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1、基因克隆及蛋白表达,细胞生物学教研室李丰,研究某一目的基因功能一般策略,目的DNA获得来自三条途径:1.genome上的特定区域或序列2.含有目的DNA的质粒3.从cDNA文库中扩增单个已知cDNA,获得目的DNA,构建含目的DNA质粒,第一部分PCR,聚合酶链反应（PCR）技术,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是20世纪80年代后期由K.Mullis等建立的一种体外酶促扩增特异DNA片断的技术。PCR是利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板进行的DNA体外合成反应。PCR技术具有灵敏度高，特异性强，操作简便等特点。目前已广泛
2、应用于分子生物学的各个领域。,一、PCR实验原理,一、PCR实验原理,二、PCR的反应体系,1.PCR引物（1）primer 长度：18-30bp 引物短特异性降低 引物长影响产物生成（2）primer 浓度：0.1-1.0 umol/L 浓度过高错配、引物二聚体增加 浓度过低PCR效率降低,二、PCR的反应体系,2.缓冲液 KCl、Tris-Cl、MgCl2，Mg2+：1.52.0 mM Mg2+:DNA聚合酶 活性 PCR产量 Mg2+:PCR反应特异性,二、PCR的反应体系,3.DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶 LA DNA聚合酶 Prime STAR(Pyrobest DNA聚合酶)
3、Pfu DNA聚合酶,Taq DNA polymerase,5,5,3,3,5,3,3,5,53 DNA聚合酶活性。在模板和引物存在的条件下，以dNTP作为底物，沿53方向合成与模板互补的DNA,LA Taq DNA Polymerase,1.53 DNA聚合酶活性；2.35 DNA外切酶活性。,Pyrobest&pfu DNA Polymerase,Taq DNA 聚合酶活性 35外切酶活性，可信度极高 PCR产物为平滑末端,PCR的反应体系,4dNTP:50-200 umol/L5.模板DNA（1）单链DNA（2）双链DNA（3）浓度：基因组DNA：1ug 质粒DNA：10ng,三、基本操
4、作步骤,1.变性(denature):95高温下,双螺旋氢键断 裂,双链DNA解链成为单链DNA2.退火(annealing):两条引物与模板DNA扩增区 域的两端按碱基互补配对结合.3.延伸(extension):在4种dNTP底物及Mg2+存在 条件下,Taq DNA聚合酶在72下,将单核 苷酸按碱基互补配对原则从引物3端掺 入,使引物沿53方向延伸合成新股DNA,四、条件优化,1.变性:95变性20-30s,即可使各种DNA完全变性。2.退火:引物与模板退火温度由引物长度和GC%决定,退火温度一般应比Tm值低4-12 为宜,退火时间一般为20-40s。3.延伸:通常68-75。延伸时间取
5、决于扩增片断的长度.可以500bp/30s为基准，根据目的片断的长度计算反应时间。4.循环次数：一般为25-35次。,PCR反应液,PCR Buffer（Mg2+）2.5ldNTP混合物（各2.5mM）4l模板DNA 1l引物1（20uM）0.5l引物2（20uM）0.5lTaq DNA polymerase（5U/ul）0.25lddH2O至 25l,PCR反应条件,94 5min94 30sec55 30sec 30 Cycles72 1min72 10min 4 forever,五、PCR引物的设计,PCR反应成功的一个关键条件是正确设计引物PCR引物设计目的是在扩增特异性和扩增效率两个
6、目标上取得平衡.可以利用计算机软件进行引物设计,引物设计软件会通过每一引物设计变化的预定值在两个目标间取得平衡,找出最佳引物.有时也需根据实验的具体要求进行适当调整.,引物设计的基本原则,(一)引物长度在16-30bp范围内,以18-24bp为最佳.引物过短,产物特异性降低,每增加一个核苷酸,引物特异性可增加4倍.引物的长度是指与模板DNA序列互补的部分,不包括为后续克隆而加的酶切位点与额外序列.,引物设计的基本原则,(二)引物末端1.引物的3末端对于PCR反应是关键.2.引物的3末端的第一和第二个碱基影响Taq DNA聚合酶的延伸效率,故其影响PCR反应的扩增效率及特异性.引物3末端最佳碱基
7、选择G或C，因为它们形成的碱基配对比较稳定。,引物设计的基本原则,3.引物5末端的碱基无严格限制当引物的长度足够时,引物5末端的碱基可不与模板DNA互补而呈游离状态。可在5端加上限制内切酶位点,启动子序列或其他序列等,以便于PCR产物的分析克隆。,引物设计的基本原则,4.在一个PCR反应中的一对引物之间不应存在互补序列,特别是3末端应尽量避免互补,以免形成“引物二聚体”造成引物浪费和非特异性的扩增.5.每个引物的内部应尽量避免形成二级结构,特别是引物的末端应无回文结构.,引物设计的基本原则,(三)引物的GC含量和Tm值PCR引物G+C碱基的含量应保持在45-65%之间，G+C含量一般为40-6
8、0%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5-10度。引物长度小于20bp时,Tm=4(G+C)+2(A+T)。,引物设计的基本原则,(四)引物的位置1.引物的序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列，这样可减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性。2.若以cDNA为模板，则首先应尽量使引物和产物保持在mRNA的编码区域内；其次，尽量把引物放在不同的外显子上，以便使特异的PCR产物与从污染DNA中产生的产物在大小上相区别。,引物设计的基本原则,（五)Primer prim
9、er 5.0辅助的引物设计步骤及条件优化,第二部分RT-PCR,RT-PCR,是将RNA反转录和PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA，然后进行常规PCR。,cDNA合成,Superscript first-strand synthesis system for RT-PCR 是从总RNA或mRNA合成cDNA。RNA量为1ng5ug。,Reverse Transcriptase,5,5,3,3,5,3,3,5,1.依赖于RNA的 53 DNA聚合酶活性（反转录活性）；2.依赖于DNA的 53 DNA聚合酶活性。,Reverse Transcriptase,RNA,DN
10、A,DNA,3.RNase H 活性：特异性识别并分解RNA-DNA杂交体中的RNA链,RT-PCR,用M-MuLV反转录酶（RNase H-）进行cDNA第一链的合成,RNase H缺陷型莫洛尼氏鼠白血病病毒（M-MuLV）反转录酶是一种RNA介导的DNA聚合酶。该酶能以RNA或者单链DNA做模板由引物起始合成一个互补的DNA链。RNase H活性的缺失增强了该酶合成长链cDNA的能力。编码M-MuLV反转录酶的基因在重组大肠杆菌中表达，该酶在其RNase H区域含一点突变，从而使修饰后酶的RNase活性缺失，但反转录功能不受影响。,用M-MuLV反转录酶（RNase H-）进行cDNA第一
11、链的合成,进行PCR前用Rnase H消化。去除与cDNA结合的RNA，增加PCR敏感性。第一链合成过程中RNase H降解模板mRNA，导致全长cDNA合成减少及cDNA第一链产量降低。,cDNA第一链的合成有三个方法,（1）Random hexamers：是最非特异性引物。通常在特异全长mRNA难以拷贝时应用此引物。利用该方法，以全部RNA做模板合成cDNA。在PCR时，PCR引物决定其特异性。,cDNA第一链的合成有三个方法,（2）oligo（dT）：较特异和常见的方法,其cDNA的合成数量和复杂性大大低于random hexamers方法,尤其是进行新的mRNA RT-PCR时,建议用
12、此方法.,cDNA第一链的合成有三个方法,(3)Gene-specific primer(GSP):最为特异的方法。利用邻近mRNA 3末端的PCR引物进行cDNA第一链合成,但是,某些GSP即使以DNA为模板,能扩增出DNA条带.有时,也不能进行cDNA第一条链合成.此时建议用oligo（dT）引物.,cDNA第一条链合成步骤,第三部分克隆,RNA提取纯化,RT-PCR,质粒DNA,PCR,凝胶回收PCR扩增片段,目的基因片段T-A克隆,转化感受态细胞,蓝白斑筛选,质粒提取、酶切鉴定,连入GST融合表达载体,外源基因克隆到真核表达载体,GST融合蛋白表达,转化、活性测定,转染真核细胞,表达定
13、位,得到目的基因片段的T-A克隆,PCR片段回收,利用从琼脂糖凝胶中回收纯化DNA片段的试剂盒。试剂盒采用了独特的凝胶融解系统，结合DNA制备膜技术，具有高效快速的特点。本试剂盒纯化DNA片段纯度高，完整性好。可直接用于连接反应，PCR扩增。,T-A克隆,经Taq DNA聚合酶扩增后的PCR产物末端都带有单个A。正是基于这一原理，pGEM-T质粒经EcoR V切成平端后，在开口端加上一个T制成T载体，一方面避免了自身环化，另一方面由于T-A互补，提高了T载体与PCR产物之间的连接效率。,T-Vector,转化感受态细胞,转化过程所用的受体细胞：限制修饰酶系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲
14、基化酶的突变体（R，M）。它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl2）处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Competent cells）。,转化感受态细胞,进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant），即带有异源DNA分子的受体细胞。,T-Vector,进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增,IPTG(异丙基-半乳糖苷）是-半乳糖苷酶活性的诱导物,可使lacZ 阻抑物失活，
15、从而诱导lac操纵子转录。基于这个特性,当PUC系列载体以lacZ缺欠细胞作为宿主进行转化时,如果在培养基中加入X-Gal和IPTG,由于-半乳糖苷酶的-互补性,可以根据是否呈现白色而方便的选择出基因重组体.,进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增,X-gal:(5-溴-4氢-3-吲哚-D-半乳糖苷)X-gal是E.Coli产生的-半乳糖苷酶的显色底物。-半乳糖苷酶可将X-gal转变为不溶性的深蓝色沉淀。,进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增,双链pGEM-T质粒，有一个复制起点，一个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多克隆位点处于表达LacZ基因产物-半乳糖苷酶的氨基端片段。用质粒转化LacZ基因突
16、变的大肠杆菌株（JM109或DH5）时，因为由质粒表达的-肽补充了大肠杆菌缺失的-肽，所以恢复了分解半乳糖的能力。,进行蓝白筛选，对阳性克隆进行扩增,在加入IPTG和X-gal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆位点内插入外源DNA，由于它破坏了-肽的表达，因而在加入IPTG和X-gal的培养基，不能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。,质粒的提取及酶切鉴定,第四部分：外源基因的原核表达,外源基因的原核表达,外源基因的表达是研究和探索基因功能、基因表达调控机制以及编码蛋白质的结构和功能的重要方法，亦是制备和生产新型蛋白质药物、新型诊断试剂必不可少的手段。外源基因通过在宿主细胞中的表达可大量获
17、得其产物。,一、原核表达系统常用的载体及其应用,（一）大肠杆菌表达系统（二）大肠杆菌载体的表达方式,大肠杆菌表达系统,大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的经典表达系统。优点：遗传背景清晰、目的基因表达水平高、培养周期短等；,大肠杆菌表达系统,缺点：缺少真核生物的蛋白翻译后修饰和加工过程，如剪切、糖基化及正确二硫键的形成等；表达的蛋白质多以包含体形式存在，需经复性才能恢复构象与活性；宿主本身杂蛋白多，纯化步骤复杂。,大肠杆菌载体的表达方式,1非融合性表达载体：此种载体表达的蛋白质与天然状态下存在的蛋白质在结构、功能和免疫源性等方面基本或完全一致。,大肠杆菌载体的表达方式,2融合表达载体：分子量较小
18、的蛋白质可采用这种载体进行表达。优点：可增加mRNA和表达产物的稳定性；可应用针对融合蛋白中非目的蛋白片段进行亲和层析，很容易将融合蛋白纯化；通过融合表达可产生可溶性蛋白；,大肠杆菌载体的表达方式,融合表达载体主要有以下几种：谷胱甘肽-S-转移酶（GST）系统；-半乳糖苷酶系统；麦芽糖结合蛋白（MBP）系统；蛋白A系统；与纯化标签融合表达以及其他融合系统。,大肠杆菌载体的表达方式,3带纯化标签的表达载体：目前应用较多的纯化标签有GST-tag,FLAG-tag,His-tag.4分泌型表达载体5表面展示表达载体6带分子伴侣的表达载体,外源基因的原核表达载体构建及转化,扩增阳性克隆并进行诱导表达
19、,pGEX-5x-1载体带有IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）诱导启动子，可以表达外源蛋白的总量可以达到全菌蛋白的30%以上。,SDS-PAGE电泳,将含有目标蛋白的样品用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离。利用浓缩胶和分离胶的浓缩效应，电荷效应和分子筛效应对不同分子量大小的蛋白质进行分离。,Western Blot,GST-Pro-B,GST,RNA提取纯化,RT-PCR,质粒DNA,PCR,凝胶回收PCR扩增片段,目的基因片段T-A克隆,转化感受态细胞,蓝白斑筛选,质粒提取、酶切鉴定,连入GST融合表达载体,外源基因克隆到真核表达载体,GST融合蛋白表达,转化、活性测定,
20、转染真核细胞,表达定位,得到目的基因片段的T-A克隆,Northern印迹杂交是用于检测和量化细胞RNA的一种基本技术。它主要是将电泳凝胶中的RNA转移到尼龙膜上，通过紫外交联作用而使RNA与膜永久的结合在一起，固定在膜上的RNA样品与特异的探针杂交，从而对感兴趣的RNA进行定位。,Northern印迹杂交,Northern印迹杂交,一、DNA探针标记 在核酸分子杂交中，探针是指用放射性核素或其他标记物标记的核酸片段，它具有特定的序列，能够和待测的核酸片段互补结合，因此可用于检测核酸样品中的特定基因。,Northern印迹杂交,一、DNA探针标记 用于探针标记的标记物有放射性核素与非放射性核素
21、两大类，前者是目前最常用的标记方式；后者包括生物素、地高辛及荧光素等。,Northern印迹杂交,一、DNA探针标记核酸探针的标记方法：1.切口平移法2.随机引物法 这是近年来发展起来的较为理想的核酸探针标记方法。,Northern印迹杂交,一、DNA探针标记,Northern印迹杂交,一、DNA探针标记-随机引物法1.25ng DNA溶解在520l蒸馏水中，沸水浴 5min后，立即置于冰上。2在冰上加入以下成分：dATP 2l dGTP 2l dTTP 2l 随机引物Buffer 15l-32PdCTP 5l ddH20 至 49l,Northern印迹杂交,3加入1l Klenow Fra
22、gment，混匀，做 短暂离心。425孵育1hr。5加入5l终止液。,Northern印迹杂交,一、DNA探针标记-随机引物法注意事项标记探针的长度同加入核苷酸引物的量成反比采用本方法标记的探针的活性除取决于标记核苷酸的比放射活性及加入量外，还取决于合成DNA的拷贝数通过该方法获得的探针以双链的形式存在，在杂交反应前应进行变性。,Northern印迹杂交,二、RNA-甲醛凝较电泳（一）制胶（二）样品的准备（三）电泳,Northern印迹杂交,三、Northern印迹杂交,Northern印迹杂交,（一）转膜,转移液,纸巾,玻璃板,重物,Northern印迹杂交,（二）预杂交及杂交（三）曝光,Northern印迹杂交,探针标记,提取RNA,探针片段变性,探针片段变性,RNA-甲醛凝较电泳,转膜并进行交联,预杂交,杂交,曝光,RNA变性（60oC,15min）,
