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1、西 南 交 通 大 学本科毕业设计（论文）SeO2/t-BuOOH复合氧化剂对维生素D31位羟基化的工艺研究年 级：2004 级学 号：姓 名：专 业：生物工程指导老师： 2008 年 6 月 摘 要维生素D为固醇类衍生物，是一种重要的脂溶性维生素，在体内以其活性代谢物1,25-二羟基维生素D的形式发挥作用，可以提高人体的对钙磷的吸收，促进骨生长和骨骼钙化。维生素D主要有维生素D2和D3，以维生素D3为主。近年来研究发现1,25-二羟基维生素D3对治疗多种疾病如佝偻病、肾脏骨营养不良、骨质疏松、非白血性白血病、乳腺癌、前列腺癌、艾滋病等有着很高的潜力 。1-羟基维生素D3又称阿法骨化醇，是一种
2、重要的维生素D3活性代谢物，可不经肾脏由肠道迅速吸收进入血液，经肝脏微粒体25-羟基化酶作用使侧链25位羟基化后生成具有活性的1,25-二羟基维生素D3分布于肠道及骨等靶组织内与受体结合而表现出促进肠道吸收钙的作用、骨盐溶解作用以及骨形成作用等一系列生理活性。国内外报道的阿法骨化醇的合成方法，一般以维生素D3为原料，经过酯化、环化、氧化、开环、水解五步最终生成阿法骨化醇。本次毕业设计实验包括三步反应，第一步由维生素D3和对甲苯磺酰氯生成维生素D3对甲苯磺酸酯；第二步由上步产物与NaHCO3、无水甲醇生成3,5-环合维生素D3;第三步用SeO2/t-BuOOH做氧化剂，最终合成1-羟基3,5-环
3、合维生素D3，最主要的反应就是第三步氧化反应，这步反应的收率很低，所以本次设计的主要目的就是提高反应的收率。在生产实践和科学实验中，为了寻求最优化生产和实验条件，都需要做许多实验。如果影响实验的因素较多，这时就需要通过正交设计的方法，科学的安排实验，减少实验次数，获得有效的结果。本次设计为了找出氧化反应的最优反应条件，首先做了几组实验，结果显示影响氧化反应的主要因素是反应时间、SeO2：TBHP的摩尔比以及反应温度，并由此确定正交设计的因素水平表为三因素三水平表；接着根据因素水平表选择出合适的正交表L9(34)，最后进行了9组正交试验实验再经过正交分析确定了最佳的实验条件。提高了产物的收率。实
4、验过程中需要用到一些试剂，在进行实验前需要自己制备，如无水甲醇、过氧化叔丁醇（TBHP）、无水二氯甲烷等。关键词： 维生素D3；SeO2/t-BuOOH；1-羟基维生素D3；正交设计AbstractVitamin D for the steroid derivatives, is an important fat-soluble vitamin, to play a role in the form of its active metabolition 1,25-dihydroxy vitamin D in body,can improve the bodys absorption of ca
5、lcium and phosphorus,and promote bone growth and bone calcification.Vitamin D usually contains vitamin D2 and D3, mainly to vitamin D3.In recent years, the study found that 1,25-dihydroxy vitamin D3 has a very high potential in treatment of various diseases such as rickets, malnutrition of kidney, o
6、steoporosis, leukemia, breast cancer, prostate cancer and AIDS. 1-hydroxy vitamin D3 also known as alfacalcidol,is an important active metabolite of vitamin D3, can quickly absorbed by the intestine into the bloodstream not through the kidneys, then hydroxyed 25 side chain of activity by the liver m
7、icrosomal 25-hydroxy enzyme to formate the 1,25-dihydroxyvitamin D3, which distributed in the intestinal tract, bone and other target tissues, binding with the target receptor and demonstrated to promote calcium absorption of intestine, bone salt dissolution and bone formation as a series of physica
8、l activity. The domestic and foreign reports show that the main synthetic method of alfacalcidol , generally takes vitamin D3 as a raw material, after the esterification, the cyclization, the oxidation, the split-ring and the hydrolisis five steps, finally produces the alfacalcidol.The experiment of
9、 this graduation project includes three-step reactions, firstly, produces Vitamin D3 para-toluenesulfonic ester by Vitamin D3 and -toluene sulfonyl chloride; the second step gains 3,5 cyclovitamin D3 by the product of last step, the absolute methanol and NaHCO3; the third step makes SeO2/t-BuOOH as
10、the oxidant to synthesize 1-hydroxyl-3,5 cyclovitamin D3.The main reaction is the third step of reaction, the yield of this step is very low, so the main purpose of this design is to raise the yield of reaction.In the production practice and scientific experiments, in order to seek the optimal produ
11、ction and experimental conditions, we need to do many experiments. If the impact of the factors is more, we need to through the orthogonal design methods and scientific experimental arrangement to reduce the number of experiments, access to effective results. To identify the optimal conditions, firs
12、t of all, do several group of experiments,the result demonstrates that the major factors influencing oxidizing reaction is the reaction time, the mole ratio of SeO2 and TBHP,as well as the reaction temperature, and thus determines the level of orthogonal factors to three factors and three levels tab
13、le, then chooses the appropriate level of the orthogonal L9 (34) according to the factors table,finally carried on nine group of orthogonal experiments.In the end, to determine the best experimental conditions after the orthogonal analysis.Improve the yield of the product finally.In the course of ex
14、periments, some reagents is needed, we have to preparate them before the experiment , such as anhydrous methanol, tert-Butyl hydroperoxide (TBHP), and anhydrous dichloromethane.Key words :Vitamin D3 ; SeO2/t-BuOOH ;1-hydroxy vitamin D3;The orthogonal design目 录第1章 绪论11.1 维生素21.1.1 维生素概述21.1.2 维生素的分类3
15、1.2 维生素D41.2.1 维生素D简介41.2.2 维生素D的生理作用及毒性41.2.3 维生素D的代谢51.2.4 维生素D3 的主要活性代谢产物91.3 维生素D3活性代谢物合成的国内外研究现状121.3.1 1,25-二羟基维生素D3合成的研究现状121.3.2 1-羟基维生素D3合成的研究现状251.4 烯丙位氧化的几种方法：261.4.1 以过渡金属氧化物为氧化剂或催化剂的烯丙位氧化271.4.2 硒化合物在烯丙位氧化中的应用311.4.3 其它的烯丙位氧化方法341.5 本次设计的主要思路36第二章 实验部分372.1 实验材料及仪器372.1.1 实验材料372.1.2 实验
16、仪器382.2 实验内容382.2.1 部分试剂的制备392.2.2 实验原理与步骤392.2.3 实验结果及分析：412.3 正交设计分析及实验优化452.3.1确定因素和水平452.3.2选用合适的正交表452.3.3实验结果462.3.4 正交试验结果分析472.4 问题与讨论512.4.1反应机理推导与讨论512.4.2 实验结果分析与讨论53结论55致谢56参考文献：57第1章 绪论维生素是一种特殊的营养成分，它们的化学成分和结构不尽相同，但对人体却有类似的生理功能和营养意义。维生素是人和动物维持正常生命活动与健康所必需的微量有机化合物，现已证明，大多数维生素是机体内某些酶的辅酶的组
17、成成分，在物质代谢中起重要作用，没有维生素，人就无法维持生命，同时，每种维生素有着不同的功能，他们之间不能互相取代。维生素，顾名思义是维持生命的要素。它存在于各类食物中，跟其他营养成分最大的差别是既不供给热量，也不构成人体组织，只需少量就能满足生理需要。正因为如此，人们常常忽略了维生素的补充，但人一旦缺乏维生素，就会发生各种各样的疾病。如维生素A用于治疗夜盲症；维生素B1用于脚气病；烟酸用于糙皮病；维生素C用于坏血病；维生素D用于佝偻病1。维生素D是一种脂溶性维生素，主要有维生素D2和D3两种，其中应用最广的是维生素D3，是人和动物皮下含的7-脱氢胆固醇（即维生素D3原）在紫外照射后转变而成，
18、又名胆钙化醇。维生素D3有着重要的生理功能，调节体内的钙磷代谢水平并参与骨的形成，最近研究还发现其在治疗和预防许多疾病（如佝偻病、肾脏骨营养不良、骨质疏松、非白血性白血病、乳腺癌、前列腺癌、艾滋病等）有着很高的潜力 。维生素D3本身没有生理活性，在体内以1,25-二羟基维生素D3的形式发挥作用。2正常情况下人体可以自身合成或从食物中摄取足够的维生素D，并将其转化为活性形式。但一些肾脏功能不全的人和大多数老年人血浆1,25-二羟基维生素D3水平降低，尤其在65岁以上老年人中。有研究显示,健康且积极活动老年人的1,25-二羟基维生素D3水平无明显的增龄改变，而对于住院失去活动能力又未补充维生素D的
19、老年人，血浆1,25-二羟基维生素D3水平则显著降低。1,25-二羟基维生素D3增龄性的下降与维生素D结合蛋白(DBP)、25-OH维生素D3(即维生素D营养缺乏)和雌激素缺乏，肾1羟化酶活性降低或1,25-二羟基维生素D3的代谢清除有关。阿法骨化醇（1-羟基维生素D3）不是维生素D在体内的代谢产物，系人工合成制剂，在体内转化为1,25-二羟基维生素D3发挥其生物活性作用。 1-羟基维生素D3的合成主要有5步：酯化、环化、氧化、开环、水解4。其中最主要的一步是通过SeO2/BuOOH复合氧化剂对维生素D3 1位进行羟基化，这是一种有效烯丙位氧化方法，在有机合成中经常用到烯丙位氧化，有效且对环境
20、无污染的氧化剂将是以后研究的主要方向。1.1 维生素1.1.1 维生素概述维生素的发现是20世纪的伟大发明之一。1897年，C.艾克曼在爪哇发现只吃精磨的白米即可患脚气病，未经碾磨的糙米能治疗这种病。并发现可治脚气病的物质能用水或酒精提取，当时称这种物质为“水溶性B”。1906年证明食物中含有除蛋白质、脂类、碳水化合物、无机盐和水以外的“辅助因素”，其量很小，但为动物生长所必需。1911年C.丰克鉴定出在糙米中能对抗脚气病的物质是胺类（一类含氮的化合物），它是维持生命所必需的，所以建议命名为“ Vitamine”。即Vital（生命的）amine（胺）,中文意思为“生命胺”。以后陆续发现许多维
21、生素，它们的化学性质不同，生理功能不同；也发现许多维生素根本不含胺，不含氮，但丰克的命名延续使用下来了，只是将最后字母“e”去掉。最初发现的维生素B后来证实为维生素B复合体，经提纯分离发现,是几种物质，只是性质和在食品中的分布类似，且多数为辅酶。有的供给量须彼此平衡，如维生素B1、B2和PP，否则可影响生理作用。维生素B复合体包括：泛酸、烟酸、生物素、叶酸、维生素B1（硫胺素）、维生素B2（核黄素）、吡哆醇（维生素B6）和氰钴胺（维生素B12）。有人也将胆碱、肌醇、对氨基苯酸（对氨基苯甲酸）、肉毒碱、硫辛酸包括在B复合体内。 维生素是维持人体生命活动必需的一类有机物质，也是保持人体健康的重要活
22、性物质。维生素在体内的含量很少，但在人体生长、代谢、发育过程中却发挥着重要的作用。各种维生素的化学结构以及性质虽然不同，但它们却有着以下共同点：维生素均以维生素原(维生素前体)的形式存在于食物中；维生素不是构成机体组织和细胞的组成成分，它也不会产生能量，它的作用主要是参与机体代谢的调节；大多数的维生素，机体不能合成或合成量不足，不能满足机体的需要，必须经常通过食物中获得；人体对维生素的需要量很小，日需要量常以毫克(mg)或微克(ug)计算，但一旦缺乏就会引发相应的维生素缺乏症，对人体健康造成损害。维生素与碳水化合物、脂肪和蛋白质3大物质不同，在天然食物中仅占极少比例，但又为人体所必需。维生素大
23、多不能在体内合成，必须从食物中摄取。维生素本身不提供热能。有些维生素如 B6、K等能由动物肠道内的细菌合成，合成量可满足动物的需要。动物细胞可将色氨酸转变成烟酸(一种B族维生素)，但生成量不敷需要；维生素C除灵长类（包括人类）及豚鼠以外，其他动物都可以自身合成。植物和多数微生物都能自己合成维生素，不必由体外供给。维生素是人体代谢中必不可少的有机化合物。人体有如一座极为复杂的化工厂，不断地进行着各种生化反应。其反应与酶的催化作用有密切关系。酶要产生活性，必须有辅酶参加。已知许多维生素是酶的辅酶或者是辅酶的组成分子。因此，维生素是维持和调节机体正常代谢的重要物质。可以认为，维生素是以“生物活性物质
24、”的形式，存在于人体组织中。食物中维生素的含量较少，人体的需要量也不多，但却是绝不可少的物质。膳食中如缺乏维生素，就会引起人体代谢紊乱，以致发生维生素缺乏症。如缺乏维生素A会出现夜盲症、干眼病和皮肤干燥；缺乏维生素D可患佝偻病；缺乏维生素B1可得脚气病；缺乏维生素B2可患唇炎、口角炎、舌炎和阴囊炎；缺乏PP可患癞皮病；缺乏维生素B12可患恶性贫血；缺乏维生素C可患坏血病。 1.1.2 维生素的分类 维生素是个庞大的家族，就目前所知的维生素就有几十种，按照在油脂中和水中的溶解性不同可以大致分为两类：脂溶性维生素和水溶性维生素。脂溶性维生素包括维生素A、D、E、K等。脂溶性维生素的功能没有 B族维
25、生素那样清楚。维生素K参与一些蛋白质中谷氨酸的羧化，维生素D促进钙的吸收，维生素A为视紫蛋白的组成部分。脂溶性维生素大部分由胆盐帮助吸收，循淋巴系统到体内各器官。体内可储存大量脂溶性维生素。维生素A和D主要储存于肝脏，维生素E主要存于体内脂肪组织，维生素K储存较少。脂溶性维生素易溶于非极性有机溶剂，而不易溶于水，可随脂肪为人体吸收并在体内储积，排泄率不高。水溶性维生素包括B族维生素中的B1、B2、B6、B12以及维生素C、维生素L、维生素H、维生素PP、叶酸、泛酸、胆碱等。所有水溶性维生素都参与催化功能，B族维生素是许多种辅酶的组成成分，这些辅酶担负着氢、电子或基团的转移。它们参与由酶催化的糖
26、、脂肪、蛋白质及核苷酸等的代谢，维生素C参与许多羟化反应。水溶性维生素在动植物细胞中广泛存在。水溶性维生素从肠道吸收后，通过循环到机体需要的组织中，多余的部分大多由尿排出，在体内储存甚少。水溶性维生素易溶于水而不易溶于非极性有机溶剂，吸收后体内贮存很少，过量的多从尿中排出。有些物质在化学结构上类似于某种维生素，经过简单的代谢反应即可转变成维生素，此类物质称为维生素原，例如 -胡萝卜素能转变为维生素A；7-脱氢胆固醇可转变为维生素D3；但要经许多复杂代谢反应才能成为尼克酸的色氨酸则不能称为维生素原。1.2 维生素D1.2.1 维生素D简介维生素D于1926年由化学家卡尔首先从鱼肝油中提取。它是淡
27、黄色晶体，熔点115118，不溶于水，能溶于醚等有机溶剂。它化学性质稳定，在200下仍能保持生物活性，但易被紫外光破坏。维生素D是一族A、B、C和D环结构相同但侧链不同的分子的总和，是具有胆钙化醇生物活性的一类化合物，基本结构是环戊氢烯菲环。维生素D为固醇类衍生物，具抗佝偻病作用，又称抗佝偻病维生素。维生素D是一种脂溶性维生素，有五种化合物，最重要的成员是D2和D3。维生素D均为不同的维生素D 原经紫外照射后的衍生物。植物不含维生素D，但维生素D原在动、植物体内都存在。植物中的麦角醇为维生素D2原，经紫外照射后可转变为维生素D2，又名麦角钙化醇；人和动物皮下含的7-脱氢胆固醇为维生素D3原，在
28、紫外照射后转变成维生素D3，又名胆钙化醇。 维生素D2 分子式 C28H44O，维生素D3 分子式 C27H44O 。结构式如下（图1-1）：图1-11.2.2 维生素D的生理作用及毒性1.2.2.1 维生素D的生理作用 维生素D主要与钙和磷的代谢有关，它影响这些矿物质的吸收以及它们在骨组织内的沉积。维生素D在体内肝肾处转化为活性形式，并被动送至肠、骨和肾脏，与甲状旁腺素共同作用，维持血钙水平。当血钙水平较低时，在小肠可促进钙结合蛋白合成，从而增加钙磷吸收，也可促使钙在肾小管的重吸收，并将钙磷从骨中动员出来；当血钙过高时，促使甲状旁腺产生降钙素，阻止钙从骨中动员，以及增加钙磷从尿中排出。维生素
29、D促使骨与软骨及牙齿的矿物化，并不断更新以维持其正常生长。此外，维生素D对防止氨基酸通过肾脏时的丢失也有重要作用，且还具有免疫调节功能，可改变机体对感染的反应。总结如下： 1、 提高肌体对钙、磷的吸收，使血浆钙和血浆磷的水平达到饱和程度； 2、 促进生长和骨骼钙化，促进牙齿健全4； 3、 通过肠壁增加磷的吸收，并通过肾小管增加磷的再吸收； 4、 维持血液中柠檬酸盐的正常水平； 5、 防止氨基酸通过肾脏损失。1.2.2.2 维生素D的缺乏症及毒性缺乏维生素D导致肠道对钙和磷的吸收减少，肾小管对钙和磷的重吸收降低，造成骨髓和牙齿的异常矿化，继而使骨骼畸形。主要缺乏症为： 佝偻病： 维生素D缺乏，骨
30、髓不能正常钙化，变软，易弯曲，畸形，同时影响神经、肌肉、造血、免疫等组织器官的功能。多见于婴幼儿。 骨软化症：易发于成人，特别是妊娠、哺乳的妇女和老年人。主要表现为骨软化，易折断。初期腰背部、腿部不定位的时好时坏的疼痛，常在活动时加剧；严重时造成骨骼脱钙，骨质疏松，有自发性、多发性骨折5。维生素D的过量及毒性人体对维生素D的耐受性因人而异，一般每日摄取量不宜超过400IU（10G）。一些学者认为，长期短日摄入200IU（50G）的维生素D就可导致中毒。维生素D中毒的症状包括高血钙症、高尿钙症、厌食、恶心、呕吐、口渴、多尿、皮肤瘙痒、肌肉乏力、关节疼痛等。由于钙可在软组织内（如心脏、血管、肾小管
31、等）沉积，往往造成心脏、肾脏及大动脉钙化，引起心血管系统导常等并导致肾衰竭，这是死亡的主要原因。妊娠期和婴儿初期过多摄取维生素D，可引起出生体质量偏低，严重者可有智力发育不良及骨硬化。但通常膳食的维生素D来源一般不会造成过量。1.2.3 维生素D的代谢 维生素D是一组固醇类脂溶性维生素。其代谢产物1,25-二羟维生素D为维持人体钙磷代谢所必需的一种激素。维生素D2、D3皆可人工合成，维生素D4为人工合成的维生素D2类似物。维生素D2与维生素D3的生物化学特性及对人的生理功能相似。维生素D4对哺乳动物的作用只有维生素D3或维生素D2的2/3或3/4。维生素D5、维生素D6结构亦类似，对人类无重要
32、性。维生素 D经吸收进入人体血液，与特异的维生素D结合-球蛋白(DBP)相结合，迅速进入肝脏，经25-羟化酶的作用形成25-羟维生素D (25-OHD)；再经血到肾脏，由于1-羟化酶的作用，转化成生物活性很强的 1,25-二羟维生素D，其化学结构、生物学作用方式均似类固醇激素。它促进肠道对钙、磷的吸收；增进肾曲管对钙、磷的回吸收；促使钙、磷自骨中溶于血；同时促进钙、磷沉着于骨基质，故维生素 D能预防及治疗佝偻病和骨软化症。6图1-2 维生素D3在人体内的主要代谢过程见（图 1-2）。自皮肤形成的D3与 DBP结合经血入肝。口服的D3至小肠，在胆盐的作用下，与脂质一同自粘膜吸收成乳糜微粒经淋巴系
33、统入肝；注射的D3吸收后也经血入肝。在肝细胞微粒体经25-羟化酶的作用形成25-羟基维生素D3入血，25-羟基维生素D3为血清中多种维生素D代谢产物中含量多且最稳定的一种，其血清浓度可代表机体维生素D营养状态，正常值约1168ng/ml。25-OHD经血入肾,在近端曲管细胞的线粒体内经1-羟化酶的作用生成1,25-二羟维生素D3，其产生受内分泌系统的严格控制，其血清含量随人体对钙、磷的需要而增多或减少。血 PTH（甲状旁腺素）的升高及钙、磷降低，使1-羟化酶活性增强，致1,25-二羟维生素D3增多，血钙、磷增高时，24-R羟化酶活性增强，使24,25-二羟维生素D3增多。许多组织的细胞有1,2
34、5-二羟维生素D3的受体，如小肠粘膜细胞、骨细胞、肾远端曲管细胞、皮肤生发层细胞、胰岛细胞及乳腺细胞等。肾、肠、软骨等细胞的线粒体并有24-R羟化酶，在血钙、磷正常或升高时，25-羟基维生素D3在肾、肠经24-羟化酶羟化成24,25-二羟维生素D3，其生物活性远低1,25-二羟维生素D3。 正常人摄入D2或D3后，80以上可自小肠吸收,其代谢物与部分D2或D3自胆汁及粪便排泄。4以下自尿排出。摄入或充分晒太阳后合成较多量维生素D时，可储于脂肪及肝达数月。1,25-二羟维生素D通过细胞的特异受体作用于靶器官。促进钙、磷自小肠吸收。1,25-二羟维生素D与肠粘膜细胞的胞浆受体结合后，运入胞核，促进
35、基因表达合成钙结合蛋白(CaBP)，使钙离子(Ca2+)自小肠粘膜乳头上皮细胞的刷毛缘吸收；动员骨钙、磷到血，使骨钙与CaBP结合入血；使骨无机盐化，刺激成骨细胞，促使钙、磷沉着于骨；通过远端肾小管细胞受体，与 PTH共同增进钙的回吸收，血钙升高后抑制PTH(PTH增多尿磷)，而增加磷的回吸收；通过特异受体，增加皮肤生发层的7-脱氢胆固醇含量，使胰岛细胞增多胰岛素的产量，增加乳腺对钙的运转等。 血清钙降低时，PTH迅速升高，刺激肾1-羟化酶活性增强，产生1,25-二羟维生素D增多。血清磷降低则可直接增强肾1-羟化酶活性，增加1,25-二羟维生素D的形成。1,25-二羟维生素D可抑制1-羟化酶活
36、性，但引发24-R羟化酶活性。降钙素(CT) 与1,25-二羟维生素D提高血清钙、磷的作用相反，使钙、磷沉着于骨以保持骨的硬度，并避免血钙过高。血清钙升高可抑制肾1-羟化酶，但刺激24-羟化作用。1,25-二羟维生素D、PTH与CT互相反馈调节，以维持人体正常钙磷代谢。在妊娠和哺乳时，催乳素和雌激素可增加1,25-二羟维生素D的生成，以提高对钙的吸收。 维生素D3在体内的代谢过程：维生素D3在皮肤内的合成如（图1-3）：皮肤生发层的7-脱氢胆固醇（即维生素D3原）经紫外线照射，首先形成前维生素D3，在皮肤温度作用下，再转化成维生素D3(在体温下，约需36小时)。持续紫外线照射使部分前维生素D3
37、转化成光固醇或速固醇贮于皮肤内。前维生素D3用尽时，紫外线照射可使二者又转化为前维生素D3，再形成维生素D3，维生素D3与维生素D结合 -球蛋白结合入血。图1-3维生素D3的形成为光化学作用，不需酶类。紫外线不能穿透普通窗玻璃，但在户外荫凉处可受到紫外线照射，大气飘尘和衣着皆影响紫外线穿透。自皮肤形成的D3与 DBP结合经血入肝；口服D3至小肠，在胆盐的作用下，与脂质一同自粘膜吸收成乳糜微粒经淋巴系统入肝；注射的D3吸收后也经血入肝。在肝细胞微粒体经25-羟化酶的作用形成25-羟基维生素D3入血，25-羟基维生素D3为血清中多种维生素D3代谢产物中含量最多且最稳定的一种，其血清浓度可代表机体维
38、生素D营养状态,正常值约1168ng/ml。25-羟基维生素D3经血入肾,在近端曲管细胞的线粒体内经1- 羟化酶的作用生成1,25-二羟维生素D3，其产生受内分泌系统的严格控制，其血清含量随人体对钙、磷的需要而增多或减少。1.2.4 维生素D3 的主要活性代谢产物维生素D3的活性代谢产物才是在体内发挥生物活性作用的主要物质。在骨质疏松症治疗领域中，应用最广泛的维生素D活性代谢物制剂包括骨化三醇(1,25-二羟维生素D3，罗盖全)和阿法骨化醇即l-羟基维生素D3，其他还有骨化二醇(25-羟基维生素D3)、双氢速甾醇(DHT)也用于治疗骨质疏松症。严格地说，阿法骨化醇不是体内维生素D的活性代谢产物
39、，而是一种前体药物，在肝脏内代谢为具有生物活性的1,25-二羟维生素D3。下面主要介绍1,25-二羟维生素D3（骨化三醇）和1-羟基维生素D3（阿法骨化醇）。 1.2.4.1 1,25-二羟维生素D3 1,25-二羟基维生素D3是固醇类激素的家族成员，已被确认为肾脏分泌的一种激素或称D-激素，具有构成内分泌系统激素的4个关键成分。维生素D的生物活性作用主要是通过1,25-二羟维生素D3与靶器官组织细胞核上的VDR（维生素D结合蛋白）相互作用而产生功效，同时也通过膜VDR的非基因途径来发挥其快速的生物活性作用。7 VDR主要存在于肠、甲状旁腺和骨这些经典靶器官细胞中，也广泛存在于其他器官。因此，
40、VDR的功能本质上亦反映了1,25-二羟维生素D3的功能。细胞VDR水平受1,25-二羟维生素D3和其他类固醇激素包括雌激素、糖皮质激素和PTH的影响。VDR的不同基因型可能与骨量的峰值有关，VDR BB基因型可降低VDR的RNA水平，而低水平的VDR会降低钙吸收的能力。VDR基因型和骨量、骨质疏松有一定关系。 在不同靶组织上1,25-二羟维生素D3有不同的功能。肠道1,25-二羟基维生素D3通过VDR核受体合成钙结合蛋白(Calbindin)-9K和28K来增加主动转运和促进钙吸收；骨组织1,25-二羟基维生素D3通过刺激骨细胞分化和碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白和胶原的合成(体外实验中胶原合
41、成随成骨细胞密度、时间、分化阶段不同而有差异)，抑制骨吸收细胞因子的产生，如白细胞介素(IL)-l、肿瘤坏死因子(TNF) 等。体外实验表明，1,25-二羟基维生素D3增加转化生长因子(TGF)水平，而TGF-是刺激成骨细胞增殖和分化的重要因子，因此1,25-二羟基维生素D3有促骨形成作用。在体外实验中，大剂量1,25-二羟基维生素D3可促进破骨细胞分化，而在体内生理剂量时可通过增加钙的吸收和抑制PTH的分泌而抑制骨吸收。甲状旁腺1,25-二羟基维生素D3直接作用于甲状旁腺细胞，抑制PTH的分泌。1,25-二羟基维生素D3对骨代谢的作用主要有：对骨形成的作用 a. 间接作用 活性维生素D可促进
42、肠钙吸收，提高血钙浓度，使钙在骨中沉积，给骨矿化提供原料是其对骨形成的间接作用； b. 直接作用 成骨细胞是活性维生素D作用的重要靶器官，1,25-二羟基维生素D3不论在体内和体外都具有调节成骨细胞的分化和活性作用，且来源不同的成骨细胞也有不同反应。体外培养显示，1,25-二羟基维生素D3可修饰成骨细胞的分化通路，对分化状态不同期的成骨细胞具有选择性作用。8 在培养人成骨细胞时，1,25-二羟基维生素D3对相对处于成熟阶段的细胞更具正性作用，并增加骨钙素和碱性磷酸酶的表达，但却抑制骨涎蛋白的表达，亦可促进处于成熟后期成骨细胞I型胶原的表达，对基质细胞也具有促增殖作用。1,25-二羟基维生素D3
43、可激活多种信息途径，上调或下调与成骨细胞增殖和分化相关的基因表达，同时也可增加TGF-的合成及胰岛素样生长因子(IGF)-1受体的数量，通过相应基因的启动、转录而对碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白等起上调作用。对于I型胶原，1,25-二羟基维生素D3则因细胞密度、使用时间和浓度的不同而起抑制和刺激合成的作用。1,25-二羟基维生素D3可促进相对不成熟成骨细胞的合成，但可抑制较成熟成骨细胞和骨涎蛋白的合成，并下调PTH、PTH相关肽(PTHrP)、降钙素、IL-2、1羟化酶。这些成骨细胞合成的基质和蛋白不仅保证了骨组织胶原纤维的矿化，还可增加骨质量所必需的成分。成骨细胞数量不足和功能缺陷在骨质疏松症
44、中所起作用较过去设想的重要得多。1,25-二羟基维生素D3是青春期骨加速生长的一个重要刺激因子，也是骨量峰值形成的关键因子和佝偻病患儿生长落后的原因。对于老年人，骨重建特别是成骨细胞活力的维持是骨质量和骨机械稳定性能的保障。对骨吸收(破骨)的作用 a. 间接作用 破骨细胞功能的激发主要来自对成骨细胞产生的某些破骨细胞活化因子作出的应答，维生素D活性产物在刺激成骨细胞时还能促进破骨细胞分化，使前成骨细胞发育成具有促进骨吸收作用的成熟破骨细胞，体现了其促进骨吸收的间接作用。目前已知1,25-二羟基维生素D3作用于成骨细胞，促使产生破骨细胞分化因子即ODF,又称核因子一B活化受体(RANK)配体(R
45、ANKL)、肿瘤坏死因子相关活化诱导细胞因子(TRANC)和骨保护素配体(0PCL)，从而促进了破骨细胞的发育。 b 直接作用 在成熟的破骨细胞上无1,25-二羟基维生素D3受体，而其前体细胞上则有此受体。1,25-二羟基维生素D3促进前体破骨细胞向成熟破骨细胞分化，其后通过对成骨细胞的作用，在ODF作用下,募集起无骨吸收活性的破骨细胞，并使其发育为具有骨吸收活性的破骨细胞，从而增加破骨细胞数量，增加骨吸收。9对肠钙吸收的作用 从十二指肠到结肠的肠黏膜细胞中都有1,25-二羟基维生素D3受体，其分布在十二指肠最密，至下肠道逐渐减少。在基础状态，正常成人空肠部位的净钙吸收是回肠的3倍。若给予1,
46、25-二羟基维生素D31周后，空肠和回肠的钙吸收率均显著增加，而且回肠的钙吸收率可达到空肠的水平。结肠在1,25-二羟基维生素D3作用下钙吸收率也会明显增加，这对保证小肠切除后患者的钙吸收具有重要意义。10 钙从小肠进入细胞外液的主动转运主要通过1,25-二羟基维生素D3诱导的钙结合蛋白来加以调节。肠钙吸收的效率随年龄增长而降低，即年龄增加可降低食物钙吸收的效率，这与1,25-二羟基维生素D3水平相对低下、肠道细胞内1,25维生素D受体缺乏及其他钙主动性吸收机制紊乱有关。与年龄增长相关的钙吸收障碍导致了继发性甲状旁腺功能亢进症，并伴有骨丢失。重要的是，钙吸收不良可被1-羟基维生素D3或骨化三醇
47、纠正，而与特殊的内在原因和患者年龄无关。 钙结合蛋白有两个主要类型，分别为分子量28 ku的Calbindin 28K(CaBP28k)和分子量为9 ku的Calbindin 9K(CaBP9K,ICaBP)。在哺乳动物，CaBP 28K主要分布于肾、脑、胰，CaBP 9K主要分布在肠壁。在去卵巢大鼠因雌激素减弱造成的骨质疏松模型中，其小肠黏膜中CaBP9K mRNA表达明显下降，补充雌激素则可增加肠壁细胞对1,25-二羟维生素D3的反应或直接提高CaBP9K的表达，从而以直接或间接方式参与调节肠钙吸收。临床上绝经后并有严重肝脏疾病的患者，加用雌激素替代治疗可改善单用钙剂及维生素D治疗无效的低钙血症。通过细胞因子和其他途径对骨代谢的调节作用 在老年性骨质疏松症(SOP)中常出现骨吸收增加但不伴骨形成增加。相反，升高的PTH可刺激IGF结合蛋白(IGFBP-4)分泌增加，后者对IGF-1和IGF-2有抑制作用。1,25-二羟基维生素D3缺乏可减少TCF-的分泌，这些因素抑制了成骨细胞的产生、分化和代谢。不论男性还是女性SOP患者，在股骨颈皮质骨和骨小梁中，IGF-1和TGF-均有增龄性减少，这与骨折危险增加有关。 IGFBP-3和IGFBP-5可增加IGF-1和IGF-2促骨有丝分裂的强度，在老
