合成能力和外切酶活性不同。,高,快,有,无,Taq DNA聚合酶,中,低,无,无,逆转录酶,高,快,无,无,遗传修饰T7DNA聚合酶,高,快,无,高,T7DNA聚合酶,低,中,无,高,T4DNA聚合酶,低,中,无,低,Klenow fragment,低,中,有,低,大肠杆菌DNA聚合酶,持续能力,聚合速率,53外切酶活性,35外切
35、酶活性,DNA聚合酶,3.常用DNA聚合酶的特性比较,三、DNA聚合酶在基因工程中的用途,1.大肠杆菌DNA聚合酶 I,主要用来制备带放射性标记的DNA探针。,（1）大肠杆菌DNA聚合酶I 的性质,一条单链多肽。,53外切酶活性位于N端。,用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的53外切酶活性部分。就成为Klenow fragment。,底物：,dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）,Mg2+,带有3OH游离端的引物,DNA模板,（2）DNA聚合酶I（Pol I）的反应条件,-OH,5,3,dNTPs,核酸探针（probe）,能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分
36、子。,（3）用DNA聚合酶I 制备探针,已知序列的核酸片断,显示位置,与互补的待测序列杂交,标记,已知序列的核酸片断,探针的标记方式,标记,已知序列的核酸片断,带有放射性的已知序列的核酸片断,5,3,DNA聚合酶I 对探针序列的标记,切口转移法(nick translation)：,放射性同位素标记：,DNA聚合酶I 同时具备53外切酶活性和53的聚合酶活性（以及35外切酶活性）。,53外切酶活性从DNA切口的下一段DNA5端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的上一段DNA的3一侧补上一个新的核苷酸。,切口,切口,5,5,3,3,5,3,5,3,纯化的DNA片断,DNase I 制造单链切
37、口,DNA Pol I 进行切口转移,一种a-32P-dNTP和dNTPs,5,5,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,3,3,32P-dNTP,32P-dNTP,从头至尾都被标记,8,缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性较高、标记均一。主要利用了DNA聚合酶修复DNA的功能，用于大分子DNA标记（1000bp最好）；缺点：单链DNA、RNA不能用该法标记。,2.Klenow fragment(DNA聚合酶I大片段),具有53聚合酶活性和35外切酶活性。（失去了53外切酶活性）。,（1）Klenow fragment的性质,C 端76，000 dKlenow活性 聚合 5外切
38、,N 端36，000 5外切,Jacobsen(1974),Joyce 和 Grindley,(1983)克隆此大片段。,DNA Pol I,枯草杆菌蛋白酶,3端补平,5,5,klenow,DNA 3末端标记,补平限制性内切酶切后形成的3隐蔽端。,在3隐蔽端加上放射性标记的dNTP。,klenow,（2）主要用途,3隐蔽末端的DNA片断,Klenow fragment补平,根据末端的顺序选择一种 a-32P-dNTPs,末端标记的DNA,限制性内切酶切,5-G33-CTTAA5,5-GAA33-CTTAA5,5-GAATT33-CTTAA5,5-G33-CCTAG5,5-GG33-CCTAG5
39、,5-GGATC33-CCTAG5,EcoR I,BamH I,a-32P-dATP,a-32P-dGTP,25oC 1h,cDNA第二链的合成,mRNA,cDNA第一链,逆转录,cDNA第二链,klenow,5,3,3,5,5,3,引物,随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合,在Klenow酶的作用下,合成DNA探针。合成产物的大小、产量、比活性依赖于反应中模板、引物、dNTP和酶的量。通常,产物平均长度为400-600个核苷酸。,随机引物法标探针,优点：(1)Klenow片段没有53外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。(2)反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒
40、DNA模板也可进行反应。(3)反应产物的比活性较高,可达4109 cpm/g探针 缺点：不能标记环状DNA,纯化的DNA片断,加热变性,klenow进行5-3聚合反应,随机引物，一种a-32P-dNTP和dNTPs,5,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,3,32P-dNTP,32P-dNTP,（1）T4 DNA聚合酶的性质,3.T4 DNA聚合酶,从T4噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由噬菌体基因43编码。,有53聚合酶活性和35外切酶活性（降解单链更快）。,来源,酶活性,特点,当没有dNTP时，T4DNA聚合酶行使35外切酶功能，制造出3隐蔽端。,如果只有一种dNTP，
41、则降解到该dNTP的位置。,5,5,3,3,5,5,3,3,T4 DNA聚合酶,无dNTPs,T4 DNA聚合酶,有dNTPs,5,5,（2）T4 DNA聚合酶的用途,标记末端（取代合成法）,用35外切酶活性作用于所有末端形式的3端（平端、3隐蔽端、5隐蔽端）制造出3隐蔽端。再利用它的53聚合酶活性补平，并加入放射性标记的dNTP。,补平隐蔽末端,DNA 3末端标记,酶切中间产生两个末端标记,加入某种32P-dNTP和dNTPs,T4 DNA聚合酶（35外切）,DNA酶切片断,T4 DNA聚合酶（53聚合）,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,内切酶
42、切,无dNTPs,4.T7 DNA聚合酶,（1）来源,从T7噬菌体感染大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：,T7基因5编码的大亚基：,有53聚合酶和35外切酶活性。,大肠杆菌编码的小亚基：,硫氧还蛋白。增加大亚基对模板的亲和性。,（2）T7 DNA聚合酶的特点,持续合成能力强,一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。,35外切酶活性高,单链和双链都能降解。,不受DNA二级结构的影响,其它DNA聚合酶受DNA二级结构的阻碍,进行末端标记,以大分子量DNA为模板的合成,如M13,补平隐蔽末端,（3）T7 DNA聚合酶的用途,取代合成法标记3末端。,与T4 DNA聚合酶相同。,合成补平3隐蔽末端
43、；水解修平3突出末端。,5.修饰的T7 DNA聚合酶,（1）T7DNA聚合酶的化学修饰,去除35外切酶活性，使DNA聚合能力和聚合速率提高了3倍。,（2）修饰后的T7 DNA聚合酶的用途,DNA测序,双脱氧法。,标记DNA 3隐蔽末端,更有效地补平末端,来源：,是一种只在前淋巴细胞和淋巴细胞分化早期阶段中存在的罕见的DNA聚合酶(Chang和Bollum,1986)。,结构：,MW=60，000d.,活性：,催化dNTP掺入DNA 3-OH末端，形成同聚物末端,反应不需模板DNA，需Co2+。,用途：,克隆DNA片段时加上互补同聚物末端，便于与载体连接。,末端标记,6.末端转移酶(不依赖模板的
44、DNA聚合酶),商品反转录酶有两种,来自禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)。,来自鼠类白血病病毒（MMLV）反转录酶。,7.逆转录酶,依赖RNA的DNA聚合酶（RNA指导的DNA聚合酶）。,（1）来源,RNaseH：以53或35方向特异地水解RNA-DNA杂交双链中的RNA链。,合成长cDNA M-MLV优于AMV.,RNaseH,RNADNA,RNADNA,（3）逆转录酶的用途,合成cDNA,以oligo dT为引物（与mRNA的polyA尾巴互补结合）。,AAAAA,TTTTT,5,3,mRNA 5,cDNA,核酸探针是指带有标记物的已知序列的核酸片段，它能和与其互补的核酸序列杂交，形成双链，所
45、以可用于待测核酸样品中特定基因序列的检测。,核酸探针(Nucleic acid probe),1).按来源及性质划分 可将核酸探针分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针和人工合成的寡核苷酸探针等几类。较常使用的是基因组DNA探针和cDNA探针。2).按标记物划分 有放射性标记探针和非放射性标记探针两大类。,1.核酸探针的种类,放射性标记探针用放射性同位素做为标记物。常用的同位素32P、3H、35S。其中，以32P应用最普遍。,1.放射性标记探针,优点：,灵敏度高，可以检测到pg级。放射自显影效果好。,缺点：,半衰期短（32P只有14.3天）不易保存、对人体有害。要求在专门实验室操作。,
46、2.非放射性标记探针,i）生物素标记：,生物素（biotin），又称维生素H、辅酶R,可以与dNTP酰化结合成为生物素-1,6-dUTP、生物素-1,4-dATP、生物素-1,1-dUTP等。,CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH,也可以被生物素连接酶（biotin ligase）催化与蛋白质共价结合。,纯化的DNA片断,DNase I 制造单链缺口,DNA Pol I 进行缺口转移,生物素-dTTP和dNTPs,5,5,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,3,3,生物素-dTTP,生物素-dTTP,利用缺口转移法将生物素掺入DNA探针中,光敏生物素标记,生
47、物素,连接臂,光敏基团,探针序列,探针序列,生物素,连接臂,光敏基团,+,光照,在强光下，不需酶反应，光敏生物素的光敏基团即可与核酸中的碱基相结合。光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也不低，但标记效率不高，每100150个碱基才能标记一个生物素，对于短的基因探针特别是寡核苷酸探针不宜使用，以免因标记数过少而影响灵敏度（Forster et al 1985）。,抗生物素蛋白（avidin）：,链霉抗生物素蛋白（streptavidin）：,生物素的识别亲和素：,是一种鸡卵清蛋白。,细菌中avidin的类似物。,能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用：,ii）地高辛标记：,可以与dNTP连接成地高
48、辛-dUTP等，参入DNA合成过程。形成地高辛标记的DNA探针。,生物素和地高辛标记的探针都有商品化的试剂盒(kit)。,地高辛的结合物是抗地高辛抗体。,iii）偶联酶及其底物,常用的两种酶：,辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRPO）碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase,AP）,催化一些特殊的反应，反应的过程中发出荧光（或生成有色的产物）。,酶的作用：,HRPO和AP的显色反应底物,碱性磷酸酶催化发光反应机理,金刚烷,iv）用非放射性标记的探针检测原理,生物素,探针序列,待测基因,亲和素,酶,底物,中间产物,产物,发光,探针DNA用生物素或地高辛
49、标记。,亲和素或地高辛抗体与酶偶联。,酶催化一个发光或显色反应。,亲和素或地高辛抗体与生物素或地高辛结合。,一、T4多核苷酸激酶,1.来源,T4噬菌体的pseT基因编码。从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。,多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。,2.功能,催化g磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5-OH端。,不论5-OH端突出与否。,第四节 DNA修饰酶,5,3,HO-,-OH,5,3,HO-,-OH,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,ATP,T4多核苷酸激酶,如果ATP的g磷酸带有32P标记，就会被转移到DNA的5端。,但天然的DNA的5端都是磷酸化的。,3.多核苷酸激酶的用途,
50、DNA 5-OH端磷酸化、标记DNA的5端。,5,3,HO-,-OH,5,3,HO-,-OH,3,32P-,-OH,5,3,HO-,-32P,5,(g-32P)ATP,多核苷酸激酶,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,碱性磷酸酶,（1）正向反应（forward reaction）,（2）交换反应标记法,反应混合物中具有超量(g-32P)ATP和ADP时，多核苷酸激酶能催化(g-32P)ATP的g-32P与DNA5端的磷酸交换。,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,3,32P-,-OH,5,3,HO-,-32P,5,(g-32P)ATP、ADP,多核苷酸激酶,反应效果不理想。,二
