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1、第六章 兽药残留检测技术,第四节 抗生素类药物残留的危害分析与检测方法,一、氨基糖苷类二、四环素类三、氯霉素类四、大环内酯类五、林可霉素类,一、氨基糖苷类抗生素,氨基糖苷类抗生素是由链霉菌或小单孢菌培养液中提取,或以天然品为原料半合成制取而得的一类水溶性较强的碱性抗生素。包括链霉素、双氢链霉素、新霉素、庆大霉素、卡那毒素、阿米卡星、阿布拉霉素、斑伯霉素、妥布霉素、壮观霉素等,结构式见图。由于其分子结构中都有一个氨基环醇环和一个或多个氨基糖分子,由配糖键相连接,因此最好称为氨基糖苷-氨基环醇类(Aminoglycoside-Aminocyclitol)抗生素,但因氨基糖苷类抗生素这一名称沿用已久
2、，故仍用此名。,氨基环醇,氨基糖,氨基糖,从抗菌作用的特点看,氨基糖苷类是一类较优良的抗生素,然而,该类药物的治疗浓度范围窄,不良反应较常见,主要为肾毒性、耳毒性、神经肌肉阻滞、造血系统毒性反应和过敏性反应,其中有些是不可逆毒性。氨基糖苷类肌肉注射或静脉滴注吸收,内服后不吸收或很少吸收。与血浆蛋白结合很少,主要分布在细胞外液。肾脏皮质内药物浓度可超过血药浓度1050倍,也可进入内耳外淋巴液,其半衰期较血浆半衰期长56倍。氨基糖苷类药物在体内几乎不被代谢，约90%以原形经肾小球过滤排出,尿药浓度极高,约为血浆峰浓度的25100倍。,靶组织,检测物,例如：卡那霉素,卡那霉素对耳毒性、肾毒性的发生率
3、较高,仅次于新霉素。卡那霉素肌注,1h血药浓度达峰值,血浆蛋白结合率很低。用药后24h内有90%的药物经肾以原形排泄。卡那霉素可透过胎盘进入羊水和胎儿循环中,在牛奶中可检测到。牛、羊、猪肌注,1日510mg/kg,分为2次给予,间隔12h,36h后牛奶中观测不到卡那霉素残留,肾脏中药物滞留期长。,靶组织,检测物,链霉素、双氢链霉素,链霉素和双氢链霉素对肾毒性反应稍轻,但可引起神经性紊乱,如听力减退、耳鸣或耳部胀滞、眩晕、麻木、针刺感、面部灼伤感;偶可发生生理力减退、皮疹、乏力、呼吸困难等。链霉素和双氢链霉素内服吸收差,大部分以原形随粪便和尿液排出。牛、羊、马肌注后,血药浓度于1h达到峰值。一次
4、肌注有效浓度可维持12h。24h内,30%90%的药物以原形经肾排出。注射部位和肾脏中链霉素残留滞留期较长,其他可食部分残留量低,停药期不必很长。乳牛肌注双氢链霉素后不久,乳汁中残留量很低,在0.050.13ng/g间。乳房注入不吸收,药物滞留期应予注意,以免乳汁中残留超标。,靶组织,壮观霉素、新霉素,壮观霉素毒副作用较小,无明显的耳毒性,但可引起肝、肾和血液系统紊乱,偶可发生过敏性反应。壮观霉素主要以原形药物由肾排泄,半衰期约为2.5h。肝和肾中代谢物主要为双氢壮观霉素和壮观霉素。肝和肾中药物残留量高,滞留期约15天。新霉素几乎不被胃肠道吸收,乳腺很少吸收。药物不经胃肠道给予,体内药物生物转
5、化很小。内服大部分以原形随粪便排出,注射吸收迅速,很快随尿液排出。新霉素在动物可食部分、鸡蛋、牛奶中药物滞留期长应予注意。,靶组织,靶组织,（一）样品处理,用塑料器皿盛放,难以用有机溶剂提取,脱脂除蛋白,液液萃取在水相中或加入离子对试剂进入有机相,阳离子交换吸附剂进行固液萃取,生物样品预处理,生物样品预处理是除去混杂物以免污染色谱柱和干扰氨基糖苷类的分离、分析。样品的预处理包括脱脂除蛋白、提取、净化和样品浓缩。生物样品中氨基糖苷类药物仍具有水溶性质,难以用有机溶剂提取,因此首先必须用蛋白沉淀剂或固相萃取柱除去生物组织(如蛋白质、脂肪等)。含脂高的生物样品一般在提取前先除去脂类。体液样品脱脂可采
6、用离心或正己烷提取。固态样品(如肌肉、肾、肝)处理相对复杂些,包括匀浆、提取/脱脂等步骤。,除蛋白的方法：,一是沉淀法,即在样品溶液中加入甲醇/盐酸溶液沉淀蛋白质。二是酸提取法,即在样品中加入三氟乙酸、三氯乙酸、三氯乙酸/柠檬酸盐、高氯酸溶液沉淀蛋白质,将生物样品与酸溶液混匀或一起均质。某些情况下,如测定肾脏中阿布拉霉素,还需用浓氢氧化氨溶液对蛋白进行水解,保证有较好的样品回收率。蛋白水解包括酸解法或碱解法,上清液再经中和。三是超滤法,经超滤法处理后的样品不会引入新的盐类污染及假色谱峰。四是固相萃取法,这是近年来在残留分析中应用最广的一种快速、简便的除蛋白方法。,1、提取,用高或低的pH值介质
7、可有效提取生物样品中氨基糖苷类药物。酸性介质：三氯醋酸、三氟醋酸、高氯酸、三氯醋酸-柠檬酸或甲醇-高氯酸溶液与样品一起均质、提取。碱性介质：如甲醇-氢氧化氨溶液提取猪肾组织中的阿布拉霉素。食品中氨基糖苷类药物的提取,可加入碱性缓冲液,并加热脱去蛋白,达到提取的目的。,2、净化,净化方法包括液-液分配、固相萃取和基质固相分散技术(MSD)、在线痕量富集法等。有时为了达到更好的净化效果,通常将几种方法结合应用。液-液分配是将干扰组分从水相直接转移至有机相中。由于氨基糖苷类的高极性,在pH范围内不能被提取到有机相中,仍留在水相中。唯一例外的是阿布拉霉素,在辛烷磺酸离子对试剂介质中,可以用乙酸乙酯进行
8、提取,提取回收率约90%。,固相萃取法是近年发展起来的一种更有效、迅速和方便的提取及除蛋白方法。氨基糖苷类药物的浓缩和净化采用阳离子交换吸附剂较为理想,如CM-Sephadex C-25、Amberlite CG-50、苯磺酸基、羧基阳离子交换柱等。正相或反相色谱吸附剂也能对样品进行提取和净化,如C18固相萃取柱净化时,提取液中预先加入适当庚烷磺酸离子对试剂,以提高氨基糖苷类抗生素的保留能力。基质固相分散技术应用相对较少,柱切换技术：采用在线痕量富集技术对初提取液进行净化,在含离子对试剂的流动相中,预柱(C18柱)对链霉素和双氢链霉素进行富集,干扰组分被淋洗除去,最后待测物被洗脱进入分析柱中。
9、与预富集过程相反,在酸性流动相中,阳离子交换柱对干扰组分有吸附作用，不被保留的壮观霉素直接进入分析柱进行分离检测。,（二）分析方法,1、气相色谱法气相色谱已被用于测定血清中的庆大霉素、妥布霉素、萘替米星和丁胺卡那霉素。样品脱蛋白和脱水后,用三甲基硅咪唑和七氟丁酰咪唑分两步衍生化,然后用电子捕获检测器（ECD）检测。还有报道采用三氯乙酸提取和离子交换净化的方法测定牛肉组织中的卡那霉素,提取液用七氟丁酰咪唑衍生化,随后用三甲基硅烷化,GC/ECD检测,回收率为74%86%,检测限为0.1mg/kg。,2、液相色谱法,氨基糖苷类药物可采用阳离子交换色谱柱或非极性反相色谱柱分离。由于氨基糖苷类药物的极
10、性和离子特征,它们在阳离子交换柱上的分离效果较佳,在反相色谱柱上不易分离。但在反相色谱分离中,流动相中加入离子对试剂如磺酸钠或五氟丙酸,可以改善它们在C18柱上的分配性能。也可在反相柱分离前,将氨基糖苷类药物衍生化,使极性下降,以改善其在色谱柱上的分配性能。使用C8和C18分离柱,流动相一般由醋酸盐缓冲液和甲醇或乙腈组成,加入离子对试剂可以改变出峰顺序和改善峰形。,高效凝胶渗透色谱法亦应用于牛奶中氨基糖苷类药物的测定。利用蛋白排阻柱(Hisep)选择性地保留新霉素(进入凝胶孔穴中),而蛋白质分子不能进人凝胶的孔穴中,随流动相由固定相间隙通过色谱柱而不被保留,达到分离的目的。,检测器,紫外或荧光
11、衍生化检测方法有荧光检测、电化学检测、示差折光检测和质谱检测。大部分氨基糖苷类分子中含-NH2基团,能与邻苯二甲醛(OPA)、丹酰氯、1-氟-2,4-二硝基苯(FDND)等反应,形成稳定的荧光产物。最常用的以邻苯二甲醛为衍生剂,采用柱前或柱后荧光衍生化。柱前衍生反应可在溶液中进行,亦可在离子交换柱或硅胶柱的净化过程中进行。柱后衍生需要柱后衍生装置。,例子：荧光衍生化HPLC法测定牛奶中庆大霉素的四种主要组分,取10mL牛奶样品于4中离心,弃去上层脂肪层,加入1mL30%三氯醋酸,离心,上清液过C18固相萃取柱,用水、水-甲醇(1+1)和甲醇淋洗,最后用16%氢氧化铵的甲醇溶液洗脱,洗脱液挥发至
12、干,用水溶解残余物,取部分提取液加入离子对试剂戊磺酸,进样分析。色谱柱为Spherisorb ODS2(15cm,5m),以水-甲醇(82+18)含0.1%醋酸、5.6mmol/L硫酸钠和11mmol/L戊磺酸作流动相,邻苯二甲醛柱后衍生,荧光检测,检测限为15g/kg。,二、四环素类,四环素类(Tetracyclines)抗生素是一类碱性广谱抗生素。包括从链霉菌属培养物提取的四环素、土霉素、金霉素以及多种半合成四环素如强力霉素、美他霉素、米诺环素等。四环素类早在20世纪的6070年代即广泛应用,在兽医上尤为滥用,以致细菌对四环素类的耐药现象颇为严重,一些常见病原菌的耐药率很高。四环素、土霉素
13、等盐类,内服能吸收,但不完全,而四环素碱、土霉素碱吸收更差。,四环素,内服吸收不完全,约为30%70%。血药浓度较土霉素略高,对组织的透过率亦较高。蛋白结合率65%。在胆汁中浓度可达血清浓度的520倍,可透入胎盘进入乳汁。水牛、黄牛、猪一次静脉注射盐酸四环素的半衰期分别为3.99h、5.39h、3.62h。休药期:牛5日,猪5日,鸡2日。,土霉素,内服易吸收,但不完全。一次内服后,一般24h达血药峰浓度,牛因部分药物进入瘤胃后延缓吸收,需48h才达峰浓度。吸收后广泛分布于肝、肾、肺等组织和体液中,易渗入胸水、腹水、胎畜循环及乳汁中。主要以原形从尿中排出。一部分在肝脏胆汁中浓缩,排入肠内,部分再
14、被吸收,形成“肝肠循环”。肾功能减退时可在体内蓄积。,（一）样品处理,四环素类抗生素的四环母核上含有下列官能团:二甲胺基-N(CH3)2、酰氨基(-CONH2)、酚羟基和两个含有酮基和烯醇基的共轭双键系统。本类抗生素是两性化合物,分子中存在酚羟基和烯醇型羟基,显弱酸性;同时含有二甲胺基,显弱碱性,故遇酸及碱,均能生成相应的盐。四环素类抗生素的游离碱,在水中的溶解度很小,其溶解度与溶液的pH值有关,在pH4.57.2之间时难溶于水,但若酸性或碱性增强,则溶解度增加。当pH值低于4或高于8时,可以得到高浓度的四环类化合物的水溶液。其盐类在水中会水解,当溶液浓度较大时,会析出游离碱,酸度大时能防止水
15、解。,由于四环类抗生素的分子内含有蒽酮类发色团,一般为黄色结晶性粉末,在270360nm处有强的紫外吸收。四环类抗生素在碱性溶液中,C环打开,生成无活性的具有内酯类结构的异四环素。若在强碱性溶液中加热,几乎可以定量转化为异四坏素类产物,具有强烈荧光。液体样品(如牛奶)一般通过离心去除部分蛋白和颗粒,再用乙酸盐、磷酸盐、Mcvaine或Mcvaine/EDTA缓冲液稀释。组织样品(肌肉、肾脏、肝脏)提取前,样品需要剁碎或均质。,1、提取,从生物样品中分离四环素类比较复杂,因为这类药物易与金属离子形成螯合物,以及与组织中的蛋白强烈结合,因此须用强酸或酸性脱蛋白剂进行提取。然而,在酸性条件下(pH2
16、.0),四环素类药物降解为脱水物,加热时又可转变为差向异构体。因此,提取时最好用含有EDTA、琥珀酸盐、草酸等螯合剂的弱酸性溶剂。常用的弱酸性溶剂有EDTA-Mcvaine缓冲液(pH4.0)、琥珀酸盐缓冲液(pH4.0)、酸化乙腈、酸化甲醇。另外,三氯乙酸(pH2.0)、柠檬酸盐缓冲液(pH4.0)、柠檬酸盐缓冲液/乙酸乙酯(pH45)和盐酸/甘氨酸缓冲液亦用于样品的提取和沉淀蛋白质。其他提取方法包括用含苯丁唑酮离子对试剂的二氯甲烷提取蛋中四环素类药物,超滤法提取牛奶、猪组织中四环素类药物。,酸提取法+金属螯合剂,2、净化,初提取液中含大量的内源性干扰杂质,还需要净化处理,包括液-液萃取、固
17、相萃取(SPE)、基质固相分散、超滤、免疫亲和色谱和在线痕量富集等方法。为达到更好的净化效果,可将几种方法结合使用。（1）液-液萃取：四环素类药物不溶于二氯甲烷等疏水性有机溶剂,因此液-液萃取利用疏水性有机溶剂将水相中的一些脂溶性杂质洗去。但有四丁基铵离子对试剂存在时,二氯甲烷可直接提取水相中(pH8.2)的土霉素和四环素,其萃取率达85%以上。,（2）固相萃取(SPE),由于四环素类不易从水相进入有机相,可采用固相萃取柱净化。常用的SPE柱固定相为C18、多聚类和环己基填料。采用硅胶基质的SPE柱时,四环素类易与固定相的硅醇基发生吸附,可通过加入EDTA等硅醇基阻断剂来解决,并在淋洗液中加入
18、草酸。将反相柱与阳离子交换柱串联使用,或使用混合填料的SPE柱,如C18与CM-Sephadex C-25、苯磺酸型、羧酸型阳离子交换树脂混合,可以提高净化效率。基质固相分散法采用C18吸附剂,已用于牛奶中的四环素类的提取和净化,加入等量的EDTA和草酸,可缩短提取时间。,超滤和免疫亲和色谱法亦被用于牛奶样品的提取和净化。柱切换技术：有人采用金属螯合亲和柱作为富集柱(Anagel-TSK Chelate-5PW),通过柱切换,在线浓缩净化动物组织和蛋中四环素类药物。,（二）分析方法,生物样品中四环素药物的含量测定方法,除有微生物测定外,主要还有荧光分光光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法和毛细管
19、电泳法等。,1、荧光分光光度法,四环素类抗生素本身在0.1mo1/L盐酸液中有微弱荧光,若将它们转变为脱水物,能使荧光强度增强。若在一定pH条件下,使脱水物与铝盐络合,形成的络合物具强烈荧光,可用于含量测定。由于本法灵敏度高(0.1mg/L),线性范围在05mg/L间,适用于血浆中四环素类抗生素的测定。,血浆中四环素的测定,取血浆2.0mL,加1.5mol/L三氯醋酸液0.6mL,振摇,离心(3500r/min)5min,取上层液1.6mL,加0.lmol/L盐酸液0.5mL,某中含有-硫代丙酸 1.0g/L;溶液于100加热10min后,立即将试管浸入冷水中冷却,加pH6.0枸橼酸缓冲液(1
20、L溶液中含枸橼酸125g和10mol/L氢氧化钠液160mL)1.0mL,然后加0.75mol/L三氯化铝液0.5mL,振摇并在室温放置15min,于485nm处激发,555nm处检测荧光强度。,四环素在pH5的条件下,与Al3+以1:1的定量关系形成具有强烈荧光的络合物,该络合物至少能稳定1h;试剂中加-TPA,能增强四环素对光的稳定性,-TPA为抗氧剂。该法适用于血浆中其他四环类抗生素的测定。Gala等报道了荧光分光光度法筛选测定牛奶中四环素药物。Poiger等测定了组织中三种四环素类药物。Salinas等报道了一种4步荧光衍生化,荧光分光光度法测定蜂蜜中土霉素残留量。,2、薄层色谱法,薄
21、层色谱法设备简单,操作方便,可作为四环素类的筛选方法。薄层板一般采用硅胶板或C8板。硅胶板遍常以ETDA-2Na(pH7.0)-乙酸乙酯-氯仿-丙酮溶液作展开剂,C8板用含0.5mol/L草酸的流动相展开;展开后,取出薄层板,晾干,检测方法包括生物自显影法(枯草杆菌)和分光光度法。荧光分光光度检测采用氯化镁和三乙胺显色,紫外分光光度检测采用快蓝BB和吡啶显色。,3、毛细管电泳法,Chen等报道了毛细管电泳法测定牛奶中4种甲环素类药物。样品用金属螯合柱提取,洗脱液过C18固相萃取柱,乙醇洗脱,开管石英毛细管柱(57cm 75m)分离,电泳电压23kV,温度23,电泳液含10mmol/L十二烷基磺
22、酸钠、50mmol/L硼酸盐和50mmol/L磷酸盐,pH8.5,紫外检测波长370nm,四环素类的检测限1.35.6ng/mL,定量检测限1.78.7ng/mL。,4、高效液相色谱法,HPLC法是四环素类药物残留分析最常用的方法,但采用硅胶基质的色谱柱时,常遇见两个问题:一是四环素类可与色谱系统中的金属离子形成螯合物,色谱行为差;二是四环素类与固定相发生吸附,造成峰形不对称,灵敏度下降。前者可通过加入EDTA解决,后者可通过对柱填料进行硅烷化或加入季铵盐等硅醇基的阻断剂来解决。亦可采用含金霉素的流动相预先淋洗过夜,金霉素作为硅醇基的阻断剂,以消除土霉素和四环素的峰形拖尾现象。,土霉素、四环素
23、和强力霉素在酸性水溶液中,268nm、270nm和269nm处有最大吸收,在350370nm处亦有强的紫外吸收,检测灵敏度可达g/kg水平。由于四环素类分子中含有两个共轭双键,因此在紫外光照下能产生荧光,它们的降解产物也具有荧光性质,可供测定。但四环素类的荧光检测更多的采用柱后荧光衍生化测定。例如,以二氯化氧锆作荧光衍生剂,柱后荧光检测组织中的四环素类药物残留,灵敏度可达pg水平,具有高的灵敏度和选择性。电化学检测具有高的灵敏度,但应用相对较少。质谱检测可提供化合物的结构信息,在残留分析中作为确证分析方法。,HPLC法测定牛奶中土霉素和四环素,取5mL牛奶样品,用0.6mol/L硫酸调节至pH
24、2.7,用10mL乙腈提取,吹干,用2mL磷酸盐缓冲液溶解,加入四丁基铵离子对试剂,二氯甲烷提取,再用0.1mol/L高氯酸抽提。C18柱(25cm5m)分离,使用前用含金霉素的流动相淋洗过夜,以0.02mol/L磷酸-乙腈(76+24)作流动相,流速1.2mL/min,柱温35,紫外检测波长355nm。在上述条件下,样品色谱图见图,可检测到牛奶样品中土霉素和四环素浓度10ng/mL。,HPLC法测定牛和猪的组织与血清中的四环素,取25g组织样,加3倍体积的1mol/L盐酸,血清中加入1倍体积的1mol/L盐酸,匀浆,取匀浆8mL加人乙腈32mL涡旋混合,静置后滤过,收集滤液20mL,加人二氯
25、甲烷20mL和石油醚20mL,用力振荡,取水层200L进样。色谱柱为PRR1柱(25cm 4.1mm,10m),流动相为0.01mol/L磷酸-甲醇(80+20)和0。01mol/L磷酸-乙腈-甲醇(30+50+zO),梯度淋洗,流速1mL/min。紫外检测波长355nm。在上述条件下,方法回收率:肌肉,92.7%;血清,99.5%。检测限:土霉素、四环素,10ng;金霉素,20ng。,柱切换技术,采用柱切换技术,金属螯合亲和柱在线浓缩/净化动物组织和蛋中四环素类药物,分离测定土霉素、四环素、地美环素和金霉素残留量。取2g蛋样或组织样,用pH5的柠檬酸盐缓冲液(鸡肝,pH4)和乙酸乙酯均质,离
26、心,上清液挥发至干,用甲醇溶解,注入Anagel-TSK Chelate-5PW金属螯合亲和柱,通过柱切换,将富集的分析物洗脱至分析柱(PLRRS,15cm5m)中进行分离,流动相为0.1mol/L磷酸二氢钾-0.01mol/L柠檬酸-0.01mol/L EDTA和乙腈-甲醇-1mol/L柠檬酸盐缓冲液(pH4)(25+10+65),梯度淋洗:10min内从(100+0)到(0+100),350nm紫外检测,组织和蛋中检测限:土霉素3g/kg、四环素5g/kg、地美环素5g/kg、金霉素6g/kg。,采用金属螯合亲和柱净化,LC分离测定牛奶中四环素类药物残留量。取5.0mL牛奶样品于10 离心
27、15min,分离乳油,加入0.1mol/L琥珀酸钠10mL,混匀后离心,上清液过金属螯合柱(已用C2+处理过),洗脱液再过ENV Chrom P固相萃取柱净化;色谱柱为PLRP-S柱(15cm 4.6mm,5m),以甲醇-5mmol/L草酸溶液作流动相,梯度洗脱,流速1mL/min,紫外检测波长355nm。在上述条件下,保留时间:土霉素13.2min、四环素13.8min、金霉素15.7min;检测限5ng/mL。,庞国芳等建立了一种HPLC法同时测定禽肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留的分析方法。Long等报道了基质固相分散-LC法测定奶中土霉素、四环素、金霉素残留量。Wan等报道了一
28、种新颖的化学发光检测-HPLC法测定蜂蜜中四环素类(土霉素、四环素、美他环素)残留。Pena等采用柱后荧光衍生化LC测定奶中土霉素、四环素和金霉素残留量,添加样品的回收率大于80%,在1.45h内可分析10个样品,方法灵敏、快速、可靠,满足残留检测的要求。Pena等采用LC荧光检测法测定蜂蜜中土霉素和四环素残留量。,Oka等最先报道了快速原子轰击LC-MS测定蜂蜜中四环素、土霉素、金霉素和强力霉素的方法,后来用热喷雾电离LG-MS分析四环素类药物。Carson等报道了LC-MS法测定虾、牛奶中四环素类多残留的分析方法。张纯萍等报道了牛奶中四环素类药物的HPLC-MS/MS法。Goto报道了一种
29、电喷雾串联质谱法对动物组织中四环素和青霉素类抗生素的高通量分析方法,可同时检测肌肉组织中土霉素、四环素、金霉素、青霉素G、氨比西林和萘呋西林残留。,三、氯霉素类,氯霉素类属酰胺醇类广谱抗生素,包括氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考，后两者为氯霉素的衍生物。由于分子中存在两个不对称碳原子,故有四个立体异构体。在这些异构体中,惟具左旋性的D-(-)-苏阿糖型有制菌活性。,氯霉素,氯霉素是一种广谱抗生素,具有良好的抗菌和药理特性,被广泛应用于各类家禽、家畜、水生动物(鱼、虾等)及蜜蜂等动物的各种传染病的防治。但是氯霉素对人有严重的副作用,可导致再生障碍性贫血。美国、欧盟等国规定在动物源食品中不得检出氯霉素。
30、,氯霉素口服吸收良好,在体内分布广泛,可进人胸水、腹水、滑膜液和玻璃体内。脑组织中药物浓度可高于血清浓度几倍,但脑脊液药物浓度只为血清浓度的1/2。可透过胎盘,并进入乳汁。在胆汁中含量较低,有一半以上药物在肝、肾和血清中与葡萄糖醛酸结合失活,肌肉中呈游离态。氯霉素肌内注射后在注射部位蓄积,吸收比内服慢(反刍动物除外),牛在212h产生并维持有效血浓度。琥珀氯霉素的水溶性强,注射后吸收迅速,给母牛一次肌注50mg/kg,其血药峰浓度较同量氯霉素高6倍,消失也较快。,氯霉素注射后迅速进入肠肝循环,药物作用时间较长,数周内都可以检出药物的残留。例如,山羊肌注后残留量降到0.05mg/kg时,注射部位
31、需要14天,非注射部位肌肉6天,脂肪9天,肝和肾11天。氯霉素在肝脏中的主要代谢产物为氯霉素-葡萄糖醛酸结合物、氯霉素碱、氯霉素醇和氯霉素草氨酸盐。肝中生物转化后,大部分随尿液排出。,甲砜霉素,甲砜霉素抗菌谱和抗菌作用与氯霉素相仿,体外抗菌作用比氯霉素略差。但体内比氯霉素强,具有较强的免疫抑制作用,是氯霉素的2.55倍。主要抑制细菌蛋白质合成和抑制抗体的生成,在畜牧业中用于预防和治疗牛、家禽呼吸道和肠道疾病。内服或注射吸收快而完全,给药后2h血药浓度达峰值,胆汁中浓度可为血药浓度的4倍。连续用药在体内无蓄积现象。甲砜霉素吸收后在体内分布广泛,以肾、脾、肝、肺等中的含量较多,比同剂量的氯霉素约高
32、34倍。甲砜霉素在体内很少代谢,兔和鼠中90%以上药物以原形自尿中排出,部分自粪便中排出,但在猪中葡萄苷酸化相对较高。,氟苯尼考,氟苯尼考是氯霉素的第二代替代品,其结构与甲砜霉素相似,但抗菌活性、抗菌谱及不良反应方面明显优于甲砜霉素,其抗菌能力可达甲砜霉素的10倍之多。氟苯尼考在动物胃肠道内吸收良好。氟苯尼考在动物体内主要代谢产物是氟苯尼考胺(Flrfenicolamine,FFA)和氟苯尼考醇。美国残留监控中把FFA作为鱼组织中氟苯尼考的标志残留物。氟苯尼考内服吸收良好,在动物体内呈全身性分布,但各组织器官药物浓度不同。血液和肌肉中药物浓度相近,脑中药物浓度较低,胆汁中浓度高,且有较高的内服
33、生物利用度(猪109%、犊牛88%、肉仔鸡55%),预示存在肠肝循环。在肾和眼球脉络模中有蓄积作用,说明氟苯尼考及其代谢物可能与黑色素结合。氟苯尼考主要经肾排泄,犊牛静脉注射和内服后分别有50%和65%的原药从尿排出,少量经粪便排出。,（一）样品处理,液体样品(如牛奶)通过离心脱脂,用水稀释后再经固相萃取柱净化。组织样品(肌肉、肾脏、肝)在提取前,需要将样品粉碎或均质。氯霉素有一半以上药物在肝、肾和血清中与葡萄糖醛酸结合,故用葡糖苷酸酶水解,释出游离的氯霉素,但在猪、鸡和牛肌肉组织中未发现有葡萄糖醛酸结合。,1、提取,组织样品的提取/脱蛋白一般用乙酸乙酯和乙腈。乙腈适合氯霉素类三种药物的同时提
34、取,但其提取效率不及乙酸乙酯。其他有机溶剂/无机溶剂有丙酮、甲醇、乙醚、乙酸异戊酯、三氯乙酸、磷酸盐缓冲液(pH7.8)、水和尿素溶液。,2、净化,初提取液净化可采用液-液分配、透析、固相萃取、基质固相分散、免疫亲和色谱、液相色谱和在线富集技术等。液-液分配是将水相中的药物提取到有机相中,或是将水相或有机相中的内源性干扰杂质洗去。乙酸乙酯提取水相中氯霉素类药物,提取率较乙醚等其他有机溶剂高。水相中加入氯化钠使浓度为3%4%,可以提高乙酸乙酯的萃取效率,尤其对甲砜霉素和氟苯尼考效果更为明显。,样液脱脂可用正己烷、石油醚、异丙酮和甲苯等有机溶剂,但在分析氯霉素和氟苯尼考时,尽量避免使用甲苯,因为在
35、液-液分配过程中,部分药物会转化成甲苯。由于液-液分配过程中易产生乳化现象,导致样品损失,有人改用硅藻土小柱浓缩、净化样品,避免了液-液分配中的乳化现象,同时提高了萃取效率。除蛋白和杂质亦可采用基质固相分散技术(MSPD)和透析法。MSPD在净化肌肉组织和奶样中氯霉素时,用C18作为吸附剂。透析法用于牛奶样品中氯霉素的测定时,先用乙酸乙酯提取样品,提取液经透析膜选择性透析,使药物分子从基体中分离出来,达到与蛋白质及其他杂质分离的目的。,提取液净化一般采用固相萃取法,最常用的吸附剂为反相吸附剂如C18。C18固相萃取柱净化样品,回收率高,但在许多情况下,C18柱净化后,再用C18分析柱分离,可能
36、某些杂质与分析物一同出峰,干扰组分的测定。极性吸附剂如Florisil和氧化铝亦被用于组织样品的净化。组织样品经Florisil小柱净化后,氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的回收率为82.6%、75.4%、79.1%,而氧化铝小柱净化后,氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的回收率为75.8%、65.6%、63.4%。因此Florisil柱净化后得到的回收率要比氧化铝柱高,并且在除脂类杂质方面效果更好。免疫亲和柱具有高的专一性,van de Water首先采用免疫亲和柱纯化猪肌肉和牛奶样品中的氯霉素。Moretti等应用柱切换技术,用免疫亲和柱在线纯化浓缩牛奶和猪肉中氯霉素。,van Ginkel等采用LC法
37、纯化牛肉和蛋中氯霉素,分离柱为LiChrosorb Diol柱。Tjaden等通过柱切换技术,用反相柱在线纯化浓缩猪肾中氯霉素。Hmmert等采用蛋白排阻色谱柱(Hisep)在线浓缩动物组织中氯霉素,通过柱切换,洗脱剂将浓缩后的氯霉素洗脱至Spelco LC-18预柱中,再洗脱至分析柱中分离。,（二）分析方法,生物样品中氯霉素类的分析主要采用色谱法,包括薄层色谱法、液相色谱法和气相色谱法。表9.1列出了部分氯霉素类药物残留的分析条件。,1、薄层色谱法,薄层色谱法(TLC)测定食品中氯霉素类药物的文献很少。TLC法样品处理繁琐,显色过程复杂,方法重复性和灵敏度低,目前已很少应用。,猪肉中氯霉素的
38、TLC测定方法,样品用乙酸乙酯提取,离心分离,正己烷脱脂,然后用硅胶柱净化,依次用乙酸乙酯-正己烷(3+1)、乙腈-甲醇(95+5)淋洗柱子,用丙酮-正己烷(2+1)洗脱,洗脱液浓缩后,用50L甲醇溶解,点样,以乙酸乙酯-正己烷(2+1)为展开剂,展开后,晾干,斑点进行衍生化:先喷氯化锶溶液,烘干后再喷氢氧化钠溶液,烘干,喷硼氢化钠溶液,烘干,最后用荧光胺显色,置紫外光(366nm)下检视,供试液如显杂质斑点,与对照溶液的主斑点比较,不得更深,该方法测定低限为0.01mg/kg。氯霉素斑点的检测亦可采用枯草杆菌的生物自显影法。,2、气相色谱法,氯霉素类药物为高极性、难挥发的化合物,须对它们的极
39、性官能团进行酯化、硅烷化或酰化,生成热稳定和易挥发的衍生物,才能用GC或GC-MS进行测定。由于氯霉素类药物都有羟基,通过三甲基硅烷化(TMS)可以定量衍生,生成易挥发和热稳定的硅烷化衍生物。常用的硅烷化试剂有N,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺(BSTFA)、三甲硅基-N,N-二甲基氨基甲酸酯、六甲基二硅氧烷(HMDS)、六甲基乙硅氧烷-三甲基氯硅烷的吡啶溶液和N,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺(BSTFA)-三甲基氯硅烷(TMCS)(99+1)。七氟丁酸酐与羟基反应,生成酯类衍生物,用于牛奶中的氯霉素测定。,由于氯霉素类分子中有吸电子的卤素,用电子捕获检测器检测,具有高的灵敏度和专一性,检测限可
40、达0.15ng/g。GC-MS法检测可提供化合物的结构信息,被用于动物源食品中氯霉素类残留的确证分析,质谱采用化学电离源接口。氢火焰离子检测器(FID)也可用于氯霉素和甲砜霉素的检测,但灵敏度低且专一性差,通常仅作为GC-MS的辅助检测手段。,牛奶中氯霉素类多残留的GC测定方法,以间硝基氯霉素作内标物。牛奶样品用乙腈提取,离心,上清液浓缩至干,用水溶解残余物,过C18固相萃取柱,用甲醇-水(60+40)溶液洗脱,洗脱液挥发至干,用N,O-双(三甲基硅)三氟乙酰胺(BSTFA)-三甲基氯硅烷(TMCS)(99+1)试剂衍生化,加人甲苯和水,终止衍生反应,离心,有机相进样分析,色谱柱为OV-1石英
41、毛细管柱(30m 0.25mm),载气为氦气,电子捕获检测器检测,可检测到牛奶中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量5g/kg。,3、液相色谱法,氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考都有很强的紫外吸收,因此可直接用HPLC/V检测。分析柱多采用C18或C8柱。一般来说C8柱用于分析那些在C18柱上不能很好保留的化合物。由于C18柱可以很好地分离氯霉素和甲砜霉素,因此C18柱应用更广,流动相主要是甲醇或乙腈与磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。氯霉素的检测波长可选择214nm、254nm或278nm。在214nm氯霉素的检测灵敏度最高,但样品提取液的色谱图上会有许多内源性化合物的干扰峰,在278nm检测氯霉素时干扰峰
42、较少。甲砜霉素和氟苯尼考在224nm、225nm或230nm进行检测。,LC法测定猪肌肉中氯霉素,试样中加入乙酸乙酯,超声提取,加入无水硫酸钠脱水,加入适量正己烷,过硅胶柱净化,用少量正己烷淋洗,再用甲醇洗脱氯霉素,洗脱液浓缩至干后用流动相溶解,进样分析,色谱柱为Li-Chromspher C18柱(100mm 3.0mm,5m),流动相为乙酸钠缓冲液(0.01mol/L,pH4.3)-乙腈(75+25),检测波长280nm,样品添加浓度1050g/kg的平均回收率为79%。,采用柱切换技术,反相色谱法测定猪肾中氯霉素残留量,样品用乙醚提取,提取液用氮气吹干,加入2mL乙腈和3mL石油醚溶解残
43、余物,乙腈相吹干后,残余物用流动相溶解,进样。第一柱为Li-Chromspher C18柱(100mm 3.0mm,5m),第二柱为PRP-l柱(100mm 3.0mm,5m),检测波长280nm,流动相为乙腈-水(90+10),方法检测限小于0.01g/g,添加浓度在125g/kg时的回收率为狃41.7%。,LC法测定黄鳝肉中氟苯尼考胺(FFA)的残留量,样品先酸解(样品酸解可以将氟苯尼考及其代谢物转化为FFA,并从组织中释出),然后用乙酸乙酯提取,碱化后过固相萃取柱,C18柱分离,紫外检测,样品添加浓度在0.07535g/g的回收率为85.7%92.3%,相对标准偏差4.8%17.2%,检
44、测限0.044g/g。,LC-MS/MS法测定奶制品中氯霉素残留量,样品经液-液提取,固相萃取柱净化后进样,负离子电喷雾电离,MRM检测。由于氯霉素分子中有两个氯原子,因此NIRM选择4对离子对:m/z 321257,321 152(35Cl2)和323 257,323 152(37C135Cl),虽然m/z 321 152的检测响应比其他离子对高,但基质对它有干扰,故选择仍m/z 321 257作为定量离子对,添加水平在0.1g/kg、0.2g/kg、0.5g/kg时,回收率和精密度符合欧盟残留检测的要求,测定限和测定能力分别为0.03g/kg和0.05g/kg。,四、大环内酯类和林可霉素类
45、,大环内酯类(Macrolides)是一类具有1416员大环的内酯结构的弱碱性抗生素,天然制品由链霉菌培养液中获取,经半合成改造可制得许多新型品种(图10-1)。自1952年发现代表品种红霉素以来已陆续有竹桃霉素、螺旋霉素、吉他霉素、麦迪霉素、交沙霉素及它们的衍生物问世。并出现动物专用品种如泰乐菌素、替米考星等。,大环内酯类的抗菌谱和抗菌活性基本相似,主霉对需氧革兰阳性菌、革兰阴性球菌、厌氧球菌及军团菌属、支原体属、衣原体属有良好作用。仅作用于分裂活跃的细菌,属生长期抑菌剂。大环内酯类内服可吸收,体内分布广泛,胆汁中浓度很高,不易透过血脑屏障。主要从胆汁排出,粪中浓度较高。林可霉素类(Linc
46、osa而des)是一类具有氨基酸侧链单苷结构的碱性抗生素,天然制品由链霉菌培养液中取得,经半合成改造可制得新型品种,代表品种有林可霉素、克林霉素和吡利霉素。,林可霉素类抗菌谱较大环内酯类窄。革兰阳性菌及某些支原体(猪肺茨支原体、猪鼻支原体、猪关节液支原体)、钩端螺旋体均对本品敏感。而革兰阴性菌对本品耐药。林可霉素类的最大特点是对厌氧菌有良好抗菌活性。本类药物的作用机理同大坏内酯类,主要作用于细菌核糖体的59s亚基,通过抑制肽链的延长而影响蛋白质的合成。,泰乐菌素,动物组织中残留量取决于给药方式。肌注在注射部位和肾中残留量为最高,内服在肝中残留量为最高,而且肌注比内服残留量高、滞留时间更长。由于
47、内服残留量比较低,因此饲料中即使添加1000mg/kg,家畜喂服后在肝脏中也很难检测到残留物。泰乐菌素可以迁入奶和蛋中,产蛋母鸡和泌乳奶牛禁用。有试验表明,奶17.6mg/kg,连续5日,停药后3天内奶中可检出残留量,平均浓度为0.03mg/kg。牛日因肌此注,奶牛用药后96h内采的奶不能供人类食用。肉鸡宰杀前,饲服休药期1天,肌注休药期3天。火鸡和猪宰杀前休药期5天和21天。,替米考星,与其他大环内酯类抗生素相比,替米考星用药安全性低,其毒作用的靶器官是心脏,可引起心动过速和收缩力减弱。内服或皮下注射本品后吸收快,组织穿透力强,分布容积大,尤以肝和乳中浓度较高。半衰期可达12日,体内维持时间
48、长。通过给牛放射性标记替米考星的测定,发现主要通过粪排泄;可食组织、肝和肾中含高浓度的残留,尤以肝中残留量为最高且滞留期长;28天后肝中母体残留量降至1mg/kg;在体内滞留时间长,产奶期奶牛和肉牛犊禁用。,红霉素,主要用于耐青霉素金黄葡萄球菌及其他敏感菌所致的各种感染,如肺炎、子宫炎、乳腺炎、败血症等。对鸡支原体病(慢性呼吸道病)和传染性鼻炎也有相当疗效。也可配成眼膏或软膏用于皮肤和眼部感染。红霉素可作为青霉素过敏动物的替代药物。红霉素能广泛分布到各种组织和体液中,在肝和胆汁中含量最高,胆汁中药物浓度为血清浓度的30倍。大部分药物在肝脏代谢,主要代谢途径为脱氧糖胺的N-去甲基化。主要经胆汁排
49、泄,部分在肠道屮重吸收,少量以原形经尿排泄。其消除半衰期:猪1.21h,黄牛1.97h。,竹桃霉,竹桃霉素内服吸收慢,内服需用三乙酰竹桃霉素,但三乙酰竹桃霉素连续服用会损害肝脏,有皮肤过敏或腹泻等反应。三乙酰竹桃霉素在体内可代谢,但竹桃霉素在体内不代谢。内服或注射后,大部分组织如肝、肾、脾、心、肺和胆中可以检测到残留物。,螺旋霉素,内服胃肠吸收不规则,吸收后广泛分布于体内。部分药物被胃酸分解为新螺旋霉素，其抗菌活性与螺旋霉素相似。螺旋霉素在肝脏代谢,主要经胆汁和肾排泄,部分由乳汁排出,乳汁中新螺旋霉素浓度是螺旋霉素浓度的6%7%。螺旋霉素在体内吸收后滞留时间较长,药效维持时间长。牛注射30mg
50、/kg后,肝和肾中药物浓度较高,肝中滞留期28天。犊牛日饲服25mg/kg,连续7日,肝和肾中药物残留很高,休药24天降至0.1mg/kg,而脂肪和肌肉休药3天后检测不出残留量。,吉他霉素,本品内服吸收良好,广泛分布于主要脏器,尤以肾和肝中浓度为最高。猪单次内服20g/kg,0.5h达血药峰浓度4.5mg/kg,半衰期0.7h,12h达肾药峰浓度21mg/kg,肾/肝最高浓度比约为3/2。主要经肝胆系统排泄,在胆汁和粪中浓度高,少量经肾排泄。吉他霉素在肠道内吸收快,但释出亦快,24h后在脏器中无明显残留,故其在组织中残留量是大环内酯类抗生素中最低的一种。,林可霉素,内服后可自胃肠道吸收,不被胃
