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1、玉米大豆间作条件下根际微生物多样性的研究进展,内容,1.引言,2.土壤微生物多样性,3.土壤微生物多样性的研究方法,4.影响土壤微生物多样性的因素,5.玉米大豆间作条件下根际微生物多样性的研究进展,6.展望,间作是指空间上的多样性种植，在同一地点同一生长季节同时种植两种或两种以上的作物并呈一定比例分行或分带种植的一种种植制度。(Willey,1979,Field Crops Abstract；刘巽浩,1993,中国耕作制度M),间作是世界农业广泛采用的一种种植制度，也是中国传统种植制度。它具有显著提高粮食产量、提高土地利用率、有效控制病害、促进作物养分吸收利用、提高水分和光能利用率等方面的优势
2、。(Li et.al,2007,PNAS;Zhu et.al,2000,Nature;贺佳等,2011,作物杂志;董艳,2012,土壤通报),引言,银叶草,玉米,象草,木豆,大豆,相思树,Plant perennials to save Africas soils(D.Glover.et.al,2012,nature),引言,自然生态系统中地上部生物多样性与地下部生物多样性存在紧密联系。(David A.Wardle.et.al,2004,Science),间作体系中的地上部植物多样性是否对地下部根际微生物多样性产生影响?,而根际微生物多样性又是土壤微生物多样性的最活跃部分。,土壤微生物是土壤
3、中一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称,通常包括古菌、细菌、放线菌、真菌、病毒、原生动物和显微藻类等。(黄昌勇,2000,土壤学M；崔金香,2010,河南农业科学),影响土壤微生物活性的环境因素：温度、水分及其有效性、pH、氧气和Eh值、土壤管理措施等。(黄昌勇,2000,土壤学M),引言,土壤微生物在土壤生态系统中的主要作用 分解土壤有机质和促进腐殖质形成；吸收、固定并释放养分，对植物营养状况的改善和调节；与植物共生促进植物生长，如豆科植物的固氮；分解土壤有机碳、氮使土壤产生微量气体；在有机物污染和重金属污染治理中起监测、防护及修复作用；能帮助植物适应养分胁迫环境，改善土壤养分的吸收利用
4、。,(李娟,2008,中国农业科学院D；叶协锋,2009,土壤通报),引言,内容,1.引言,2.土壤微生物多样性,3.土壤微生物多样性的研究方法,4.影响土壤微生物多样性的因素,5.玉米大豆间作条件下根际微生物多样性的研究进展,6.展望,土壤微生物多样性,即指土壤生态系统中所有的微生物种类、它们拥有的基因以及这些微生物与环境之间相互作用的多样化 程度。一般认为,土壤微生物多样性存在于基因、物种、种群以及群落等4个层面,是土壤生态系统的 一个基本生命特征,也是时间和空间的函数。当前研究主要集中在物种多样性、遗传多样性、结构多样性及功能多样性等4个方面。,(林先贵和胡君利,2008,土壤学报),土
5、壤微生物多样性,内容,1.引言,2.土壤微生物多样性,3.土壤微生物多样性的研究方法,4.影响土壤微生物多样性的因素,5.玉米大豆间作条件下根际微生物多样性的研究进展,6.展望,生物或化学方法包括：1.传统的平板计数法;2.荧光染色法;3.Biolog微平板分析、4.磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid,PLFA)谱图分析方法;5.脂肪酸甲酯(fatty acid methyl esters,FAME)谱图分析方法等。,土壤微生物多样性的研究方法,(周桔和雷霆,2007,生物多样性；李娟,2008,中国农业科学院D;林先贵和胡君利,2008,土壤学报),根据研究技术类型，
6、土壤微生物多样性的研究方法分两大类：基于生物或化学的方法和基于现代分子生物学技术的方法。,分子生物学方法分为两个方面：一是基于分子杂交技术的分子标记法,荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)、同位素标记技术等,二是基于PCR技术的研究方法,随机扩增多态性DNA技术(random amplified polymorphic DNA,RAPD)、扩增片段长度多态性技术(amplified fragment length polymorphism,AFLP)、限制性片段长度多态性技术(restriction fragment length po
7、lymorphism,RFLP)和末端限制性片段长度多态技术(terminal restriction fragment length polymorphism,T-RFLP)、单链构象多态性技术(single-strand conformational polymorphism,SSCP)、变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gelelectrophoresis,DGGE)和温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE)、核糖体基因间区分析(ribosomal intergenic spacer analys
8、is,RISA)等。实时荧光定量 PCR 技术（Real time fluorescence quantitative PCR）,(周桔和雷霆,2007,生物多样性；李娟,2008,中国农业科学院D;林先贵和胡君利,2008,土壤学报),土壤微生物多样性的研究方法,从研究的层次上划分,土壤微生物多样性的研究方法大体上可分为三类：遗传多样性、物种多样性和功能多样性。1.土壤微生物遗传多样性主要通过分子生物学技术,从分子水平上研究土壤微生物多样性；2.土壤微生物物种多样性主要从对微生物类群即细菌、真菌和放线菌这三大类群的数量及其比例组成来描述微生物多样性,或者按照微生物在生态系统中的作用将其划分成
9、不同的功能群(function group),通过某一功能群中物种的分类及其数量来研究土壤微生物多样性；如对土壤中的根瘤菌的多样性进行研究；3.土壤微生物功能多样性指包括微生物活性、底物代谢能力及与营养元素在土壤中转化相关的功能等,通过分析测定土壤中的一些转化过程,如有机碳、氮矿化速率等来了解土壤微生物功能，如对碳源利用功能分析时常用Biolog微平板法。(周桔和雷霆,2007,生物多样性),土壤微生物多样性的研究方法,土壤微生物的多样性是非常丰富的，1g土壤含有5000到10000种微生物;1 kg土壤中可能含5亿个细菌、约100 亿个放线菌、近10 亿个真菌，土居原生动物也可达5 亿个。(
10、V.Torsvik,1990,APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY;姚槐应等,2006,土壤微生物生态学及其实验技术M),土壤微生物多样性的研究方法,1.稀释平板计数法,土壤中仅有0.1%10%的土壤微生物是可以培养的，直接培养法得到的只是很少一部分土壤微生物群落的组成信息。(沈菊培,2007,应用生态学报),2.Biolog 微平板法,土壤微生物多样性的研究方法,Biolog方法是将土壤悬液接种到Biolog微平板上，该平板上含有31种（Eco板）不同的C源，微生物在利用碳源过程中产生的自由电子，与四氮唑盐染料发生还原显色反应，颜色的深浅可以反映微生物
11、对碳源的利用程度和情况。由于微生物对不同碳源的利用能力很大程度上取决于微生物的种类和固有性质，因此在一块微平板上同时测定微生物对不同单一碳源的利用能力（Sole carbon source utilization,SCSU），就可以鉴定纯种微生物或判定和分析微生物群落的功能代谢能力差异情况。,(李娟,2008,中国农业科学院D),碳源PM板,加入土壤悬液,加入土壤悬液,培养后显色,显色读数,2.Biolog 微平板法,Biolog方法用于环境微生物群落研究，具有以下特点：（1）灵敏度高，分辨力强；对多种单一碳源的利用能力(SCSU)的测定可以得到被测微生物群落的代谢特性指纹（metabolic
12、 finger print），分辨微生物群落的微小变化；（2）无需分离培养纯种微生物，可最大限度地保留微生物群落原有的代谢特性；（3）测定简便，数据的读取与记录可以由计算机辅助完成。缺点是仅能鉴定快速生长的微生物。,土壤微生物多样性的研究方法,(李娟,2008,中国农业科学院D),土壤微生物多样性的研究方法,3.磷脂脂肪酸（Phospholipid fatty acid,PLFA）分析法,磷脂脂肪酸（Phospholipid fatty acid,PLFA）分析是一种生物化学的方法，它用于分析微生物群落的多样性。由于：PLFA 图谱可代表整个活的微生物群落；不同的微生物具有不同的 PLFA 种
13、类；微生物的 PLFA 含量与微生物生物量具有一定的比例关系。,此方法无需进行生物培养就能评价微生物的多样性，但测试结果常受有机质等因素的干扰。,(李娟,2008,中国农业科学院D),4.分子生物学方法,土壤微生物多样性的研究方法,1.PCR-DGGE（PCR-变性梯度凝胶电泳技术）,根据序列中碱基组成的不同，将片段大小相同的 DNA 序列分开。在 dsDNA 分子中，A、T 碱基之间有2个氢键，而 G、C 碱基之间有3个氢键连接，因此，A、T 碱基对变性剂的耐受性要低于 G、C 碱基对。由于这四种碱基的组成和排列差异，使碱基组成和排列不同的 dsDNA 分子具有不同的解链程度。理论上认为，只
14、要选择的电泳条件如变性剂、电泳时间、电压等足够精细，仅有一个碱基差异的 DNA 片段都可以被分开。,(李娟,2008,中国农业科学院D),首先，DGGE 最多能分离 1kb 的 DNA 片段，但通常选用的片段只有几百个碱基，因此这些序列只能提供有限的系统发育信息；第二，如果选用的实验条件不恰当，不能保证可以将有一定序列差异的 DNA 片段完全分开，从而会出现序列不同的 DNA 迁移到胶的同一位置；第三，有些细菌具有多个操纵子，DGGE 能将其在 PCR 时形成的不同序列分离开，这样就可导致过高的估计环境中的微生物多样性；第四，DGGE 只能检测到一定数量的微生物的存在，通常只能检测到环境中的优
15、势菌群的存在。,1.PCR-DGGE（PCR-变性梯度凝胶电泳技术）,(李娟,2008,中国农业科学院D),(沈菊培等，2007，应用生态学报；贺纪正等，2012，土壤学报),5.土壤宏基因组学,传统的基于培养的研究方法只能反映土壤中少数(0.1%10%)微生物的信息,而大部分微生物目前还不能培养,这对于认识土壤微生物群落组成和功能有其局限性。宏基因组学直接从环境样品中提取全部微生物的DNA，或通过测序探究环境中微生物的群落结构和功能(序列驱动)，或构建宏基因组文库，筛选新的基因或生物活性物质(功能驱动)，克服了传统培养方法的缺陷，极大地丰富了对土壤微生物多样性及其功能的认知。,目前对宏基因组
16、测序，采用的有传统的Sanger(鸟枪法)和新一代的测序技术。新一代的测序技术由于其高通量、快速、低成本的特点，第二代甚至第三代测序技术已经迅速发展起来并得到了越来越普遍的应用，传统的Sanger 法在大规模测序上有被取代的趋势。,第二代测序技术主要包括:1.罗氏454 公司的GSFLX 测序平台;2.Illumina 公司的Solexa Genome Analyzer测序平台;3.ABI 公司的SOLiD 测序平台。,(沈菊培等，2007，应用生态学报；贺纪正等，2012，土壤学报),第二代测序技术的优缺点:1.454 测序平台虽然测序成本较高，但读长长，在环境DNA 样品的宏基因组测序中应
17、用较多;2.Illumina Solexa 和SOLiD 平台读长较短，但数据量大，性价比高，目前多用于基因组重建和深度再测序;选择不同平台时应考虑到实验目的和实验室条件。,土壤微生物生态学研究的是微生物群落的结构与功能，及其与无机环境间的相互影响，采用的则是对DNA 序列进行获取和分析的方法。基于宏基因组的微生物生态学研究手段主要可以分为三类：1.16S/18S rDNA 或其他标记基因调查;2.大尺度DNA 测序;3.杂交或微列阵方法。,根际微生物对植物生长具有重要意义，将植物生长状况与根际微生物宏基因组状况联系起来可以更好地理解植物微生物相互关系。,(沈菊培等，2007，应用生态学报；贺
18、纪正等，2012，土壤学报),内容,1.引言,2.土壤微生物多样性,3.土壤微生物多样性的研究方法,4.影响土壤微生物多样性的因素,5.玉米大豆间作条件下根际微生物多样性的研究进展,6.展望,影响土壤微生物多样性主要是自然因素和人为因素。一、自然因素包括气候环境、植被、土壤质地、土壤温湿度、土壤pH和土壤中矿物质及有机物质的含量等多种因素的影响。二、人为因素包括农药和化肥的使用、不同的农业耕作方 式、种植制度与农田植被类型等由于影响着土壤的物理化学性质及土壤环境而影响着土壤微生物多样性。,影响土壤微生物多样性的因素,(周桔和雷霆,2007,生物多样性；杨文亭等,2011,土壤通报),Soil
19、Fertility and Biodiversity in Organic Farming(Paul Mader,2002,Science),21年基于草地循环系统，7年一个轮作循环，DOK系统比较试验（bio-Dynamic,bio-Organic,and“Konventionell”）,土壤微生物功能多样性和代谢商呈负相关。有机试验小区的高多样性与较低的qCO2相关，表明高多样性的微生物群体的高能量效率。Shannon 指数在传统系统(CONFYM,CONMIN)和BIODYN系统之间差异显著；对于qCO2在CONMIN and BIODYN差异显著(p0.05),生物有机和传统的农业系统
20、的21年的研究结果表明：微生物多样性方面明显地增加。CONMIN CONFYM BIOORG BIODYN伴随的是在代谢商(qCO2)方面的下降。在有机农业系统中低的qCO2，特别是在BIODYN系统中，表明了这些微生物群体是能使用有机物质来促进植物生长而不仅仅是为了保持。(Paul Mader,2002,Science),轮作和连作对土壤微生物多样性的影响,贾志红等(2010)对比研究了贵州福泉烟区轮作和连作对土壤细菌群落多样性的影响。轮作处理细菌群落丰富度指数均大于连作处理，轮作细菌群落多样性大于连作细菌多样性。表明轮作微生物多样性较连作高，轮作方式可以提高植烟土壤细菌群落的多样性。(贾志
21、红等,2010,生态环境学报),欧阳娴等(2011)研究了相邻的轮作3年韭菜(香蕉-韭菜3年-香蕉)的香蕉地和连作5年香蕉地,通过PCR-DGGE 和克隆核苷酸序列相结合的方法,分析土壤细菌主要类群的变化。从DGGE 图谱中发现,香蕉-韭菜轮作地比香蕉连作地的微生物多样性要高,这可能意味着韭菜轮作提高了土壤细菌多样性.因此,韭菜轮作能减少香蕉枯萎病的发生,除韭菜根系的分泌物对土居香蕉枯萎病菌产生了一定的影响外,韭菜轮作导致土壤主要细菌类群的不同、以及丰富的土壤细菌多样性也可能是影响病害发生的一个重要因素。(欧阳娴等,2011,应用生态学报),轮作和连作对土壤微生物多样性的影响,冯俊喜等(201
22、1)应用磷脂脂肪酸（PLFA）技术对山东烟区不同烤烟种植模式下（烤烟连作、绿肥-烤烟轮作、小麦-烤烟轮作和小麦-烤烟套作）耕层（025 cm）土壤微生物群落结构的动态变化进行了调查。结果表明：4 种烤烟种植模式下耕层土壤微生物群落的3 个多样性指数随取样时间变化不大，其中小麦/烤烟套作的微生物多样性指数在各个取样时期均为最大。但是4 种烤烟种植模式在当地的试验年限还相对较短，需长期定位研究进一步论证。(冯俊喜等,2011,中国烟草科学),轮作和连作对土壤微生物多样性的影响,内容,1.引言,2.土壤微生物多样性,3.土壤微生物多样性的研究方法,4.影响土壤微生物多样性的因素,5.玉米大豆间作条件
23、下根际微生物多样性的研究进展,6.展望,玉米大豆间作条件下根际微生物多样性的研究进展,刘均霞等(2007)通过盆栽实验,研究了玉米间作大豆对根际土壤微生物数量和酶活性的影响;在玉米喇叭口期、大豆分枝期分别对间作玉米、间作大豆、单作玉米、单作大豆根际土壤取样测定。与单作相比,间作体系中的玉米、大豆根际土壤微生物数量、显著高于相应单作根际土壤。(刘均霞等,2007,贵州农业科学),(刘均霞，2008，贵州大学D),间作促进玉米和大豆根际土壤微生物数量和生物化学强度的提高，使土壤中有效养分含量增加，有利于作物吸收利用养分，提高养分的有效性，从而使根际土壤养分资源得到高效利用。,大田试验和盆栽试验结果
24、分析表明，间作有利于作物根区土壤微生物数量和酶活性的提高。,玉米大豆间作条件下根际微生物多样性的研究进展,张向前等(2012)采用盆栽试验及种间根系分隔技术研究了施氮肥和不施氮肥两种条件下根系互作在大豆玉米间作中所发挥的优势作用。结果表明：施氮肥和间作作物根系的互作增加土壤中的细菌、真菌、放线菌和固氮菌的数量。,(张向前等,2012,土壤学报),玉米大豆间作条件下根际微生物多样性的研究进展,展望,1.目前对玉米大豆间作条件下的根际微生物的多样性研究国内主要以盆栽试验为主，田间试验研究较少；2.对玉米大豆间作条件下的根际微生物的多样性研究国内主要研究根际微生物的物种多样性；3.对玉米大豆间作条件下的根际微生物的多样性研究应深入到功能多样性和遗传多样性的研究；,谢谢！,
