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1、微生物青贮接种剂研究进展 河南农业大学 付彤 中国农业科学院饲料研究所 刁其玉摘要本文综述了微生物青贮接种剂对青贮发酵、青贮质量及动物生产性能的影响，及微生物青贮接种剂使用方法，并展望了微生物青贮接种剂的研究方向。关键词青贮饲料微生物接种剂青贮接种剂是微生物青贮接种剂（Silage Microbial Inoculants）的简称，也叫青贮接种菌（Silage Bacteria Inoculants）。人们对青贮接种剂（接种菌）的早期定义是：一种额外提供给乳酸菌以保证快速而良好青贮发酵的添加剂。青贮接种剂中应用最普遍的乳酸菌是植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），接种剂
2、中的乳酸菌通常是从作物或青贮料中筛选出来的，之所以被选择是因为其繁殖迅速，并且是同型发酵。但是随着生产和研究的发展，接种剂不再是单一的同型发酵乳酸菌制剂，一些异型发酵乳酸菌、丙酸菌甚至乙酸菌都成了接种剂的组成成分，它们或单独使用，或联合应用，有时还与某些酶制剂复合在一起。目前美国市场有200多种青贮添加剂，其中主要是接种剂（林春健，2003）。1青贮接种剂的种类目前研究和应用的青贮接种剂按使用目的可以分为两类，一类是促进发酵的微生物，主要包括同型发酵乳酸菌；另一类是提高青贮饲料有氧稳定性的微生物，主要包括布氏乳杆菌和丙酸菌，但这些种类又往往会复合在一起，且很多商品制剂种还加入了纤维素酶、半纤维
3、素酶等酶制剂，以增加接种菌的发酵底物，因此，对于商品制剂来说，往往很难分类。同型发酵乳酸菌接种剂是一种传统的接种剂，经常使用的是具有同型发酵能力的如植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、粪链球菌（Enterococcus faecium）和片球菌（Pediococcus spp）等，它们可以有效的利用作物的可溶性碳水化合物，增加乳酸的产量、迅速的降低pH值（Weinberg和Muck1996）。当然，很多接种剂含有一种以上的乳酸菌或含有同一类的几种乳酸菌，因为不同的乳酸菌可以在不同的pH条件下生长良好，这样可以使青贮的不同阶段（pH46）都有快速的发酵，多种乳酸菌也可使
4、接种剂对于各种作物、水分和温度均有良好的表现。Whittenbury1961年首先提出了理想接种标准（Seale，1986年），这一原始标准不断的被完善（McDonald，1991；Seale，1986；Woolford和Sawczyc，1984；Hellings等，1985），可将其主要内容可归纳为：快速生长并同自然菌株的成功竞争；糖的同型发酵和乳酸的快速产生；耐酸性（pH接近4）；发酵范围较广的糖类；不产生源自蔗糖的不可发酵的右旋糖苷和源自果糖的甘露醇；不降解有机酸；温度在50以上时可以增殖或者至少可以生存；低湿度的萎蔫牧草上增殖较好；最好是单产L（+）乳酸异构体的菌株。布氏乳杆菌具有提高
5、青贮饲料有氧稳定性能力，如Lactobacillus buchneri 40788，一种异型发酵乳酸菌，它可以产生高剂量的乙酸抑制酵母和霉菌，从而使青贮饲料在暴露于空气中时不易损坏（Driehuis等1999；Weinberg等2002）。布氏乳杆菌是近十年来才被人们认识的，它的应用改变了接种剂原有的定义和标准。此外，还有一些接种剂含有丙酸菌，目的和使用布氏乳杆菌相似，即利用其生产丙酸的能力来提高青贮饲料的有氧稳定性。2青贮接种剂对发酵的影响接种剂对青贮的主要影响是增加发酵速率和发酵产物的转换，如果接种的同型发酵乳酸菌支配了发酵，它们的快速增殖会引起pH迅速下降及乳酸与乙酸和乙醇的比例增加，由
6、于乳酸的酸性高于乙酸，pH下降的更快，成功的接种剂会造成低的终pH。这可能归咎于两个原因：接种剂中典型的乳酸菌可以在较低的pH下生长，以便在其被抑制之前持续发酵造成更低的pH值；即使受到糖的限制，由于从乙酸向乳酸的发酵转换仍可以使pH更低。蔡义民等（1995）在意大利黑麦草添加乳酸菌有效地抑制了与青贮饲料共存的丝状菌（霉菌）、酵母菌及一般细菌的繁殖，乳酸杆菌制菌效果大于乳酸球菌。此外，添加乳酸菌使pH及氨态氮与全氮比值（NH3-N/TN）降低，乳酸含量提高，改善了青贮饲料发酵品质。还增加了L（+）乳酸的生成比率。傅彤（2005）报道了添加植物乳杆菌和乳酸片球菌，降低了全株玉米青贮的pH值，提高
7、了乳酸、总有机酸生成量及乳乙酸比例，减少了乙酸生成量。Muck和Kung（1997）对从19901995年期间发表的使用青贮接种剂的试验结果进行总结时发现：接种菌可以有效降低pH，并使发酵时乳酸含量升高的试验超过60；接种菌的效果依不同的青贮原料而定，禾本科牧草、紫花苜蓿和三叶草效果最为明显（5964的试验降低了pH）；而玉米青贮和小粒谷类作物效果则不显著（3144的试验降低了pH）。此外，氨的水平也有明显下降，这说明接种菌可以较好保留蛋白质。青贮接种剂的效果受饲草上天然乳酸菌的数量和质量、饲草的青贮特性及接种剂的品质等多种因素的影响。3青贮接种剂对青贮质量的影响3.1青贮接种剂对干物质回收率
8、的影响堪萨斯州立大学的研究人员在用直立水泥青贮塔试验接种剂对玉米青贮的保存和饲喂效果时，发现接种的19个玉米青贮其干物质回收率比未处理的高1.3个百分点（Bolsen等，1991）。发酵产物的转变会增加干物质的回收率，同型发酵几乎没有干物质的损失而异型发酵干物质损失明显，一般接种菌会提高干物质回收率的1%3%，但结果不一致，约有5060%的试验表现出这种积极效应（Muck，1993&1997）。原则上接种菌不能明显的改善能量的损失，事实上，干物质的损失必然会造成一定的能量损失（见表1）。表1一些重要发酵途径的干物质和能量损失乳酸菌同型发酵葡萄糖/果糖+2ADP+2Pi=2乳酸+2ATP+2H2
9、O干物质没有损失，能量损失0.7%异型发酵葡萄糖+ADP+Pi=乳酸+乙醇+CO2+ATP+H2O干物质损失24%，能量损失1.7%3果糖+2ADP+2Pi=乳酸+乙酸+2甘露醇+2CO2+ATP+H2O干物质损失4.8%，能量损失1.0%肠细菌葡萄糖+3ADP+Pi=乙酸+乙醇+2CO2+2H2+3ATP+2H2O干物质损失4.8%，能量损失17%酵母葡萄糖+ADP+Pi=乳酸+乙醇+CO2+ATP+H2O干物质损失4.8%，能量损失0.2%梭菌乳酸+ADP+Pi=丁酸+2CO2+2H2+ATP+H2O干物质损失51%，能量损失18.4%摘自：McDonald等（1991）3.2青贮接种剂对
10、有氧稳定性的影响3.2.1青贮饲料的有氧稳定性有氧稳定性（Aerobic Stability）是指青贮饲料在青贮窖中或饲槽中保持新鲜（不变质）的能力。装窖时空气的排出的程度对青贮质量影响很大，压实良好的青贮料30分钟内可使环境氧低于0.5%（Woolford，1990年）。青贮过程要求的环境氧最高不能超过1%（体积比），高于这个数值厌氧环境就会被破坏（Liske等，1989），但这种环境仍可足以维持一些需氧微生物的生长，如果青贮料处理不善这个问题会变得更为严重。需氧菌的生长和代谢会导致乳酸含量较低而乙酸含量较高，氨态氮增加（Ruxton和McDonald，1974年）。这种低质量的青贮饲料会使
11、不耐酸病原菌的增殖，如致命性的梭菌和李氏杆菌（Ruxton和Gibson，1995年）。当青贮窖打开时，青贮饲料暴露于空气中，好氧微生物分解乳酸和残余的可溶性碳水化合物引起腐败，产生CO2、分解蛋白质和氨基酸为氨或胺类物质（Seale，1986）。有氧腐败产生大量的热，增加了pH，降低了饲料消化率，其中主要是蛋白质的消化率，并导致适口性降低（Woolford,1990）。玉米等含糖量高的作物青贮后残留的糖和乳酸的量较高，开窖后有氧稳定性更低（Ohyama等，1975）。青贮料严重变质时可以提供丝状真菌生长的条件，这类微生物可以产生有害的毒枝菌素（Nout等，1993；Ohmomo等，1994）
12、。因此如何提高青贮饲料的有氧稳定性，防止二次发酵是目前的研究热点，同时，这项研究也极具商业价值。关于二次发酵的机理尚不十分清楚，Woolford（1990）发现酵母在多种作物青贮的腐败过程中担当重要角色。如果乳酸利用酵母的数量超过l05cfug-1DM，青贮饲料很可能会在开窖后迅速腐败，然而，青贮中即使有大量的酵母，若乳酸利用酵母不足，也不会迅速变质（Jonsson，1984）。乳酸利用酵母或许是有氧变质的发起因素。3.2.2同型发酵乳酸菌对青贮饲料有氧稳定性的影响Muck和Kung（1997）的总结也提到了大约三分之一的报告指出同型发酵乳酸菌降低了青贮饲料的有氧稳定性，特别是全株玉米和禾本科
13、牧草青贮。Mnck（2002）发现19992001年三年中对四个传统接种剂进行的十次的试验中仅有一次提高了有氧稳定性（16h），其余的都有消极作用，其中两组损坏严重，平均比对照组减少了17h。尽管这种减少微不足道，但在夏季就凸显重要了。其原因可能是乳酸菌接种剂导致了发酵产物由乙酸向乳酸转换，乙酸在特定的pH值下对酵母的抑制作用大于乳酸（Moon，1983），而酵母通常是青贮饲料腐败产热的发起者（Woolford，1990）。3.2.3布氏乳杆菌对青贮饲料有氧稳定性的影响近年来一种新型的接种菌布氏乳杆菌受到人们的广泛关注。布氏乳杆菌与其它的接种菌有明显区别，它是一种异型发酵乳酸菌。这种乳酸菌在2
14、001才刚刚被FDA认可为青贮添加剂。很多试验研究了它与各种青贮原料有氧稳定性的关系，包括玉米（Driehuis等，1999a&1999b；Ranjit和Kung，2000；Ranjit等，2002）、禾本科牧草（Driehuis等，2001）、苜蓿（Kung等，2003a）、整株小麦（Weinberg等，1999）、整株大麦（Kung和Ranjit，2001；Taylor等，2002）、高水分玉米（Kendall等，2002；Taylor和Kung，2002）和高粱（Weinberg等，1999）。这些研究表明，布氏乳杆菌可以明显而稳定的改善青贮饲料的有氧稳定性。尽管其对有氧稳定性的提高程度
15、不尽相同，从一天到数周不等，但所表现的积极效应是稳定的。美国奶牛与牧草中心在通过三年的连续试验表明，布氏乳杆菌可以提高玉米青贮的有氧稳定性，三年试验的数据相似，与对照组相比提高100到811h，足以见其效果的稳定性（Muck，2002）。最近Driehuis等（2001）使用同型发酵乳酸菌（Pediococcus pentosaceus和L.plantarum）降低了青贮饲料的有氧稳定性，但与布氏乳杆菌共同使用时提高了有氧稳定性，二者具有协同效应。3.2.4丙酸菌对青贮饲料有氧稳定性的影响丙酸菌是一种特殊的厌氧微生物，它可以发酵3mol乳酸生成2mol丙酸、1mol乙酸和1molCO2（Het
16、tinga和Reinbold，1972）。一些丙酸菌可以产生细菌素（Grinstead和Barefoot，1992；Lyon和Glatz，1993）。丙酸菌作为接种剂来提高青贮饲料的有氧稳定性。密希根大学的科研工作人员将丙酸菌接种到高水分青贮玉米中，56天开窖后，分析短链脂肪酸、酵母菌及霉菌的含量，发现接种丙酸菌比未接种的高水分玉米青贮丙酸含量高，酵母菌和霉菌含量低。它们后来从高水分玉米青贮中分离出一株丙酸菌，并利用试管作为青贮设备评定了这株丙酸菌在全株玉米青贮中的作用，结果表明25天发酵后，接种丙酸菌与添加1丙酸的玉米青贮中酵母和霉菌的数量相同，但比对照组少（Dawson等，1991&199
17、3）。丙酸菌作用效果很不稳定，通常在pH下降缓慢和终pH值较高（4.2-4.5）的情况下才有效，例如，Flores-Galaraza等（1992）在高水分玉米青贮中（终pH值4.5）添加P.shermanii，阻碍了霉菌的生长并显著的减少发酵初期酵母的数目，Dawson等（1998）也报道了相似的结果。Weinberg等（1995）发现添加丙酸菌对狼尾草和玉米青贮几乎没有影响（终pH值4.0），但是当pH值下降缓慢时提高了小麦青贮的有氧稳定性。Bolsen等（1996）在玉米青贮（终pH3.6）中使用丙酸菌增加了丙酸生成量，减少了霉菌和酵母的数量，提高了有氧稳定性。相反，Weinberg等（1
18、995）和Higginbotham等（1998）报道使用丙酸菌基本无效。4青贮接种剂对动物生产性能的影响Harrison（1990）总结了17个奶牛饲喂接种剂处理青贮饲料（主要是苜蓿青贮）的试验结果，其中15个试验结果表明对青贮发酵有明显改善，奶牛饲喂接种的青贮料，多增加采食量0.45kgd-1，多产标准奶0.68kgd-1。Kung和Muck（1997）总结了19901995年期间发表的使用青贮接种剂的文献，28研究提高了家畜采食量（n=67），53提高了增重（n=15），47提高了奶牛产奶量（n=36）。在提高了产奶量的试验中，平均提高量为1.4kgd-1。Bolsen等（1992）报道了
19、使用接种剂可以提高饲料转化效率1.8%，每吨使用接种剂的青贮料可以使阉牛多增重1.6公斤以上。生产性能的提高可能与干物质消化率存在某种联系，在提高了干物质消化率的16个试验中，有9个提高了动物的生产性能，相反在对干物质消化率无影响的14个试验中，仅有5个提高了动物的生产性能（Kung和Muck，1997）。Kung等（2003b）总结了12个由北美和欧洲的大学和政府研究机构采用Lactobacillus plantarumMTD1进行的奶牛试验，统计学研究表明，尽管接种剂对采食量没有影响，但可以提高4.6%的产奶量，并且这些试验涵盖了不同原料（禾本科牧草、玉米和苜蓿）和不同的DM含量（150-
20、460gkg-1）。事实上，在一些研究中，尽管对发酵的常规指标没有影响，但仍然提高了动物的生产性能（Gordon，1989；Kung等，1993）。接种剂对动物生产性能的影响很不稳定，Rooke和Kafilzadeh（1994）报道了多种同型发酵乳酸菌促进了青贮发酵，但只有一种提高了动物的生产性能。导致接种剂效果差异的原因很多，如添加的数量、细菌的种类、作物品种、水分含量等。Satter等（1988）发现，除非接种的乳酸菌超过作物自然附着的耐酸乳酸菌数量的10倍，否则不能影响动物的生产性能。在接种菌用量超过其10倍试验中，产奶量平均提高了3%。此外，产品所含的乳酸菌名字相同未必是同一株细菌，比
21、如说植物乳杆菌就有很多种（Mahanna，1993）。5接种剂的使用当接种菌数目在105106cfug-1FM就可以抑制植物体附着的野生乳酸菌，从而主导发酵（Weinberg和Muck，1996），Ranjit等（2002）的试验表明当布氏乳杆菌用量大于5105cfug-1FM可以达到满意的效果。Pitt和Leibensperger（1987）建议接种菌的数目至少应该超过野生乳酸菌数目的10倍才能在青贮过程中主导发酵。微生物接种剂通常是冻干的粉末或颗粒，辅以碳酸钙、干燥的脱脂奶粉、乳清粉和乳糖等载体。也有液体的产品，但由于乳酸菌容易受热和水分的影响而显得不稳定。接种剂要保存于阴冷干燥的地方，也
22、可以冷冻保存，保质期为6个月到两年不等。使用时可以直接以粉末形式添加，或使用前先溶解于不含氯的洁净的水中。溶于水中添加对于较为干燥的原料可以获得更低的pH值（Pahlow和Weissbach，1999；Whiter和Kung，2001）。由于乳酸菌不能自己游走，所以一定要喷洒均匀，未使用完的液体超过48h要废弃，因为乳酸菌的活力会下降，并且溶液可能被有害菌污染。由于不同的微生物青贮接种剂作用功效不同，选择接种剂要以生产目的为依据，如果有氧腐败已经威胁到了动物的生产性能，就应该选择布氏乳杆菌或丙酸菌，如果目标是为了保证青贮发酵成功、提高动物的生产性能和干物质回收率，那么最好选择同型发酵乳酸菌接种
23、剂。6展望尽管青贮实践已有千余年的历史，但由于青贮发酵过程十分复杂，同时受很多因素影响，至今人们仍未完全掌握青贮发酵进程，也没用一种青贮添加剂被认为绝对有效的。但青贮饲料为反刍动物生产带来了的巨大经济效益，促使人们不断的探索青贮发酵规律及其调控措施。我国对青贮饲料的研究起步较晚，特别是青贮生产中应用添加剂的数量和种类都很少，与发达国家存在很大差距，这与我国目前的生产力发展水平是极不相适的。近几年来，我国奶牛生产突飞猛进，对青贮饲料的需求越来越多，落后的青贮技术成了制约反刍动物生产的主要因素。国内对于青贮饲料的研究大多是来源于饲养实践，真正的实验室研究很少，而近年来许多国外的生物制剂产品进入我国
24、市场，由于对新事物认识不足，使得很多生产者不知道如何选择自己需要的产品。随着可持续发展的要求和生产成本的降低，具有腐蚀性的青贮添加剂逐渐退出了历史舞台，接种剂以其无毒、无害、廉价及使用方便等优点吸引着消费者。尽管国外青贮接种剂已经应用了数十年，而到目前为止我国还没有自主研发的接种剂产品，所以亟待加强这方面的研究。目前国内外对于青贮接种剂的研究主要集中于两个方面。一是解释接种菌提高动物生产性能的原因。改善发酵有利于提高动物的生产性能，但是不能明确的解释所有的接种剂产生的影响，动物生产性能的改善对于发展接种剂更进一步的提高动物的生产力具有重要意义，这也许会促进提高产奶量和育肥效率的新产品产生。另一个方面是新型青贮接种剂（如Lactobacillus buchneri 40788）对青贮饲料有氧稳定性的影响及其作用机理。作为一种有效的生物制剂，人们对它还需要进一步了解，特别是它对发酵进程、发酵产物和动物生产性能的影响。除了以上两个方面，还有一些有意义的研究，如筛选更廉价而有效的乳酸菌或丙酸菌；构建产纤维素酶、半纤维素酶或淀粉酶的基因工程乳酸菌，以解决可溶性碳水化合物短缺作物的青贮问题等。参考文献（略）
