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1、第二章 基因工程与食品产业,第一节 基因工程概述,第二节 工具酶与基因载体,第三节 基因工程的基本技术,第四节 基因工程在食品产业中的应用,第一节 基因工程概述,一、基因工程的概念与主要内容,二、基因工程的发展概况,元素组成:C、H、O、N、P（9%10%）,分子组成三部分,碱基(base)：嘌呤碱，嘧啶碱戊糖(ribose)：核糖，脱氧核糖磷酸(phosphate),二、核酸的化学组成,构成核酸的基本单位为核苷酸,核酸中的碱基分两类：,（1）嘧啶碱：胞嘧啶（C） 尿嘧啶（U） 胸腺嘧啶（T）（2）嘌呤碱：腺嘌呤（A） 鸟嘌呤（G）,核苷脱氧核苷,碱基,种类：,核苷,核糖,核苷酸(ribonu
2、cleotide),核苷/脱氧核苷,磷酸酯键,核苷酸的结构：,磷酸,5端,3端,核酸,复制(replication)是指遗传物质的传代，以母链DNA为模板合成子链DNA的过程。,亲代DNA,复制,子代DNA,参与DNA复制的物质,DNA复制系统,底物dNTP,聚合酶DNA-pol,模板解成单链单链的DNA母链,引物与模板互补的RNA片段,其它酶和蛋白质因子,底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP,聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶简写 为 DNA-pol,模板(template) : 解开成单链的DNA母链,引物(primer): 提
3、供3-OH末端使dNTP可以依次聚合,解螺旋酶引物酶单链DNA结合蛋白DNA连接酶等,半保留复制：新DNA分子中的两条链，一条来自亲代DNA分子，另一条是新合成的,转录 (transcription),生物体以DNA为模板合成RNA的过程 。,转录,RNA,DNA,此过程把DNA的碱基序列转抄成RNA 。,编码链,模板链,一、基因工程的概念与主要内容,（一）基因工程的概念,基因工程：运用酶学方法，将外源基因与载体DNA在体外进行重组，将形成的重组DNA转入受体细胞，使外源基因在其中复制表达，从而改造生物特性，生产出人类所需要的产物的高新技术。,食品基因工程：利用基因工程的技术和手段，在分子水平
4、上定向重组遗传物质，以改良食品的品质和性状，提高食品的营养价值、贮藏加工性状以及感官性状的技术。,（二）基因工程的主要内容,概括起来，基因工程的操作过程一般分4个步骤。,获得目的基因；将目的基因与载体连接形成重组DNA；将重组DNA导入受体细胞；筛选出能表达目的基因的受体细胞,酶,段,子,体,二、基因工程的发展概况,1972年，Berg等首次用限制性内切酶EcoRI切割病毒SV40 DNA和噬菌体DNA，经过连接，组成重组DNA分子。,1973年，Cohen将伤寒沙门氏菌抗链霉素质粒与大肠杆菌抗四环素质粒在体外重组，获得异源的重组质粒DNA，并把重组质粒导入大肠杆菌中，建立了抗四环素和抗链霉素
5、的大肠杆菌克隆体.,Paul Berg (who shared the 1980 Nobel Prize in chemistry for this work).,1972 Stanley Cohen and Herbert Boyer discover recombinant DNA technology, considered to be the birth of modern biotechnology,Herbert W. Boyer, Ph.D.,第一例基因工程实验,1972年美国加州大学的Boyer从大肠杆菌中发现了一种能够在特定位置上切割DNA分子的酶即限制性内切酶,1986年美
6、国和法国的科学家在世界上第一次进行了抗除草剂转基因烟草的田间实验。,经过几十年的发展，基因工程技术已走出实验室，基因工程技术的应用已发展成为一个巨大的产业，基因工程在农业、医药、食品、环保等领域已显示出巨大的应用价值。,在农业上，基因工程发展速度势头强劲。据统计，2000年全球转基因作物种植面积由1996年的170万hm2，增加到4420万hm2，增加了25倍之多。 2000年美国、加拿大、阿根廷、中国4个国家转基因作物的种植面积占全球种植面积的99.9。 全世界转基因作物按种植面积排序分别为大豆、玉米、棉花、油菜籽。,我国的农业基因工程研究于20世纪80年代初期开始启动，并于20世纪80年代
7、中期开始将生物技术列入国家“863高科技发展计划。我国正在研究的转基因植物种类达47种以上，涉及各类基因103个以上。目前我国被批准进行商品化生产的6种转基因植物：转基因耐贮藏的番茄、转查尔酮合成酶基因矮牵牛、抗病毒甜椒、抗病毒番茄、抗虫棉花和保龄棉等。,第二节 酶和基因载体,基因工程的操作，是依赖于一些重要的酶(如限制性内切酶、核酸酶、连接酶、聚合酶等)作为工具来对基因进行切割和拼接等操作，这些酶被称为工具酶(enzyme of tools)。到目前为止，常用的工具酶有300多种。,基因工程载体(carrier): 在细胞内具有自我复制能力的运载目的基因进入宿主细胞的运载体.,一、基因工程的
8、工具酶,种类主要有：限制性内切酶连接酶聚合酶核酸酶碱性磷酸酶逆转录酶 等,能将聚核苷酸链的磷酸二酯键切断的酶称为核酸酶。 核酸酶中倾向于将核酸内部的磷酸二酯键切断的酶，称为内切核酸酶。 内切核酸酶中能够识别DNA分子上某些特定的碱基序列并且将其切开的那一类酶，称为限制性内切酶 。 而核酸酶中从聚核苷酸链一端切割磷酸二酯键的酶称为外切核酸酶。,（一）限制性内切酶,在早期，要进行DNA分子的重组，染色体DNA通过带小孔的针头或通过超声波破碎为0.35kb的碎片，这种方法只是随机地切断DNA，无法确切地得到目的基因。自从在细菌中发现了一种能够在特定位置上切割DNA分子的酶以后，分子克隆才真正地得以发
9、展。,限制性内切酶是基因工程中不可缺少的工具酶，有人称之为“基因工程的手术刀”。 限制性内切酶切点专一，它作用于DNA分子，产生特异的DNA片段。,1、限制性内切酶的分类,根据限制性内切酶的结构和功能特性，分为三种类型。,I型限制性内切酶： 是多聚体蛋白质，具有切割DNA的功能，作用时需要ATP、Mg2+和S腺苷蛋氨酸(SAM)的存在。,切割DNA的方式是：先与双链DNA上未加修饰的识别序列相互作用，然后沿着DNA分子移动，在行进相当于10005000个核苷酸的距离之后在随机位置上切割单链DNA。由于这类酶不能专门切割DNA的某些特殊位点，所以未在基因工程操作中大量使用。,型限制性内切酶：,是
10、一类分子量较小的单体蛋白，作用时仅需要Mg2+存在即可维持活性，它可在特殊位点切割DNA，产生具有黏性末端或其他形式的DNA分子片段.这类酶被广泛地应用于基因工程,型限制性内切酶：,一些具有独特的识别方式和切割方法的内切酶，如Mbo，它识别GAAGA序列，然后在DNA的每一条链上识别序列的一侧开始测量一定距离(如8或7个核苷酸)以后进行切割，产生仅有一个碱基突出的3末端(N表示任意一个碱基)。,5 GAAGANNNNNNNN3 3CTTCTNNNNNNN5,I型限制性内切酶、 型限制性内切酶的切点不固定，不能产生可以利用的DNA片段型限制性内切酶具有可以控制和预测的位点特异性切割的性质，并且产
11、生固定的DNA片段。基因工程所用的限制性内切酶都是型限制性内切酶。,2、型限制性内切酶的命名与作用特点,其命名原则是：,用具有某种限制性内切酶的有机体学名缩写来命名，即：有机体属名的第一个字母(大写，斜体)和种名的前两个字母(小写，斜体)构成基本名称；株系数字通常都省略，但如果酶是存在于一种特殊的菌株中，在基本名称后面还应该加上菌株的名称符号；罗马数字用来表示从同一个细菌中分离出来的不同的限制性内切酶。,例如，EcoR I中的Eco表示从大肠杆菌(Escherichia coli)中分离出来的，R代表大肠杆菌的R株， I表示从中分离出的第一种限制性内切酶。,从流感嗜血菌(Hacmophilus
12、 influcnzac)中菌株d分离出来的3种限制酶，分别为HindI、Hind、Hind。,EcoRI是最早发现的型限制性内切酶，是从大肠杆菌中分离鉴定出来的。EcoRI可特异地结合在一段6个核苷酸的DNA区域里，在每一条链的鸟嘌呤和腺嘌呤之间切断DNA链。DNA链经EcoRI对称切割后会产生两个单链末端.,型限制性内切酶是一种位点特异性酶，能够识别双链DNA分子中的特异序列，并在特异部位上切断DNA分子。限制性内切酶的识别位点可以是4个、5个、6个、8个甚至更多的碱基对。这些DNA序列大多呈回文结构，也就是说，序列被正读和反读是一样的。,由于DNA具有双螺旋结构，识别核苷酸序列只能从 5末
13、端向3末端读其碱基序列，因此，在识别序列的两条核苷酸链中碱基排列次序是完全相同的，这种结构称回文结构。,限制性内切酶的切割方式,限制性内切酶按其切割双链 DNA方式分为两种：黏性末端和平整末端。,黏性末端:限制性内切酶错位切割DNA双链而形成互补的单链末端。或双链DNA中没有配对的碱基末端，被称为黏性末端,平齐末端:有些限制性内切酶在同一位点平齐切割DNA两条链，而形成两端平整的DNA分子.,cDNA是在逆转录酶催化作用下，在体外以mRNA为模板合成的互补DNA。,从真核生物中分离纯化所有的mRNA，接着以mRNA为模板反转录合成cDNA，随之将cDNA与相关载体连接，使每一个cDNA分子都与
14、一个载体分子连接成重组DNA。然后导入宿主细胞进行扩增，得到分子克隆的混合体，这样一个混合体就称为cDNA文库。,cDNA文库:指某种特定细胞及特定状态下的全部cDNA克隆。,2、DNA连接酶,DNA连接酶: 能将两段DNA拼接起来的酶,该酶催化DNA相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，将DNA单链缺口封合起来。 大肠杆菌和动植物细胞中都有DNA连接酶。 基因工程中常用的连接酶主要有：T4DNA连接酶和大肠杆菌连接酶，而以前者为最常用。,T4DNA连接酶的相对分子质量为68000的单个多肽链，是T4噬菌体感染大肠杆菌而产生的。在连接反应中多以ATP为辅助因子。,3、DNA聚合酶 (D
15、NA polymerase),基因工程中常用的DNA聚合酶有：大肠杆菌聚合酶I(全酶)；大肠杆菌聚合酶I大片段(Klenow片段)；T4噬菌体DNA聚合酶；T7噬菌体聚合酶及经修饰的T7噬菌体聚合酶(测序酶)；,在细胞内的DNA复制过程中起着重要的作用。它们通常被分为DNA聚合酶I、三类。DNA聚合酶I是基因工程中最常用的工具酶。,耐热DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)；末端转移酶(末端脱氧核苷酸转移酶，也属DNA聚合酶)；逆转录酶(依赖于RNA的DNA聚合酶)。,DNA连接酶与聚合酶的区别,DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个
16、DNA片段之间形成磷酸二酯键。 DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板。,（1）大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶),DNA聚合酶I的相对分子质量为109000，是一条约1000个氨基酸残基的多肽链。它具有三种活性：,5 3 DNA聚合酶活性；3 5外切核酸酶活性；5 3 外切核酸酶活性。,核酸外切酶活性,3 5外切酶活性能辨认错配的碱基对，并将其水解。,5 3 外切酶活性能切除突变的 DNA片段。,合成中的DNA分子,(2）大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段),Kle
17、now片段是用枯草杆菌蛋白酶裂解完整的DNA聚合酶I产生的，也可通过克隆技术而获得。 它的相对分子质量是76000，为一条单多肽链。 具有5 3聚合酶活性和3 5外切酶活性，而无5 3外切酶活性。,Klenow片段的主要用途,补平限制性内切酶切割DNA产生的3凹端；用32PdNTP补平3凹端，对DNA片段进行末端标记；对带3突出端DNA进行末端标记；cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链；在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA；应用双脱氧链末端终止法进行DNA测序。,（3）T4噬菌体DNA聚合酶,相对分子质量为114000具有53聚合酶活性及35外切核酸酶活性但其35外切酶活性对单链DNA
18、的作用比对双链DNA的作用更强，而且外切核酸酶活性比Klenow片段要强200倍。,主要用途,补平或标记限制性内切酶切割DNA后产生的3凹端；对带有3突出端的DNA分子进行末端标记；标记用作探针的DNA片段；将双链DNA的末端转化成为平端；使结合于单链DNA模板上的诱变寡核苷酸引物得到延伸,（4）T7噬菌体DNA聚合酶及其改造的测序酶,该酶是所有已知DNA聚合酶中持续合成能力最强的一个，它所催化合成的DNA的平均长度要比其他DNA聚合酶催化合成的DNA平均长度大得多。它的35外切核酸酶活性约为Klenow片段的1000倍，但它没有53外切核酸酶活性。,主要用途：,用于拷贝长段模板的引物延伸反应
19、；通过补平或交换(置换)反应进行快速末端标记。,（5）耐热DNA聚合酶(TaqDNA),相对分子质量为65000是一种耐热的依赖DNA的DNA聚合酶。具有53外切核酸酶活性主要用途：DNA测序；聚合酶链式反应(PCR)对DNA片段进行体外扩增,。,（6）末端转移酶,催化脱氧核苷酸添加到DNA分子的3-OH末端上催化作用不要求有模板，但需有Co2+的存在。末端转移酶可给一些DNA分子的3-OH末端接上寡dA或dG；另一些DNA分子的3-OH末端接上寡dT或dC，混合这些分子，即可使同聚物尾部退火形成环状分子。主要用途：,给载体或cDNA加上互补的同聚尾；DNA片段3末端的放射同位素标记。,4.碱
20、性磷酸酯酶,碱性磷酸酯酶：是催化从单链或双链DNA和RNA分子中除去5磷酸基，即脱磷酸作用。,在基因工程中得到广泛使用的有两种：一种是BAP：从大肠杆菌中提取的另一种是CIP：从牛小肠提取的。两种酶反应均需要Zn2+。由于BAP耐热，而CIP在70加热10分钟或经酚抽提则失活；CIP的特异活性较BAP高10-20倍，因此，CIP应用更广泛。,主要用途：,去除DNA和RNA的5磷酸基，产生5羟基末端，然后在T4多聚核苷酸激酶催化下，用-32PATP进行末端标记，继而进行序列分析；去除载体DNA两末端的5磷酸基，防止载体DNA自我环化，提高DNA重组率。,5. S1核酸酶,是一种特异性单链核苷酸外
21、切酶，能降解单链DNA和单链RNA，不能降解其双链DNA或RNA的杂合子。,主要用途：,去除DNA片段的单链突出端，使之成为平端；去除cDNA合成时形成的发夹结构；进行S1核酸酶保护试验，分析转录产物；成熟 mRNA与基因组DNA杂交后，结合S1核酸酶水解，可确定内含子在基因组DNA中的定位；修整渐进性删除突变的末端。,6.逆转录酶 (reverse transcriptase),逆转录酶又称依赖RNA的DNA聚合酶。该酶催化以单链RNA为模板生成双链DNA的反应。由于这一反应中的遗传信息的流动方向正好与绝大多数生物转录生成方向(即以DNA为模板转录生成RNA的方向)相反，所以此反应称为逆转录
22、作用。,逆转录酶具有三种活性：,RNA指导的DNA合成反应；DNA指导的DNA合成的反应；RNA的水解反应。,二、基因工程载体,理想的基因工程载体应具备以下特征：,(1)能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。在外源DNA插入其DNA之后，仍能保持稳定的复制状态和遗传特性。,(2)易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。,（3）在其DNA序列中有适当的限制性内切酶单一酶切位点，这些位点位于DNA复制的非必需区内，可以在这些位点上插入外源DNA，但不影响载体自身DNA的复制。,(4)具有能够直接观察的表型特征，在插入外源DNA后，这些特征可以作为重组DNA选择的标志。,常见的基因载体有： 细菌质
23、粒载体噬菌体载体柯氏质粒载体病毒载体 等,（一）质粒载体 (plasmid),质粒：是存在于染色体外能独立复制，稳定遗传的一种环状双链DNA分子。质粒DNA分子可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在特定情况下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到子一代。,质粒广泛分布于原核生物细胞中，也存在于某些真核细胞中。一个细胞内质粒的数量变化很大，有一至几个，也有几十个，甚至数百个。,质粒的大小差异很大，小的不到1kb，大的超过500kb。几乎所有的细菌株系都含有质粒。 质粒的类型 F质粒：携带帮助其自身从一个细胞转入另一个细胞的信息质粒 R质粒：表达对一种抗生素抗
24、性的质粒；降解质粒：携带参与或控制一些不同寻常的代谢途径基因的质粒,质粒的命名：,通常用一个小写的p来代表质粒，而用一些英文缩写或数字来对这个质粒进行描述。 以PBR322为例，BR代表研究出这个质粒的研究者Bolivar和Rogigerus，322是与这两个科学家有关的数字编号。,构建一种质粒载体，对质粒通常有以下几个方面的要求：,（1）质粒载体的相对分子质量应尽可能小。,（2）应该有用来克隆外源DNA的单一的限制性内切酶识别位点；,（3）应该有一个或多个选择标记基因。,（5）具有复制起始点,（4）质粒拷贝数较高。,几种常用的质粒载体,1、质粒载体pBR322,2、质粒载体pUCl9,3、酵
25、母质粒载体,4、农杆菌质粒栽体,(1)土壤农杆菌Ti质粒 (2)土壤发根农杆菌Ri质粒载体,（二）噬菌体载体,细菌质粒载体最大可以克隆的DNA片段一般在10kb左右，若要构建一个基因文库，往往需要克隆更大一些的DNA片段，为满足这一要求，人们把噬菌体发展成为一种克隆载体。,1.噬菌体的特点,噬菌体(phage)：寄生在细菌中的病毒，又称细菌病毒。噬菌体由蛋白质外壳和头部外壳内的DNA组成。,噬菌体作为载体，可插入1020kb甚至更大的一段外源DNA片段。由于噬菌体具有较高的增殖能力，有利于目的基因的扩增，从而成为当前基因工程研究的重要载体之一。其中噬菌体就是目前基因克隆中最常用的一种。,2.噬
26、菌体,噬菌体是一种温和噬菌体，在其生活史中，它将DNA注入大肠杆菌之后，可以进入溶菌和溶源两种循环。当噬菌体进入裂解循环，20min后就可使宿主细胞发生裂解，同时释放出大约100个噬菌体颗粒。当噬菌体进入溶源循环，即注入的DNA整合到大肠杆菌的染色体中，与染色体一起复制，而并不给寄主带来任何危害。当在某种营养条件或是环境胁迫条件下，整合的噬菌体DNA可以被切割出来，进入裂解循环 。,噬菌体是一种线状双链分子，长约50 kb，具有60多个基因，基因组分几个不连续的区域，,噬菌体DNA大约50 kb，其中大约20 kb对于整合/切割过程极为关键，称为整合/切割（I/E）区域。对于构建基因文库来说，
27、可将这20 kb DNA片段去掉，强迫重组的噬菌体进入裂解循环。,3. M13载体,M13载体：是一种细丝状的特异性的大肠杆菌噬菌体，又叫单链噬菌体载体。 它含有6kb7kb的单链环状DNA，在基因和V之间(共有10个基因)有一个508bp的非必需区，可插入外源DNA而不影响噬菌体的增殖。,M13作为载体有两个特性： 一是允许包装大于病毒单位长度的外源DNA。二是感染细菌后，复制环状DNA经包装形成噬菌体颗粒，分泌到细胞外而不溶菌。 这些特性不仅便于分离单链的DNA，而且在产生大量的单链DNA中，含有外源DNA序列。因此，可用于DNA序列分析，用于制备杂交探针，用于定点突变等,（三）黏性质粒载
28、体,也有人称柯斯质粒，是指含有抗性基因、单克隆位点以及DNACOS位点的细菌质粒。 柯斯质粒可克隆携带40kb大小的DNA片段，并在大肠杆菌中复制保存。因此柯斯质粒综合了质粒载体和噬菌体载体二者的优点。柯斯质粒上有多个单克隆位点(RE2)，两个COS位点，即DNA复制启始位点和抗生素抗性基因，在两个COS位点之间还有一个限制性内切酶位点（REl）。,重组噬菌体的DNA进入大肠杆菌之后，由于进入头部时两个COS位点都已被切割掉了，它们通过碱基配对可以将整个DNA分子变成一个环状的质粒分子。复制起始位点的存在又可以保证其在宿主细胞中稳定复制保存，转化的细胞可以通过抗生素进行筛选。柯斯质粒适用于作基
29、因簇和大基因的克隆。,第三节 基因工程的基本技术,一、目的基因的获得与序列分析,（一）目的基因的获得,基因工程主要是通过人工的方法，分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，以获得有价值的基因产物。目的基因的分离是基因工程操作的第一步。,通常，我们把插入到载体内的非自身的DNA片段称为“外源基因”(foreign gene)。 目的基因(objective gene)：又叫靶基因(target gene)，是指根据基因工程的目的,设计的所需要的某些DNA分子片段，它含有一种或几种遗传信息的全套密码(code),目前采用的分离、合成目的基因的常用方法有：,1.鸟枪法（霰弹枪法）,具体做法是：首先利用
30、物理方法（如剪切力、超声波等）或酶化学方法（如限制性内切核酸酶）将生物细胞染色体DNA切割成为基因水平的许多片段，而后将这些片段与适当的载体结合，将重组DNA转入受体菌中扩增，获得无性繁殖的基因文库，再结合筛选方法，从众多的转化子菌株中选出含有某种基因的菌株，从中将重组的DNA分离、回收。 这种方法也就是应用基因工程技术分离目的基因。其特点是绕过直接分离基因的难关，在基因组DNA文库中筛选出目的基因。,2.物理化学法,利用核酸DNA双螺旋之间存在着碱基G和C配对、A和T配对的这一特性，从生物基因组分离目的基因的方法。 常用的分离基因的物理化学法主要方法有：密度梯度离心法；单链酶法；分子杂交法。
31、,（1）密度梯度离心法： 根据液体在离心时其密度随转轴距离而增加，碱基GC配对的双链DNA片段密度较大，利用精密的密度梯度超离心技术可使切割适当片段的不同DNA按密度大小分布开来，进而通过与某种放射性标记的mRNA杂交来检验，分离相应的基因。,（2）单链酶法： 碱基GC配对之间有三个氢键，比AT配对的稳定性高。当用加热或其他变性试剂处理DNA时，双链上AT配对较多的部位先变成单链，应用单链特异的S1核酸酶切除单链，再经氯化铯超速离心，获得无单链切口的DNA,（3）分子杂交法： 单链DNA与其互补的序列总有“配对成双”的倾向，如DNA：DNA配对或者DNA：RNA配对，这就是分子杂交的原理。 利
32、用分子杂交的基本原理既可以分离又可以鉴别某一基因。,3.化学合成法,是以单核苷酸为原料，在体外用化学方法按照已知基因的碱基顺序合成DNA短片段，再依次连接成完整的目的基因链。此法必须预先知道目的基因或其mRNA或蛋白质的一级结构，即核苷酸或氨基酸的顺序。 为了保证定向合成，需要将一个分子的5端与另一个分子的3端封闭保护。这种封闭可用磷酸化等方法，必要时可以酸或碱解除封闭。,化学合成法的最大优点是能按照人们的意愿合成突变基因。但有局限性，要合成较长链的 DNA分子尚有困难。 随着现代科学技术的发展，基因工程操作仪器设备也不断更新。如日本Zeon公司已成功制成并出售“全自动DNA合成仪” ，精工电
33、子工业公司的“ DNA序列仪”。 目前单链DNA短片段的合成已经成为分子生物学和生物技术实验室的常规技术了。,4.酶促逆转录合成法,酶促逆转录合成法即利用逆转录酶以mRNA为模板合成相应的DNA方法。 主要用于合成分子量较大而又不知其序列的基因。这种方法是以目的基因的mRNA为模板，借助逆转录酶合成互补的DNA(cDNA)，再在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段，与适当的载体结合后转入受体菌，扩增为cDNA文库。然后，采用适当的方法从cDNA文库中筛选出目的基因。 如 ：1972年采用逆转录酶合成了家兔和人球蛋白的cDNA。,5.PCR扩增法,当巳知目的基因的序列时，通常利用多聚酶链式反
34、应(PCR)技术来分离目的基因。它能快速、简便地在体外扩增特定的DNA片段，具有高度的专一性和灵敏度。,PCR反应体系应具备的条件： （1）要有与被分离的目的基因的DNA双链两端序列相互补的DNA引物(约20个碱基左右)； （2）具有热稳定性的酶如TaqDNA聚合酶； （3）dNTP； （4）作为模板的目的DNA序列。一般PCR反应可扩增出1005000bp的目的基因。,PCR反应过程包括：,1.DNA变性（90-96）：双链DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链DNA2.退火（25-65）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。3.延伸（70-75）：在Taq DNA聚合酶（
35、在72左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5端3端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。如此反复进行约30个循环左右，即可扩增得到目的DNA序列,（二）DNA序列测定,DNA序列分析(DNA sequencing)：指对某一段DNA分子或片段的核苷酸排列顺序测定，也就是测定组成DNA分子的A、T、G、C的排列顺序。 测序也常常用于对重组DNA的序列分析，其结果是最直接、最客观反映重组DNA中有无目的基因的方法。,核苷酸序列测定的方法有：化学降解法酶促法（双脱氧终止法）自动测序法PCR测序法,1.化学降解法,也叫Maxam-Gilbe
36、rt法。原理：用一些特殊的化学试剂，分别作用于DNA序列中四种不同的碱基。这些碱基经过处理后，在核苷酸序列中形成的糖苷键连接变弱，因此很容易从DNA链上脱落下来。丢失了碱基的核苷酸链再经适当处理，就可在缺失碱基处断裂。在进行这些反应时，将反应条件控制在每条DNA链断开一处，因此经过处理，产生一系列长短不等的DNA片段。根据所用的试剂不同，其末端分别为G、A、C、T，再对一系列这样的片段进行综合分析，就可测得DNA分子中的核苷酸排列顺序。,2.酶促法,又叫Sanger法和链终止法。原理：先将DNA分子用限制性内切酶切割成片段，然后用电泳依其长短不同分离，钝化单股片段，以32P标记其5末端，并用以
37、作为复制其互补片段的模板，在复制过程中，利用从大肠杆菌提取的DNA聚合酶经过枯草杆菌蛋白酶处理而得的大片段，以复制互补单股DNA，从而求得其序列。,3.自动化测序法,Prober等1987年将链终止法加以改进，并与电子计算机程序的自动化技术相结合，加快了序列测定，并且不用放射性同位素标记脱氧核苷酸，避免了放射线对操作者的危害。,实际做法：在每种脱氧核苷酸上分别都以共价键接上不同荧光染料，然后与四种三磷酸核苷在同一器皿中，依照上述链终止法条件进行，即会复制出一系列不断增加较长一点的多聚脱氧核苷酸链，其3末端都各自带有特色荧光染料的双脱氧核苷酸，为了测定序列，将反应混合物在一条道上进行凝胶电泳，结
38、果这条道上出现一系列有荧光的带。,这些有荧光的带中每一条都代表一个碱基在复制链中所在的位置。凝胶荧光测定体系由电子计算机控制。这个体系是用激光激发不同颜色的染料所发生的荧光，用短波长的蓝光及长波长的红光分别测量荧光强度之比值，测定在复制链中各碱基的位置，从而得到DNA的序列。 熟练的操作者用这种方法一天可测1000个以上的碱基，而现在其他测序方法一般一人一年只能测50000个碱基。这种方法因用电子计算机控制，自动化操作，大大缩短测定时间，而且结果准确可靠，是目前最优越的测序方法。,二、目的基因与载体的连接,通过不同的途径获取了目的基因，选择或构建适当的基因载体之后，基因工程的下一步工作是如何将
39、目的基因与载体连接在一起，即DNA的体外重组。基因重组是基因工程的核心。,基因重组(gene recombination)，就是将目的基因与载体DNA两者连接起来。这种连接主要靠T4DNA连接酶。,通常连接的形式有：黏性末端连接平端连接人工接头连接同聚物加尾连接,（一）黏性末端连接黏性末端连接有两种情况。,同一限制性内切酶酶切位点连接 由同一限制性内切酶切割的不同DNA片段，会产生具有完全相同的黏性末端，在适合条件下。单链黏性末端间进行碱基配对形成双链，然后在T4DNA连接酶催化作用下使之共价连接，形成的重组DNA分子。,不同限制酶切位点连接 由两种不同的限制性内切酶切割的DNA片段，产生具有
40、相同类型的黏性末端，彼此称为互补末端，也可以产生末端连接。,（二）平端连接 一些内切酶如Hae和HpaI切割产生的DNA片段是平齐末端。具有平齐末端的酶切载体只能与平齐末端的目的基因连接。 T4DNA连接酶可催化相同和不同限制性内切酶切割的平端之间连接。,（三）人工接头连接 人工接头是人工合成的具有特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。将其接在目的基因片段和载体DNA上，使它们具有新的内切酶位点，应用相应的内切酶切割，就可以分别得到互补的黏性末端。,（四）同聚物加尾连接,利用末端转移酶(也称DNA转移酶)在DNA片段上制造一个粘性末端的方法。如在目的基因片段的3末端添加一小段同
41、聚物 (如dA碱基)，在载体3末端添加一小段同聚物 dT，形成碱基配对，而后在T4DNA连接酶催化作用下使之共价连接，形成的重组DNA分子。,三、重组DNA向受体的转化,在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后，下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选，获得大量的重组DNA分子，这就是外源基因的无性繁殖，即克隆(cloning)。,由于外源基因与载体构成的重组DNA分子性质不同、宿主细胞不同，将重组DNA导入宿主细胞的具体方法也不相同。,常用的受体细胞以细菌为主，其中主要有大肠杆菌、枯草杆菌,重组DNA导入受体细胞的方法有：,（1）转化：是将重组质粒DNA导入受体细胞，使受体遗传性状
42、发生改变的方法；,（2）转染：是指噬菌体、病毒、或以其为载体构建的重组DNA导入细胞的过程。 (其中又分磷酸钙沉淀法与体外包装法),磷酸钙沉淀法,利用磷酸钙-DNA共沉淀，把外源基因与噬菌体DNA的重组分子导入大肠杆菌和哺乳动物细胞，简称磷酸钙沉淀法。细胞具有摄取磷酸钙沉淀的双链DNA的能力，几乎所有的双链DNA都可以通过这种方法导入细胞，而且可在电子显微镜下清楚地看到细胞吞噬DNA-磷酸钙复合颗粒。此法的转染效率远远不如体外包装法。,体外包装转染法,体外包装：指在体外将重组DNA放置到噬菌体的蛋白质外壳里，然后通过正常的噬菌体感染过程，将它们导入宿主细胞。将重组DNA噬菌体包装成噬菌体颗粒，
43、使其能够感染细菌，并在宿主菌体内扩增和表达外源基因。,又称之为直接显微注射。一般是用微吸管吸取供体DNA溶液，在显微镜下准确地插入受体细胞核中，并将DNA注射进去。此法常用于转基因动物的基因转移。,（3）微注射技术：是将外源基因直接注射到真核细胞内的方法；,（4）电转化法,也有人称做高压电穿孔法（简称电穿孔法），即在受体细胞上施加短暂、高压的电流脉冲，使质膜形成纳米大小的微孔，DNA能直接通过这些微孔，或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布而进入细胞质中。该法可用于真核细胞(如动物细胞和植物细胞)和原核细胞(转化大肠杆菌和其他细菌等)的外源DNA的直接导入。电穿孔法具有简便、快速、效率高
44、等优点,又称高速微型子弹射击法、微弹射击法、高速粒子轰击法基本原理：将DNA吸附在微型子弹(1m)的表面通过放电或机械加速，使子弹射入完整的细胞或组织内。 基本做法：先将外源DNA溶液与钨、金等金属微粒(直径0.5-5m )共同保温，使DNA吸附于金属颗粒表面，然后放电加速金属颗粒，使之以400m/s的速度直接喷射受体细胞，外源遗传物质随金属颗粒进入细胞内部。,（5）基因枪技术,（6）脂质体介导法,（7）其他方法：很多高效的新颖的导入方法，如加速冷冻法、碳化硅纤维介导法等正在研究并逐渐达到实用水平。,脂质体(又叫做人工膜泡)作为体内或体外输送载体的方法，一般都需要将DNA或RNA包囊于脂质体内
45、，然后进行脂质体与细胞膜的融合，通过融合导入细胞。,受体细胞：也叫宿主细胞，是指在转化、转导、杂交中接受外源基因的细胞。分为原核受体细胞(最主要是大肠杆菌)、真核受体细胞 (最主要是酵母菌)、动物细胞和昆虫细胞(其实也是真核受体细胞)。,具有接受外源DNA的能力；为限制性内切酶缺陷型菌珠或为DNA重组型菌珠 ；在标记上和载体对应；有利于表达；不适宜在人体或非培养条件下生存，有利于安全。,大肠杆菌是目前基因工程中最常用的受体细胞。通常采用的是大肠杆菌的感受态细胞，即在冰浴中用一定浓度的CaCl2处理对数生长期的大肠杆菌，以获得高效转化的感受态细胞。也有采用Rb+、Mn2+、K+、二甲亚矾、二硫苏
46、糖醇(DTT)或用氯化己胺钴处理制备感受态细胞。,感受态是指受体细胞能吸收外源DNA分子而有效地作为转化受体的某些生理状态。一般受体细胞在对数生长期转化能力最强。,四、重组体的筛选与外源基因的鉴定,（一）重组体的筛选,基因克隆的下一道工序是：从转化细菌菌落中筛选含有阳性重组DNA分子的菌落，并鉴定重组DNA分子的正确性。,1、针对遗传表型筛选,按载体的性状变化进行筛选根据插入基因的遗传性状进行筛选。,2、根据重组子的结构特征筛选,快速裂解菌落，鉴定分子大小内切酶图谱鉴定PCR筛选重组子核酸分子杂交,（二）重组体的鉴定,经过转化的重组体，如转基因微生物、转基因动物和转基因植物细胞，经过培养在其形
47、成了一定的菌株、品系之后，就需要对它们进行鉴定，检验它们在生长发育、传种接代过程中是否保留了已获得的外源基因。,1、报告基因的检测法,是一种快速而简易地区分转基因生物和非转基因生物的方法。报告基因检测法：指在构建目的基因时将一种报告基因(如GUS基因)构建在一起，当目的基因转入受体细胞时，报告基因一同被转入。,报告基因：是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。,2、分子杂交技术,为了从分子水平鉴定目的基因是否已经整合到受体细胞中，是否转录，是否表达，经常用到基因探针杂交技术。即用已知基因片段(往往是目的基因片段)制作的探针，与待测样品的基因片段进行
48、核酸分子杂交，从而判断二者的同源程度。目前已广泛应用于食品生物技术的研究中。这种技术通常包括原位杂交、点杂交、Southern吸印杂交、Northern吸印杂交、Western吸印杂交等。后三者需要琼脂糖凝胶电泳与分子杂交相结合的分析手段。,（1）点杂交：将待测DNA或RNA或细胞裂解物变性后直接点在硝酸纤维素膜上，不需限制性酶进行酶切，即可与探针进行杂交反应。该技术对于基因拷贝数多的样品很适合，具有间接快速的特点，一般可作大批量样品的筛选。,（2）Southern吸印杂交：是1975年由Southern首创的，以后又由多人改造，目前被认为是最经典和应用最广泛的杂交力方法。根据基因探针与待测D
49、NA限制酶的酶解片段杂交带谱，可以直接确定是否已经转入受体细胞并接合到受体细胞的基因组中。,基本原理和操作过程是：提取重组体DNA，限制性酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，在碱溶液中使DNA变性即双链变为单链，再经毛细管虹吸作用被原位转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，将膜上的DNA烤干，固定后加入杂交液和标记探针进行杂交，洗去多余探针，在X光底片上放射自显影。,（3）Northern吸印杂交基本原理与Southern大致相同，只是检测的对象不是DNA，而是RNA。具体做法是：提取重组体总RNA或mRNA，在强变性剂如甲基汞或甲醛存在的情况下(防止RNA形成二级结构环)，进行琼脂糖凝胶电泳，电泳后，将电泳分
50、离开的RNA原位吸印到经化学处理过的纸或硝酸纤维素膜上，用同位素标记的探针进行杂交，然后放射自显影，根据X光片上的条带，可以了解与探针互补的RNA的大小及数量。由于RNA比DNA更易受到各种因素的降解，整个操作过程必须十分小心，按规程操作。对转基因生物Northern杂交显示阳性，说明外源基因已经转入受体基因组中，并且顺利地进行转录，形成mRNA。,（4）Western吸印杂交：主要用于检测外源基因在转化细胞中的表达情况，即是否进行了翻译，产生了外源基因所编码的蛋白质。具体做法是：提取重组体蛋白质，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，然后将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶上原位转移到硝酸纤维素膜上，
