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1、第四章 序列特征分析,第一节 引言,一、基因结构,Section 1 Introduction,基因的概念是随着遗传学、分子生物学、生物化学等领域的发展不断完善的。从分子生物学角度来看，基因是负载特定生物遗传信息的DNA分子片段，在一定的条件下能够表达这种遗传信息，产生特定的生理功能。,原核生物基因结构：,一个完整的原核基因结构是从基因的5端启动子区域开始，到3端终止区域结束。基因的转录开始位置由转录起始位点确定，转录过程直至遇到转录终止位点结束，转录的内容包括5端非翻译区、开放阅读框及3端非翻译区。基因翻译的准确起止位置由起始密码子和终止密码子决定，翻译的对象即为介于这两者之间的开放阅读框O
2、RF。,操纵子模型结构,原核生物大多数基因表达调控是通过操纵子机制实现的。所谓操纵子通常由调节基因、启动子、操纵基因以及2个以上的编码序列（结构基因）在原核生物基因组中成簇串联组成。其中结构基因的表达受到操纵基因的调控。调节基因能产生作用于操纵基因的阻遏物（一种蛋白质），操纵基因靠近它所控制的结构基因，阻遏物与操纵基因的结合能阻止结构基因的转录。,真核生物基因结构：,一个完整的真核生物基因，不但包括编码区域，还包括5端和3端两侧长度不等的特异性序列，虽然这些序列不编码氨基酸，却在基因表达的过程中起着重要的作用。所以，严格的“基因”这一术语的分子生物学定义是：产生一条多肽链或功能RNA所必须的全
3、部核苷酸序列。,二、蛋白质结构,蛋白质是一种生物大分子，蛋白质中相邻的氨基酸通过肽键形成一条伸展的肽链，这条链称为蛋白质的一级结构，不同蛋白质其肽链的长度不同，肽链中不同氨基酸的组成和排列顺序也各不相同。肽链上的氨基酸残基形成局部的二级结构，各种二级结构在空间卷曲折叠形成特定的三维空间结构。有的蛋白质由多条肽链组成，每条肽链称为亚基，亚基之间又有特定的空间关系，称为蛋白质的四级结构。,蛋白质的一级结构,蛋白质的一级结构决定二级结构蛋白质的二级结构决定三级结构,蛋白质的二级结构,H表示螺旋 E表示折叠 B表示桥G表示3-螺旋 I表示螺旋 T表示氢键转角S代表转向,蛋白质空间结构,蛋白质的生物学功
4、能在很大 程度上取决于蛋白质的空间结构，但蛋白质的空间结构又取决于蛋白 质一级结构中的氨基酸组成和排列 顺序，蛋白质结构构象多样性导致 了不同的生物学功能。蛋白质分子只有处于它自己特定的空间结构情况下，才能获得它特定的生物活性，空间结构稍有破坏，就很可能会导致蛋白质生物活性的降低甚至丧失，因为它们的特定的结构允许它们结合特定的配体分子。知道了基因密码，科学家们可以推演出组成某种蛋白质的氨基酸序列，却无法绘制蛋白质空间结构。因而，揭示人类每一种蛋白质的空间结构，已成为后基因组时代的制高点，这也是结构基因组学的基本任务。,对DNA序列和蛋白质序列进行序列特征分析，能够使我们从分子层次上了解基因的结
5、构特点，了解与基因表达调控相关的信息，了解DNA序列与蛋白质序列之间的编码，了解蛋白质序列与蛋白质空间结构之间的关系和规律，为进一步研究了解蛋白质功能与蛋白质结构之间的关系提供理论依据。,第二节 DNA序列特征分析,Section 2 Analysis of DNA Sequence Characteristics,分析DNA序列，除了进行序列比对之外，更重要的工作是从序列中找到基因及其表达调控信息。寻找基因的工作有两个：一是识别与基因相关的特殊序列信号，如启动子、起始密码子，通过信号识别大致确定基因所在的区域；二是预测基因的编码区域，或预测外显子所在的区域。在此基础上，结合两个方面的结果确定
6、基因的位置和结构。绝大部分基因表达调控信息隐藏在基因序列的上游区域，在组成上具有一定的特征，可以通过序列分析识别这些特征。,一、开放阅读框ORFopen reading frame,开放阅读框指的是从5端开始翻译起始密码子（ATG）到终止密码子（TTA、TAG、TGA）的蛋白质编码碱基序列。每个序列都有6个可能的开放阅读框，其中3个开始于第1、2、3个碱基位点并沿着给定序列的5 3的方向进行延伸，而另外的3个开始于第1、2、3个碱基位点但沿着互补序列的5 3的方向进行延伸。在开始这项工作之前，我们并不知道DNA双链中哪一条单链是编码链，也不知道准确的翻译起始点在何处，由于每条链都有3种可能的开
7、发阅读框，2条链共计6种可能的开放读框，我们的目的就是从这6个可能的开放阅读框中找出一个正确的开放阅读框。根据这个开放阅读框翻译得到的氨基酸序列才是真正表达的蛋白质产物。,真核生物的开放阅读框,真核生物的开放阅读框不仅含有编码蛋白的外显子（exon），而且还有内含子（intron），并且内含子将开放阅读框分割为若干个小片段。开放阅读框的长度变化范围非常大，因此真核生物的基因预测远比原核生物困难。但是，在真核生物的开放阅读框中，外显子与内含子之间的连接绝大部分情况下满足GT-AG规律：内含子序列 5 端的起始两个核苷酸总是GT，并且其3端的最后两个核苷酸总是AG，即：5-GT AG-3，这个规律
8、有助于真核生物开放阅读框的识别。,利用GENSCAN识别基因开放阅读框,GENSCAN是美国麻省理工学院的Chris Burge于1997年开发成功的人类（或脊椎动物）基因预测软件，它是根据基因组DNA序列来预测开放阅读框及基因结构信息的开放式在线资源，尤其适用于脊椎动物、拟南芥和玉米等真核生物。GENSCAN的网址为：http：,GENSCAN在线操作页面,用GENSCAN预测AC002390序列的基因/外显子,用GENSCAN预测AC002390序列的基因/外显子的位置图,起始外显子,终止外显子,二、CpG岛 CpG islands,CpG岛是指DNA序列上的一个区域，此区域含有大量相联的
9、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G），以及使两者相连的磷酸酯键（p）。CpG岛的概念是Gardiner-garden和Fromner于1987年提出的，基因中平均每100 Kb即可出现。CpG岛位于基因的启动子和第一个外显子区，约有60%80%的人类基因的启动子和起始外显子含有CpG岛，其中GC含量大于50%，长度超过200bp。因此搜索CpG岛可以为基因及其启动子预测提供重要线索。,利用CpGPlot预测分析CpG岛,CpGPlot是预测CpG岛的在线工具，它是由欧洲分子生物学实验室EMBL European Molecular Biology Laboratory提供的。其网址为：/,CpGPlot
10、在线操作页面,用CpGplot预测AC002390序列的CpG岛的结果,用CpGReport预测AC002390序列的CpG岛的结果,三、转录终止信号,转录终止信号是在mRNA序列的3端终止密码子下游位置上的加尾信号（tailing signal）。前体mRNA 3端多聚腺苷酸化是真核细胞内mRNA转录后处理的三个最主要步骤之一，这三个步骤包括：5帽子结构的形成、内含子的剪切及3端的多聚腺苷酸化，因此，前体mRNA 3端多聚腺苷酸化与mRNA稳定性的调节、mRNA的细胞内转运、翻译的起始以及一些其他的细胞机制和疾病机制有着重要关系。,真核生物前体mRNA3端的多聚腺苷酸化包括两个步骤：,1.特
11、异性的核苷酸内切酶在PolyA位点处进行断裂；2.腺苷酸聚合酶在断裂位点处添加PolyA尾巴，其主要标志 为AATAAA或ATTAAA两种序列，称为多聚腺苷酸信号（polyadenylation signal），简称PolyA信号序列，也称为 转录终止信号。在3UTR区存在多个潜在PolyA位点，因此对PolyA位点的准确识别，对于预测基因结构、理解mRNA的形成机制及某些疾病的分子机制具有巨大的作用。,利用POLYAH预测分析转录终止信号,SoftBerry网站的POLYAH软件是识别3端剪切和PolyA区域的在线工具。其网址为：，,POLYAH在线页面,用POLYAH预测AC002390序
12、列的转录终止信号的结果,四、启动子promoters,启动子是基因的一个组成部分，是位于结构基因5端上游区的DNA序列，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录因子的蛋白质结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥RNA聚合酶的活动。如果基因的启动子部分发生突变，则会导致基因表达的调节障碍。这种突变常见于恶性肿瘤。,利用PromoterScan预测分析启动子区域,BioInformatics and Molecular Analysis Section网站的PromoterScan软件是预测分析启动子区域的在线工具。其网址为：,Pro
13、moterScan在线网页,用PromoterScan预测AC002390序列的启动子区域的结果,五、密码子偏好性,密码子使用偏性是指生物体中编码同一种氨基酸的同义密码子的非均匀使用现象。这一现象的产生与诸多因素有关，如基因的表达水平、翻译起始效应、基因的碱基组分、某些二核苷酸的出现频率、G+C含量、基因的长度、tRNA的丰度、蛋白质的结构及密码子一反密码子间结合能的大小等。所以对密码子使用偏好性的分析具有重要的生物学意义。,利用CodonW分析密码子偏好性,CodonW是美国DEC公司开发的对密码子的使用进行分析的免费的软件工具。此软件是建立在大量的统计学分析的基础上，为了简化在线分析的复杂
14、性而开发的，它可以在Windows环境下运行，并且可以同时处理2000条以上的序列。通过对DNA或RNA序列的分析，CodonW会产生关于密码子使用的相关指标的统计学分析的数据，我们可以利用这些数据对我们所要了解的序列进行分析。其下载网址为：。,CodonW1.4主菜单的操作页面,11个密码子使用的指标,waxy基因的序列,用CodonW分析waxy基因所得的RSCU值 和 个数,第三节 蛋白质序列特征分析,Section 3 Analysis of Protein Sequence Characteristics,蛋白质是组成生物体的基本物质，是生命活动的主要承担者，一切生命活动都与蛋白质有
15、关。虽然遗传信息的携带者是核酸，但遗传信息的传递和表达不仅要在酶的催化之下，并且也是在各种蛋白质的调节控制下进行的。因此，分析处理蛋白质序列数据的重要性并不亚于分析DNA序列数据。蛋白质的生物功能由蛋白质的结构所决定，因此在研究蛋白质的功能时需要了解蛋白质的空间结构。,目前，一种基本认可的假设是：蛋白质的空间结构由蛋白质序列所决定，即我们可以根据蛋白质序列预测蛋白质结构，这是第二遗传密码的问题，也是一个更为复杂的问题，因为蛋白质序列和蛋白质空间结构之间的关系要比DNA序列和蛋白质序列之间的关系复杂得多。因此我们需要分析大量的数据，从中找出蛋白质序列和蛋白质结构间存在的关系和规律。,一、蛋白质的
16、理化性质,蛋白质是由氨基酸组成的大分子化合物，对组成蛋白质的氨基酸进行理化性质的统计分析是对一个未知蛋白质进行分析的基础。蛋白质的理化性质包括蛋白质的分子量、氨基酸的组成、等电点、消光系数、亲水性和疏水性、跨膜区、信号肽、翻译后修饰位点等。,利用ProtParam分析蛋白质的理化性质,ExPASy（Expert Protein Analysis System）是由瑞士生物信息学中心维护，并与欧洲生物信息学中心（EBI）及蛋白质信息资源（protein in formation resource，PIR）组成Universal Protein Knowledgebase联盟。ExPASy数据库提
17、供了一系列蛋白质理化分析工具，以便于检索未知蛋白质的理化性质，并基于这些理化性质鉴别未知蛋白质的类别，为后续实验提供帮助。其中ProtParam（physico-chemical parameters of a protein sequence）就是计算氨基酸理化参数常用的在线工具。其网址为：http:/expasy.org/tools/protparam.html,ProtParam在线页面,用ProtParam分析G00016序列理化性质的结果,二、蛋白质的亲水性或疏水性,氨基酸通常被分为三类：1.疏水氨基酸（hydrophobic amino acid），其侧链大部分 或者全部由碳原子和
18、氢原子组成，因此这类氨基酸不太可 能与水分子形成氢键；2.极性氨基酸（polar amino acid），其测链通常由氧原子或 氮原子组成，它们比较容易与水分子形成氢键，因此也称 为亲水氨基酸；3.带电氨基酸（charged amino acids），这类氨基酸在生物 pH环境中带有正电或负电。,蛋白质的基本组成单元是氨基酸。,蛋白质的亲水性或疏水性,氨基酸的亲疏水性是构成蛋白质折叠的主要驱动力，一般通过亲水性分布图（hydropathy profile）反映蛋白质的折叠情况。蛋白质折叠时会形成疏水内核和亲水表面，同时在潜在跨膜区出现高疏水值区域，据此可以测定跨膜螺旋等二级结构和蛋白质表面氨基
19、酸分布。,利用ProtScale分析蛋白质的亲水性或疏水性,ExPASy的ProtScale程序是计算蛋白质亲疏水性分析的在线工具。其网址为：http:/expasy.org/tools/protscale.html,ProtScale在线页面,用ProtScale分析P02699序列疏水性结果的图形显示,Hohob./Kyte&Doolittle标度,用Window size=13时计算窗口内每个位置上氨基酸的标度权值,三、蛋白质的跨膜区,生物膜所含的蛋白质叫膜蛋白，是生物膜功能的主要承担者。根据蛋白质分离的难易及在膜中分布的位置，膜蛋白基本可分为两大类：外在膜蛋白和内在膜蛋白。外在膜蛋白约
20、占膜蛋白的20%30%，分布在膜的内外表面，主要在内表面，为水溶性蛋白，它通过离子键、氢键与膜脂分子的极性头部相结合，或通过与内在蛋白质的相互作用间接与膜结合；内在膜蛋白约占膜蛋白的70%80%，是双亲媒性分子，可不同程度的嵌入脂双层分子中。有的贯穿整个脂双层，两端暴露于膜的内外表面，这种类型的膜蛋白又称跨膜蛋白。,蛋白质的跨膜区,内在膜蛋白露出膜外的部分含较多的极性氨基酸，属亲水性，与磷脂分子的亲水头部邻近；嵌入脂双层内部的膜蛋白由一些非极性的氨基酸组成，与脂质分子的疏水尾部相互结合，因此与膜结合非常紧密。所以，对膜蛋白的跨膜区进行预测是生物信息学的重要应用。,利用TMpred分析蛋白质的跨
21、膜区,TMpred是EMBnet开发的一个分析蛋白质跨膜区的在线工具，TMpred基于对TMbase数据库的统计分析来预测蛋白质跨膜区和跨膜方向。TMbase来源于Swiss-Prot库，并包含了每个序列的一些附加信息，如：跨膜结构区域的数量、跨膜结构域的位置及其侧翼序列的情况。TMpred利用这些信息并与若干加权矩阵结合来进行预测。其网址为：,TMpred在线网页,用TMpred分析P51684序列所得到的可能的7个跨膜螺旋区,用TMpred分析P51684序列所得到的7个可能的跨膜螺旋区的相关性列表,用TMpred分析P51684序列所得到的7个可能的跨膜螺旋区的建议的跨膜拓扑模型,用TM
22、pred分析P51684序列所得到的7个可能的跨膜螺旋区的图形显示结果,四、信号肽signal peptide,信号肽是指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移的末端（通常为N末端）的氨基酸序列。信号肽中至少含有一个带正电荷的氨基酸，中部有一个高度疏水区以通过细胞膜。信号肽假说认为，编码分泌蛋白的mRNA在翻译时首先合成的是N末端带有疏水氨基酸残基的信号肽，它被内质网膜上的受体识别并与之相结合。信号肽经由膜中蛋白质形成的孔道到达内质网内腔，随机被位于腔表面的信号肽酶水解，由于它的引导，新生的多肽就能够通过内质网膜进入腔内，最终被分泌到胞外。,蛋白质的前导肽leader Peptide,前导肽是信
23、号肽的一种。在线粒体蛋白质的跨膜转运过程中，通过线粒体膜的蛋白质在转运之前大多数以前体形式存在，它由成熟蛋白质和N端延伸出的一段前导肽共同组成。迄今已有40多种线粒体蛋白质前导肽的一级结构被阐明，它们约含2080个氨基酸残基，当前体蛋白跨模时，前导肽被一种或两种多肽酶所水解转变成为成熟蛋白质，同时失去继续跨膜的能力。前导肽一般具有以下特性：（1）带正电荷的碱性氨基酸（特别是精氨酸）含量较为丰富，它们分散于不带电荷的氨基酸序列之间；（2）缺失带负电荷的酸性氨基酸；（3）羟基氨基酸（特别是丝氨酸）含量较高；（4）有形成两亲（既有亲水又有疏水部分）-螺旋结构的能力。,利用SignalP分析蛋白质的前
24、导肽,SignalP是丹麦技术大学的生物序列分析中心开发的信号肽及其剪切位点检测的在线工具，该软件基于神经网络方法，用已知信号序列的革兰氏阴性原核生物、革兰氏阳性原核生物及真核生物的序列分别作为训练集。SignalP预测的是分泌型信号肽，而不是那些参与细胞内信号传递的蛋白。其网址为：,SignalP在线网页,用SignalP（神经网络方法）分析P05019序列前导肽的结果,用SignalP（隐马尔可夫方法）分析P05019序列前导肽的结果,五、蛋白质的卷曲螺旋coiled-coil,卷曲螺旋是蛋白质空间结构中的一种，它是由2 7个螺旋相互缠绕而形成超螺旋结构的总称。卷曲螺旋区域一般由7个氨基酸
25、残基为单位组成，以a、b、c、d、e、f、g位置表示，其中a和d位置为疏水性氨基酸，而其他位置的氨基酸残基为亲水性。许多含有卷曲螺旋结构的蛋白质具有重要的生物学功能，例如基因表达调控中的转录因子。含有卷曲螺旋结构最知名的蛋白质有原癌蛋白（oncoprotein）c-fos和jun，以及原肌球蛋白（tropomyosin）。,利用COILS分析蛋白质的卷曲螺旋,COILS是由Swiss EMBNet维护的预测卷曲螺旋的在线工具，该软件是基于Lupas算法，将查询序列在一个由已知包含卷曲螺旋蛋白结构的数据库中进行搜索，同时也将查询序列与包含球状蛋白序列的PDB次级库进行比较，并根据两个库搜索得分决
26、定查询序列形成卷曲螺旋的概率。COILS也可以下载到本地进行运算。其网址为：,COILS在线网页,用COILS分析GO45_HUMAN卷曲螺旋的图形显示结果,用COILS分析GO45_HUMAN卷曲螺旋的文本显示结果,六、蛋白质序列分析软件包：Antheprot,对蛋白质的研究是生物化学领域一个非常重要的部分。随着人类基因组计划的实施和完成，得到了大量的蛋白质序列数据，但是，面对如此众多的蛋白质序列数据，其分析工作是一个非常困难的工作。用人工的方法是不可能完成如此大量的分析工作的。运用计算机，利用一定的运算规则，进行蛋白序列分析是唯一的方法。蛋白序列分析软件包Antheprot正是这样的一个程
27、序。,蛋白质序列分析软件包：Antheprot,Antheprot是位于法国的蛋白质生物与化学研究院用十多年时间开发出的蛋白质研究软件包，它包括了蛋白质研究领域所包括的大多数内容，功能非常强大。Antheprot的原始网站：，我们可以到这个网站上下载软件包，软件包为一个自解压执行文件，文件名为Antheprot.exe，大小为51.3M。执行此文件，输入解压后存放的目录名，便可将所有文件解压在此目录下。主程序名为Anthepro，双击主程序名就可以打开Antheprot_2000的主窗口。通过主程序，我们可以输入蛋白序列，对序列进行编辑、打印、拷贝、改变设置等操作，更重要的是，我们可以在此调用
28、各种所需的分析工具，对蛋白序列进行分析。,Antheprot主窗口,Antheprot主窗口中各按键的含义,Open file，打开文件；,Change text font，更改字体、字型和大小；,Change text color，更改选定区域内字的颜色；,Sequence information，序列信息，计算蛋白质序列的分子量、比溶、各氨基酸残基的百分比组成；,Titration curve，滴定曲线，计算蛋白质序列滴定曲线与等电点；,Helical wheel projection，选定序列的一个片段后，绘制Helical wheel图；,Antheprot主窗口中各按键的含义,Pre
29、diction of cleavage site for signal peptide，预测信号肽的剪切位点；,Secondary structure prediction by all，预测蛋白质序列的二级结构；,PROSITE site/signature detection，在蛋白质序列中查找符合PROSITE数据库的特征序列；,Physico-chemical profiles，绘制蛋白质序列的理化特性曲线；,Pridict transmembrane region，预测跨膜区；,Similarity search with Blast，用Blast方法在选择的数据库中查找相似序列；,
30、Antheprot主窗口中各按键的含义,Similarity search with Fasta，用Fasta方法在选择的数据库中查找相似序列；,Dot Matrix Plot，进行点阵图分析；,Multiple alignment，多序列比对；,Binary alignment（BINALIGN），在当前蛋白质序列中查找符合Prosites数据库的特征序列；,Help，打开一个简单的帮助文件；,Quit，推出程序。,Antheprot基本功能,1.编辑（edit）2.参数设置（setting）3.方法选择（methods）4.数据库（database）,第四节 序列综合分析,Section
31、4 Sequence Analysis Software,一、EMBOSS软件包,EMBOSS软件包是一个开源的序列分析软件包，该软件包源于1988年开始开发的EGCG系统，整合了目前可以获得的大部分序列分析软件，并有一套专门设计的C语言库函数。该软件包含160多个小型程序，能够完成自动识别处理不同格式存储的数据，可以通过互联网提取数据，能很好地进行序列模体（motif）、关键词同源性数据库搜索，进行序列比较、进化分析、序列两级结构分析、限制性酶切图谱分析、引物设计、序列模式识别与翻译、片段拼接等工作。EMBOSS遵照GPL协议，打破了商业软件包发展的传统模式，使科研工作者在自由、免费的软件世
32、界享受功能强大的分析工具。EMBOSS的主页网址为：,EMBOSSEuropean Molecular Biology Open Software Suite,EMBOSS的运行环境,EMBOSS软件包主要运行于linux操作系统和Mac操作系统。现在基于Windows操作系统的EMBOSS也是能自由免费使用的。需要说明的是基于windows操作系统时，主要采用staden进入EMBOSS，在使用的同时，需要安装Embosswin软件。Embosswin的下载网址是：,JEMBOSS 使用界面,EMBOSS Explorer 使用界面,二、DNAstar软件包,DNAstar软件包可在计算机上
33、进行DNA和蛋白序列分析，可进行分子生物学中的小规模序列分析和多序列比对。DNAstar软件包有PC Windows和Macintosh两种版本，它的一个主要功能是有7种程序可以针对不同的应用，用户可根据自己的需要进行选择。有关DNAstar软件包更详细的信息查询网站：,DNAstar的安装环境,该软件包可以在苹果机（Macintosh）上和在PC机（Windows）上安装和升级。建议至少30Mb的硬盘，32Mb的RAM。,三、Omiga 2.0软件包,Omiga2.0是一款强大的蛋白质、核酸分析软件，可以实现对核酸序列和蛋白序列分析的大部分功能，同时它还兼有引物设计的功能。,Omiga2.0
34、的主要功能,实现核酸序列与其互补链之间的转化，序列的拷 贝、删除、粘贴、置换以及转化为RNA链，以不同的读码框、遗传密码标准翻译成蛋白质序列。2.查找核酸限制性酶切位点、序列模式及开放阅读框，设计并评估PCR、测序引物。3.查找蛋白质的水解蛋白位点（Proteolytic Sites）、序列模式、二级结构等。查寻结果可以以图谱及表格的显示，表格设有多种显示形式。,四、Vector NTI软件包,Vector NTI是由Informax公司开发的一种高度集成、功能齐全的分子生物学应用软件，可以对DNA、蛋白质分子进行分析和操作。有关Vector NTI更多的信息可以登录Vector NTI的官方网查询：,Vector NTI主要功能,DNA序列的开放阅读框、序列模式、功能区搜索、限制酶图谱、蛋白质翻译。PCR引物、测序引物、杂交探针的设计和评价。DNA测序片断的拼接。4.同源比较和系统发育树构建。5.蛋白质结构预测 三维结构、化学键、翻译后修饰位点、结构域等。6.模拟电泳 琼脂糖电泳、PAGE。,
