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1、PCR（Polymerase Chain Reaction)技术即聚合酶链式反应，又称DNA体外扩增技术。1985年由美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明，荣获1993年度诺贝尔化学奖。,DNA半保留复制的机理；体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质。,PCR的基本原理,PCR扩增体系,模板（Template）：基因组、质粒DNA、cDNA，也可以使细菌、组织样品等。引物（Primer）：确定扩增目的序列的特异性；确定扩增产物长度。DNA聚合酶（DNA Polymerase）：推动PCR反应进行的机器。扩增效率和保真性。缓冲液（Buffer）：控制体系的pH和离子强度，为DNA
2、聚合酶提供最佳工作环境。脱氧核苷酸（dNTP）：DNA的基本组成元件，包括dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP。Mg2+、K+、增强剂,1.变性：高温使双链DNA解离形成单链（95，30s）。2.退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（45 65，30s） 。3.延伸：中温延伸。DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（ 72，30 60s ）。,PCR的基本原理,高温变性,低温退火,中温延伸,理论：2n递增（n为循环次数），如果扩增30循环，目标DNA可增加230也就是109倍。实际：由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以
3、实际上进行30个循环后，扩增倍数一般可达106 107。,PCR扩增曲线,1.早期（E期）:引物在单链DNA模板上搜索互补序列 ，并与特定位点杂交。2.中期（M期）：扩增反应顺利进行，产物呈指数型增长。3.晚期（L期）：平台期，DNA聚合酶过度损耗或者产物的抑制。,PCR扩增条件,循环,PCR反应条件94 5min94 30s56.2 30s72 30s72 7min4 ,PC1-P20：模板：基因组DNA；产物：506bp,举个例子,PCR体系（10 L）模板：1 L上游引物：0.2 L下游引物：0.2 LEasy Taq 酶：0.1 LEasy Taq Buffer：1 LdNTP：0.8
4、 LddH2O：6.7 L,30个循环,1.避免PCR试剂的污染2.最适合的反应条件3.设置对照组：PCR空白对照：在反应体系中剔除反应模板。PCR阴性对照：即反应体系中用无关的基因片段代替目的模板。PCR阳性对照：即反应体系中以已知能够成功进行特异性扩增的模板。,PCR的注意事项,1.为什么完全没有PCR扩增产物？试剂质量问题或者加样时出错，导致反应体系不完整。聚合酶失活或反应体系中有聚合酶抑制剂。PCR仪温度控制不精确。模板DNA发生降解。引物或反应温度设计不合理靶片段GC含量过高或扩增对象长多,常见问题,2.为什么出现多条非特异性条带？反应体系被污染。引物特异性差。退火温度不合适。,常见
5、问题,3.为什么PCR产物很少？聚合酶活性过低。循环次数偏低。模板DNA浓度过低。,常见问题,4.为什么PCR产物出现片状拖尾？DNA聚合酶过多或酶活性差。dNTP和Mg2+浓度过高。退火温度过低，PCR循环数偏多。模板DNA用量过大或模板DNA不纯。引物特异性差、引物间形成二聚体导致非特意扩增。,常见问题,普通PCR仪,温度梯度PCR仪,实时荧光定量PCR仪,为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。 引物是PCR特异性反应的关键，同时也与PCR扩增的效率密切相关。引物设计的最重要的原则：最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。,引物设计的目的,1、引
6、物应具有足够的特异性。 如果需要从基因组等较复杂的模板中扩增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列的非特异性。 引物与非特异序列的同源性不超过70%或有连续8个互补碱基。 NCBI Primer BLAST,引物设计的基本原则,2、避开易形成二级结构的模板序列区域。 分子内互补、发夹结构、分子间互补。 二级结构会这家引物与模板杂交以及PCR的困难，因此要尽可能避开这种序列区域。 用有关软件预测mRNA的稳定二级结构。,引物设计的基本原则,3、引物长度一般为18-30个碱基之间。 引物长度与反应的特异性和解链温度成正相关。过短：扩增特异性下降过长：引物自
7、身形成二级结构，以及引物二聚体。,引物设计的基本原则,4、G+C含量一般为40%-60% 引物的碱基组成也会对引物的解链温度产生影响。G+C含量过低：引物解链温度低，引物易于从模板上解离。G+C含量过高：引物解链温度高，易与非特异性序列杂交，出现非特异性扩增条带。,引物设计的基本原则,5、Tm值之差应小于1，最适退火温度在55-60。 一对引物的Tm值差过大可直接导致PCR扩增效率下降或失败。 对于20bp左右的引物： Tm（）=2（A+T）+4（G+C） 一般情况下，PCR的最佳退火温度比引物Tm值低5左右。,引物设计的基本原则,6、引物中四种碱基最好是随机分布的 避免4个以上聚嘌呤或者聚嘧
8、啶的重复。特别是引物的3端不应有连续3个G或C，否则会使引物在G+C富集序列区域产生错配，降低扩增的特异性。,引物设计的基本原则,7、引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身互补发夹结构 引物之间互补二聚体 引物自身连续互补碱基不应超过3个，引物之间连续互补碱基不应超过4个，尤其避免3端的互补重叠。,引物设计的基本原则,8、引物的5端可以修饰，3端不可以修饰。 引物的5端决定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大，可以被修饰而不影响扩增的特异性。如：加酶切位点、标记生物素、引入点突变等。 由于延伸是从3端开始的，所以不能进行任何修饰。,引物设计的基本原则,9、引物的3端不可以A结尾。
9、 引物3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3端最好选择T。,引物设计的基本原则,10、引物3端要避开密码子的第3位。 如扩增序列位于基因编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。,引物设计的基本原则,1、避免重复碱基，尤其是G。2、引物退火温度在58-60之间。3、G+C为30-80%。 4、3端最后5个碱基内不能有多于2个的G或C。5、引物的产物大小一般在80-250bp之间；80-15
10、0 bp最为合适（可以延长至300 bp）。,Real-Time PCR引物设计原则,6、要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。7、Real-Time PCR引物的扩增产物应跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，以避免基因组DNA污染影响。,Real-Time PCR引物设计原则,Primer Premier 5.0Oligo 6Primer 3（在线）Primer-BLAST（在线）,引物设计常用软件,粘贴模板序列,引物搜索,引物位置,产物大小,引物长度,Primer BLAST,由一条RNA单链转录为互补DNA（cDNA）称作逆转录PCR（Reverse Transcriptio
11、n PCR，RT-PCR），由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。,逆转录PCR的原理,逆转录PCR的原理,逆转录PCR的反应体系,1、模板RNA2、逆转录酶3、逆转录引物,Thanks！,93-96，较高的温度变性更快更彻底，尤其是对富含G+C的靶序列而言。,退火温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。退火温度可以通过计算推断，通常采用温度梯度PCR的方法进行摸索。,45.0 45.5 46.9 49.0 51.4 53.8 56.2 58.6 60.9 63.1 64.5 65.0 M,PC1-P20 退火温度摸索,延伸的温度通常为所以DNA聚合酶的最适工作温度，一般为72；延
12、伸的时间主要取决于目的片段的大小，不同种类的聚合酶的合成效率也不同，因此还与DNA聚合酶的种类有关。 Easy Taq：1-2kb/min TransStart Taq:1-2kb/min FastPfu: 2-4kb/min,循环数： 在其他参数都已优化的条件下，最适循环数取决于靶序列的初始浓度。一般情况下30-35个循环即可。循环数太多：会增加非特异扩增产物的数量和复杂性。循环数太少：PCR产量太低。,逆转录引物： （1）随机六聚核苷酸引物 仅长6个核苷酸，每个核苷酸位点上随机加入4中不同的脱氧核苷酸，因此是46中不同引物的集合体。 所有RNA分子均可以充当模板，合成的cDNA中有96%来自rRNA。,逆转录引物： （3）特异性引物 能与目标RNA碱基序列互补的寡核苷酸引物，仅产生待分析基因的cDNA。,
