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1、题 目 ：西伯利亚蝗基因组DNA不同 提取方法的研究 专 业 ： 生物技术 目 录中文摘要 3英文摘要 4引言 51 材料与方法 61.1 实验材料 61.2主要试剂 61.3主要仪器 61.4研究方法 71.4.1 SDS-蛋白酶K消化法 71.4.2饱和NaCl法 81.4.3 CTAB法 91.5电泳及结果记录 102结果与分析 102.1总DNA的提取结果 102.2结果与分析 123 讨论 133.1三种不同DNA提取方法的比较 133.2实验结果不理想的原因分析 14参考文献 15西伯利亚蝗基因组DNA不同提取方法的研究摘要：本实验以新疆草原蝗虫的主要危害种类西伯利亚蝗为研究对象，
2、分别对干制和乙醇浸泡的标本用SDS法、饱和NaCl 法和CTAB法进行了基因组DNA 的提取比较。实验结果表明，SDS法提取的总DNA 带型整齐，饱和NaCl法和CTAB法提取的标本总DNA获得率较低，在琼脂糖凝胶电泳检测中大部分有明显降解。另外，乙醇浸制的标本总DNA的获得率及质量均高于干标本。研究结果可为今后进一步开展蝗科亲缘关系分析、基因组比较和遗传多态性等分子生物学研究提供基础资料。关键词：基因组DNA , 不同方法, 西伯利亚蝗Studies on different extraction methods of Gomphocerus sibiricus genomic DNA（Co
3、llege of Life and environment sciences ,Xinjiang Normal university, urumqi 830054）Abstract: The experiments in Xinjiang grassland locusts main types of hazards Gomphocerus sibiricus for research, genome DNA of grasshoppers which were kept as dry sample or preserved in 100% ethanol was extracted usin
4、g SDS method，Saturated NaCl law and the law CTAB extraction of DNA genome comparison.Experimental results showed ,SDS method brought from the total DNA, saturated Nacl law and the law CTAB extraction of total DNA in specimens of the lower rate in most Agarose gel electrophoresis testing marked degra
5、dation. In addition, ethanol college system overall DNA specimens obtained were higher than the rate and quality of the dry specimens. The results will further their relatives for Acrididae future analysis, genome comparison and genetic polymorphism, and other molecular biology research based inform
6、ation.Key words: genomic DNA extraction, different extraction methods , Gomphocerus sibiricus引言蝗虫是农、牧、林业的主要害虫之一，有些种类甚至可造成毁灭性的灾害。因此，对蝗虫开展各方面研究都有很重要的意义1。为有效防治蝗虫灾害,必须正确识别蝗虫种类。有关蝗虫的分类研究已有很多报道2,前人已采集了大量的标本,命名了大量的模式种,这些模式种构成了蝗虫系统分类的基础和框架,用分子生物学技术研究蝗虫分类和系统演化时,若能用到这些标本和模式种,可以极大地扩展蝗虫分类和系统演化的分子生物学研究范围,有助于建立正确
7、和完善的分类体系,构建系统的发育树35, 而提取高质量和高产量的基因组DNA是进行各种PCR、Southern 杂交、构建cDNA 文库及其它一些分子生物学研究的基础和前提6。在实际工作中, 由于很难直接用活标本进行实验,常常使用的是干制标本或浸泡标本。而若标本保存不当,细胞内DNA 发生降解,则难以获得高质量的DNA模板,导致PCR 扩增结果不稳定甚至无扩增产物出现,给实验工作者带来诸多不便7。因此，为开展蝗虫分子系统学研究，需要通过试验寻找一种快速、简便、高质量抽提蝗总DNA的方法。基因组DNA的应用十分广泛，提取方法在国内外亦有不少报道811，概括起来可分为两大类：（1）盐析提取法；（2
8、）有机溶剂提取法12。本文分别用SDS-蛋白酶K消化法、饱和NaCl法、CTAB法三种不同的提取方法，综合其他各种昆虫基因组DNA提取方法的优点，对新疆草原的主要危害种类西伯利亚蝗（Gomphocerus sibiricus）干制标本和无水乙醇保存的标本进行了基因组DNA的提取方法的比较，为进一步开展蝗虫分类学研究提供基础资料。1 材料与方法1.1实验材料本实验所用蝗虫标本见表1。表1 研究样本来源及保存方式Table 1 Research sources and the preservation of samples 种名 采集地点 采集时间 保存方式西伯利亚蝗 新疆哈密 2005年6月 干
9、标本西伯利亚蝗 新疆哈密 2005年6月 无水乙醇固定1.2主要试剂：(1) 提取试剂：Tris（三羟甲基氨基甲烷）、EDTA（乙二氨四乙酸）、SDS（十二烷基硫酸钠）、蛋白酶K、酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、异丙醇、RNA酶、-巯基乙醇、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）等。(2) 电泳试剂：琼脂糖、TBE、溴酚兰、蔗糖等。1. 3主要仪器：台式冷冻高速离心机 D-37520 德国电子天平 AL-204 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司座式自动蒸汽灭菌锅 ZDX-35SBI 上海申安医疗器械厂热空气消毒箱 GRX-9203A 上海一恒科技有限公司电热恒温水浴锅 DZKW-S-8 北京光明医疗器
10、械厂超净工作台 SW-CJ-IF 苏州安泰空气技术有限公司冰箱 BCD-208K/ACJN 青岛海尔股份有限公司电泳仪 DYY-2C 北京六一仪器厂紫外分析仪 WD-9403B 北京六一仪器厂凝胶成像仪、移液枪等。1.4研究方法： 1.4.1 SDS-蛋白酶K消化法1214 (1)试剂及溶液A液：Tris 0.05 mol/L、NaCl 0.1 mol/L、EDTA 0.1 mol/L pH 7.08.0。B液：5%的SDSC液：2 mg/mL的蛋白酶K（2）操作方法：1）取样：将蝗虫干标本和无水乙醇浸制标本用无菌三蒸水冲洗23 次;用无菌三蒸水浸泡48 h 以上,弃水；弃去浸泡液,取蝗虫后足
11、股节肌肉,剪碎材料于装有0.8 mL匀浆液（A液）的1.5 mL Eppendorf 管中。2）研磨: 与离心管相匹配的玻璃棒将样品研磨至匀浆状。3）加入0.1 mL的5SDS和0.1 mL的2 mg/mL蛋白酶K。4）水浴：37水浴13 h，直至混合液消化得很清亮为止。5）酚抽提：在混合液中加入等体积的平衡酚，上下缓慢颠倒十次，切勿剧烈振荡，在台式高速离心机上6 000 r/min离心10 min,取上清液。6）重复步骤5：直至水相与酚相的界面处看不到白色的蛋白质层为止，取上清液。7）氯仿异戊醇(241)抽提:上清液中加入等体积的氯仿异戊醇，上下缓慢颠倒十次，在台式高速离心机上8 000 r
12、/min离心10 min,取上清液；再次重复此步骤。8）沉淀DNA：在上清液中加入2体积的冷无水乙醇(预先置-20冰箱内)沉淀DNA冰箱内放置10 min，12 000 r/min离心 10 min, 弃上清液。9）洗涤DNA：在留有沉淀的离心管中加入1 mL70%的冷乙醇洗涤DNA，在台式高速离心机上10 000 r/min离心5 min,倾去上清液。10）保存：自然干燥，加适量TE或无菌三蒸水溶解，于- 20保存备用。1.4.2饱和NaCl法9 ,15 （1）试剂及溶液 浸泡液（TE）：10mmol/Ltris-HCl、200mmol/LEDTA、50mmol/L NaCl pH8.0。消
13、化液：STE（0.1mol/L Nacl、10 mol/L Tris-HCl、1mmol/LEDTA pH 8.0、1 % SDS、200g/ml Proteinase K。蛋白酶K：2 mg/mL 饱和NaCl溶液、异丙醇、70%的乙醇。（2）操作方法：1)乙醇固定标本用无菌三蒸水浸泡48 h 以上,弃水;对干标本,用浸泡液（TE）浸泡48 h 以上，弃去浸泡液TE,取蝗虫后足股节肌肉。2) 剪碎材料,加400l 消化液于55消化812 h以上，然后加蛋白酶K（2 mg /mL），37继续消化1 h。3）加300l 饱和NaCl,涡旋30 s ,10000 r/min离心30 min 。4）
14、转移上清,等体积异丙醇沉淀DNA ,1000r/min离心15min,弃上清。5）用70%的乙醇洗涤DNA沉淀，自然干燥，TE(pH 8.0) 溶解后,于- 20 保存备用。1.4.3 CTAB法6 ,16 （1）试剂及溶液2CTAB缓冲液：0.1 mol/LTris-HCl，0.02 mol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，0.2%-巯基乙醇，0.05 mol/L CTAB(pH 8.3)。CI溶液：氯仿：异戊醇241、70%的乙醇。（2）操作方法：1） 将蝗虫干标本和无水乙醇浸制标本用无菌三蒸水冲洗23 次;用无菌三蒸水浸泡48 h 以上,弃水；弃去浸泡液,取蝗虫后足股节肌肉，
15、速置于EP管中研碎。2）加入2CTAB缓冲液300 L，以65温育60 min。然后，12 000 r/min离心15 s，上清液倾出。3）将原离心管中的剩余组织中再加入200 L的2CTAB缓冲液中，轻轻打匀，65温育10 min后，10000r/min离心10 min，倾出上清液与第一次收集的上清液混合。4）用等体积的CI抽提一次，10 000 r/min离心10 min，取上清液。5）加入冰冷的异丙醇沉淀，8 000 r/min离心10 min。取沉淀，加70%乙醇200 L，洗涤DNA沉淀，8 000 r/min离心6 min，倾上清液。6）自然干燥，加适量TE或无菌三蒸水溶解，于-
16、20保存备用。1.5电泳及结果记录琼脂糖凝胶电泳检测：试剂：琼脂糖，溴化乙啶染色液（EB），15TBE： Tris 54g、硼酸27.5g、0.5mol/L 的EDTA 20ml（pH 8.0），用三蒸水定容到1L，灭菌后贮存，稀释10倍后使用。Loading buffer：0.25%的溴酚兰、40%的蔗糖，用三蒸水配制保存。制胶：1、封好制胶槽并放置水平。 2、琼脂糖0.4g加40ml的10.5 TBE加热溶解透亮后摇匀。3、待胶冷却至65时倒入制胶槽中厚度约5mm，插好梳子，室温放置40min，待凝胶完全后小心的移去梳子。4、将制胶槽放入电泳槽中，加入电泳缓冲液至淹没胶的表面。上样：取样品
17、DNA 5l 和2l的溴酚兰混匀后用移液枪点入胶孔，注意加样前要混匀。电泳：盖上电泳槽并通电，120V 恒压电泳40-60min。染色: 将电泳好的琼脂糖凝胶放入EB中染色15min。观察：放置在紫外分析仪上观察，然后用凝胶成像系统观察拍照。2结果与分析 2.1总DNA的提取结果：图1-图3为西伯利亚蝗虫基因组DNA 1%的琼脂糖凝胶电泳图。Figure 1- Figure 3 for Gomphocerus sibiricus genomic DNA of the 1% agarose gel electrophoresis testing plan. 图1 SDS-蛋白酶K消化法提取DNA
18、的琼脂糖凝胶电泳图（5月4日）M：100bp标准分子量DNA 干制标本: 1-10：雌，10-20：雄；乙醇浸泡标本：A- J：雌，K- T：雄。M:100bp DNA molecular weight standards Dried specimens:1-10:female,10-20:male; Ethanol soak specimens: A- J：female， K- T：male.图 2 饱和NaCl法提取DNA的琼脂糖凝胶电泳图（5月9日）M: 100bp标准分子量DNA 干制标本: 1-5，11，12，13为雌性，6- 10：雄；乙醇浸泡标本: A- E：雌，F- K：雄。M
19、:100bp DNA molecular weight standards Dried specimens:1-5,11,12,13:female,6-10:male; Ethanol soak specimens: A- E：female，K- F：male。图3 CTAB法提取DNA的琼脂糖凝胶电泳图（5月11日）M: 100bp标准分子量DNA 干制标本: a-j: 雌，k-t: 雄;乙醇浸泡标本：A-C: 雌, D-R: 雄M:100bp DNA molecular weight standards Dried specimens:a-j:female, k-t:male;Ethano
20、l soak specimens: A- C：female，D- R：male。2.2结果与分析一般认为，电泳检测后，若样品DNA条带整齐、无拖尾，则说明DNA较完整，也无杂质。反之，则认为DNA样品有降解或混有杂质14。通过检测发现本实验的的部分样品有明显的DNA条带，但都有不同程度的降解。从图1可以看出，用SDS-蛋白酶K消化法提取的总DNA部分在3000bp处有一亮带，基本无拖尾，说明提取的DNA大分子较为完整。饱和NaCl法提取的总DNA从图2可以看出，此方法提取的效果相对较差，DNA弥散较大,未出现单条浓带，抹迹现象严重，以至用此方法提取的基因组DNA都无法用以PCR扩增。用CTAB
21、法提取的DNA从图3可以看出，干标本只有一个样品提出了明显的DNA条带，无水乙醇浸泡的标本提取的总DNA有亮带在3000bp处,但大部分都有拖尾,且拖尾现象比较严重，说明DNA样品有降解或混有杂质。三种方法比较结果表明，SDS-蛋白酶K消化法提取的效果最好，CTAB法次之，饱和NaCl法效果较差。用酒精浸泡标本和干标本进行基因组DNA 提取的结果表明,无水乙醇浸制的标本提取的总DNA的得率及质量均较高，用三种方法均能得到部分良好的基因组DNA。而对于干标本三种方法提取的结果都不是很好。3 讨论3.1三种不同DNA提取方法的比较分子生物学技术从核酸水平对昆虫进行物种鉴别以及探讨物种的起源和进化,
22、是现代生物分子系统学和生物分子进化的研究热点之一 。有效的核酸提取方法是开展分子系统学研究的前提,不同生物的基因组DNA 的提取方法不尽相同,但主要的步骤是包括破膜释放DNA、抑制核酸酶和除去蛋白质与其它大分子等6 。本研究采用的三种方法所得到的结果显示各有优缺点如下：方法1：SDS-蛋白酶K消化法，由于蛋白酶K的加入，研磨省时省力，无须低温操作，提取的DNA的浓度、纯度较好，适用范围广。因此，该方法可以用于对模板DNA质量要求较高的分子研究中，但该方法成本较高，耗时长，酚等药品价格高且对人体有害;需要转移上清液多次,有机抽提多次, 此过程中DNA有较大损耗，且浪费材料，步骤繁琐。方法2 ：饱
23、和NaCl法，操作简单，成本低廉，且不用接触酚-氯仿等腐蚀性试剂，省时、经济、适合小型昆虫基因组DNA的提取，但提出的DNA含有的杂质也较多，因而该方法可以用于对模板质量要求不高的分子实验中。方法3 ：CTAB法，本方法有以下优点：（1）无需用酚抽提，省时，经济，又减少了有毒药品对实验人员的侵害；(2)适合小型昆虫基因组DNA的提取，其间仅转移上清液两次，有机抽提一次，DNA得率高；(3)本方法不需要严格的低温操作，其步骤均可在室温进行；(4)适合不同处理材料以及其它昆虫的基因组DNA提取，获得的DNA可以满足蝗虫分子系统学研究的需要。不同的标本、同一标本的不同组织, 或不同保存方法的材料,
24、在提取DNA 时都会出现难以预料的问题。虽然目前已经发表了很多提取标本DNA 的方法, 但是迄今为止还没有一种通用的提取方法适用于所有的标本DNA 提取。因而，不同的标本应根据标本保存状态和不同的实验目的选取不同的提取方法, 才能保证研究的顺利进行17。3.2实验结果不理想的原因分析（1） 因为气候原因未采到新鲜标本，干标本和乙醇固定的标本存放过久，DNA严重降解（DNA 的化学性质极不稳定, 可以通过水解或氧化作用自发降解），提取效果没有新鲜标本好；（2） 原料过少且研磨不够充分；（3）在加药品的混匀或吹吸过程中，动作剧烈或所用的枪头过小造成了DNA片断的断裂；（4）在SDS-蛋白酶K消化法
25、中可能没有把蛋白质消化完全；（5）在SDS-蛋白酶K消化法和CTAB法过程中酚的三次抽提和氯仿已戊醇抽提中可能离心转速不够或时间不足，使上清液中还含有较多的杂质，影响了DNA的纯度。此外,在基因组DNA的提取过程中，应尽量保证核酸一级结构的完整性，并最大限度地减少污染。为此，在实验过程中注意要简化操作步骤，缩短提取过程，避免使核酸处于高温，过酸或过碱的环境，以减少核酸变性降解等机会，同时在提取过程中注意实验技巧尽量减少化学及机械因素的影响。虽然本次提取的结果不是很理想，但是有些样品的主带明显，而PCR扩增要求的模板DNA的质量不是很高，所以这些主带明显样品可以用来做PCR扩增，来进行更深一步的
26、研究。本文比较了三种不同提取方法的优缺点，因此可以根据不同的实验条件和目的选择使用。当然随着分子生物学的快速发展，各种不同的DNA提取方法在不断的创新出现，相信这些方法在不断的优化后也可以提取到高质量的基因组DNA来满足更深层次研究的需要。参考文献1 汪桂玲，郑哲民，黄原. 蝗总科5科蝗虫间RAPD带型变异的比较研究J .陕西师范大学学报(自然科学版)，2000，28（1）：83-85.2 郑哲民. 蝗虫分类学M. 西安: 陕西师范大学出版社,1993.3 马恩波,郭亚平,郑哲民. 中国稻蝗属细胞分类学研究J.中国昆虫科学(英) ,1994 ,1(2) :101-109.4 乔海暄,段毅豪,马
27、恩波. 蝗总科部分种类等位基因酶的比较研究(英) J . 遗传学报, 2002 , 29 (2) :133-137.5 马恩波,郑哲民. 五种稻蝗染色体核型和C 带带型的比较J. 昆虫学报，1989 ，32（4）：399-405.6 张大治，戴沛捷. 蜻蜓目昆虫DNA的提取方法研究J. 宁夏农学院学报，2004，25（3）：10-13.7 张建珍，郭亚平，马恩波. 不同保存方式下蝗虫组织DNA的提取及RAPD分析J. 动物学杂志，2004，39（2）：53-57.8 季维智,宿兵. 遗传多样性研究的原理与方法M. 杭州:浙江科学出版社,1999，61-62.9 LENNEYC , WILL I
28、AMS S L , GOLDSON D B , et al. Geographical origin of an introduced insect pest, Listronotus bonariensis( Kuschel), determined by RAPD analysisJ . Heredity , 1994 ,72 :412-419.10 谭竹钧,韩雅莉,苏和风. 雏蝗属六种蝗虫基因组DNA 的RAPD比较研究J . 内蒙古大学学报(自然科学版), 1998 ,29(6) :801-805.11 张民照,康乐. 飞蝗总DNA 抽提及其RAPD分析条件的摸索J. 动物学研究, 2
29、000,22 (1) :20-26.12 田英芳，黄刚，郑哲民，魏朝明. 一种简易的昆虫基因组DNA提取方法J.陕西师范大学学报(自然科学版)，1999，27（4）：82-84.13 印红，刘晓丽,王彦芳,张道川,赵晓瑜. 一种改进的昆虫基因组DNA 的提取方法J. 河北大学学报(自然科学版)，2002，22（1）：28-32.14 胡婧，刘艳，黄原. 网翅蝗科部分种类全基因组提取及16Sr RNA COI基因测序J. 陕西师范大学学报（自然科学版），2004，32：30-34.15 张建珍，马恩波，郭亚平，陈东华，王燕. 网翅蝗科四种蝗虫的RAPD多态性研究J.动物分类学报，2004，29（
30、2）：212-217.16 刘波，郑哲民，张迎春，刘缠民. 稻蝗属基因组DNA提取方法J.陕西师范大学学报（自然科学版），1999，27（3）：7-99.17 庞峻峰，张亚平.标本D NA 研究进展J .动物学研究，2001, 22 (6) : 490-496.本科毕业论文致谢 致 谢时间如梭，转眼毕业在即。回想在大学求学的四年，心中充满无限感激和留恋之情。感谢母校为我们提供的良好学习环境，使我们能够在此专心学习，陶冶情操。谨向我的论文指导老师王副教授致以最诚挚的谢意！王老师不仅在学业上言传身教，而且以其高尚的品格给我以情操上的熏陶。本文的写作更是直接得益于他的悉心指点，从论文的选题到体系的安
31、排，从观点推敲到字句斟酌，无不凝聚着他的心血。滴水之恩，当以涌泉相报，师恩重于山，师恩难报。我只有在今后的学习、工作中，以锲而不舍的精神，努力做出点成绩，以博恩师一笑。另外，我必须感谢我的父母。焉得谖草，言树之背，养育之恩，无以回报。作为他们的孩子，我秉承了他们朴实、坚韧的性格，也因此我有足够的信心和能力战胜前进路上的艰难险阻；也因为他们的日夜辛劳，我才有机会如愿完成自己的大学学业，进而取得进一步发展的机会。最后，我必须感谢我的朋友，正是因为他们在电脑技术上的无私指引，我才能得以顺利完成该论文。 本研究及学位论文是在我的导师*老师的亲切关怀和悉心指导下完成的。他严肃的科学态度，严谨的治学精神，
32、精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。*老师不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想、生活上给我以无微不至的关怀，在此谨向*老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。我还要感谢在一起愉快的度过毕业论文小组的同学们，正是由于你们的帮助和支持，我才能克服一个一个的困难和疑惑，直至本文的顺利完成。 在论文即将完成之际，我的心情无法平静，从开始进入课题到论文的顺利完成，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮助，在这里请接受我诚挚的谢意!最后我还要感谢培养我长大含辛茹苦的父母，谢谢你们!最后，再次对关心、帮助我的老师和同学表示衷心地感谢！大学三年学习时光已经接近尾声，在此我想对我的母校，我的父母、亲人们，
33、我的老师和同学们表达我由衷的谢意。感谢我的家人对我大学三年学习的默默支持；感谢我的母校*给了我在大学三年深造的机会，让我能继续学习和提高；感谢*的老师和同学们三年来的关心和鼓励。老师们课堂上的激情洋溢，课堂下的谆谆教诲；同学们在学习中的认真热情，生活上的热心主动，所有这些都让我的三年充满了感动。 这次毕业论文设计我得到了很多老师和同学的帮助，其中我的论文指导老师黄志敏老师对我的关心和支持尤为重要。每次遇到难题，我最先做的就是向黄老师寻求帮助，而黄老师每次不管忙或闲，总会抽空来找我面谈，然后一起商量解决的办法。黄老师平日里工作繁多，但我做毕业设计的每个阶段，从选题到查阅资料，论文提纲的确定，中期
34、论文的修改，后期论文格式调整等各个环节中都给予了我悉心的指导。这几个月以来，黄老师不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想给我以无微不至的关怀，在此谨向黄老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。同时，本篇毕业论文的写作也得到了韦芳、谭冬柳等同学的热情帮助。感谢在整个毕业设计期间和我密切合作的同学，和曾经在各个方面给予过我帮助的伙伴们，在此，我再一次真诚地向帮助过我的老师和同学表示感谢！ 感谢培养教育我的XX学校，XX浓厚的学术氛围，舒适的学习环境我将终生难忘！祝母校蒸蒸日上，永创辉煌！祝校长财源滚滚，仕途顺利！感谢对我倾囊赐教、鞭策鼓励的XX大学X系诸位师长，诸位恩师的谆谆训诲我将铭记在心。祝恩师们身
35、体健康，家庭幸福！感谢论文中引文的原作者，他们都是法学界的名师大家，大师风范，高山仰止。祝他们寿域无疆，德业永辉！感谢同窗好友XXX、XXX、XX、XX、XXX以及更多我无法逐一列出名字的朋友，他们和我共同度过了四年美好难忘的大学时光，我非常珍视和他们的友谊！祝他们前程似锦，事业有成！家有娇妻，外有二房！最最感谢生我养我的父母，他们给予了我最无私的爱，为我的成长付出了许多许多，焉得谖草，言树之背，养育之恩，无以回报，惟愿他们健康长寿！感谢我的牌友孙XX、杨XX、杨XX、王X、赵X，他们和我一起度过了大四无聊的时光，让我在写作之余能有很好的休闲活动。祝他们以后多培养牌坛新秀！感谢我的烟友姜X、丁
36、X、冯XX、田XX。在我没烟抽的时候他们总能毫无吝惜的将自己的烟分给我抽，尤其是在本文写作过程中，我废寝忘食，足不出户，烟抽的很快，他们给予我很大帮助，燃上一支烟，文思如泉涌，快乐似神仙！祝他们永远都有好烟抽！最后要感谢我自己，没有自己的努力，本文是无论如何业完不成的！感谢我以最大的毅力完成了四年大学学习，在这个环境里我能洁身自爱，出淤泥而不染保持一颗纯洁的心，真的是很不容易！祝自己身体健康，权财两旺！家里红旗不倒，外面彩旗飘飘！大学生活一晃而过，回首走过的岁月，心中倍感充实，当我写完这篇毕业论文的时候，有一种如释重负的感觉，感慨良多。首先诚挚的感谢我的论文指导老师*老师。她在忙碌的教学工作中
37、挤出时间来审查、修改我的论文。还有教过我的所有老师们，你们严谨细致、一丝不苟的作风一直是我工作、学习中的榜样；他们循循善诱的教导和不拘一格的思路给予我无尽的启迪。感谢三年中陪伴在我身边的同学、朋友，感谢他们为我提出的有益的建议和意见，有了他们的支持、鼓励和帮助，我才能充实的度过了三年的学习生活。本论文是在导师詹怀宇教授和付时雨研究员的悉心指导下完成的。导师渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，严以律己、宽以待人的崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。不仅使我树立了远大的学术目标、掌握了基本的研究方法，还使我明白了许多待人接物与为人处世的道理。本论
38、文从选题到完成，每一步都是在导师的指导下完成的，倾注了导师大量的心血。在此，谨向导师表示崇高的敬意和衷心的感谢！ 本论文的顺利完成，离不开各位老师、同学和朋友的关心和帮助。在此感谢岳保珍高工、张曾教授、李兵云老师、何婉芬老师的指导和帮助；感谢重点实验室的等老师的指导和帮助；感谢福建农林大学谢拥群教授、陈礼辉教授、黄六莲高工的关心、支持和帮助，在此表示深深的感谢。没有他们的帮助和支持是没有办法完成我的博士学位论文的，同窗之间的友谊永远长存。 2）我毕业论文的致谢 致谢： 感谢我的导师XXX教授，他们严谨细致、一丝不苟的作风一直是我工作、学习中的榜样；他们循循善诱的教导和不拘一格的思路给予我无尽的
39、启迪。 3） 本课题在选题及研究过程中得到*老师的悉心指导。陆老师多次询问研究进程，并为我指点迷津，帮助我开拓研究思路，精心点拨、热忱鼓励。陆老师一丝不苟的作风，严谨求实的态度，踏踏实实的精神，不仅授我以文，而且教我做人，虽历时三载，却给以终生受益无穷之道。对陆老师的感激之情是无法用言语表达的。 感谢*老师、*老师、*老师、*老师等对我的教育培养。他们细心指导我的学习与研究，在此，我要向诸位老师深深地鞠上一躬。 南京晓庄学院*院长、科学教育系*主任、*书记、*老师、*老师等老师为我提供了良好的研究条件，谨向各位同仁表示诚挚的敬意和谢忱。 感谢我的同学*、*、*、*三年来对我学习、生活的关心和帮
40、助。 最后，向我的父亲、母亲、爱人、女儿致谢，感谢他们对我的理解与支持 4） 在论文完成之际，我的心情万分激动。从论文的选题、资料的收集到论文的撰写编排整个过程中，我得到了许多的热情帮助。 我首先要感谢张玉清老师，是他将我领入了信息安全的大门，并对我的研究提出了很多宝贵的意见，使我的研究工作有了目标和方向。在这近二年的时间里，他对我进行了悉心的指导和教育。，使我能够不断地学习提高，而且这些课题的研究成果也成为了本论文的主要素材。同时，张老师渊博的学识、严谨的治学态度也令我十分敬佩，是我以后学习和工作的榜样。还要再次感谢张老师对我的关心和照顾, 在此表示最诚挚的谢意。 5）时光匆匆如流水，转眼便
41、是大学毕业时节，春梦秋云，聚散真容易。离校日期已日趋临近，毕业论文的的完成也随之进入了尾声。从开始进入课题到论文的顺利完成，一直都离不开老师、同学、朋友给我热情的帮助，在这里请接受我诚挚的谢意! 说心里话，作为一个本科生，在最初试图以周易为题材进行研究时，还是颇有顾虑的，最大的难题在于自己对周易缺乏足够的了解，面对神秘瑰丽的古代典籍茫茫然不知从何处下手，几经酝酿思索，最后在文学院不少老师的鼓励和帮助下，最终确定对周易的人生哲学进行尝试性的分析研究，由此才展开此论文的撰写工作。 本学位论文是在我的指导老师陈松青老师的亲切关怀与细心指导下完成的。从课题的选择到论文的最终完成，陈老师始终都给予了细心
42、的指导和不懈的支持，并且在耐心指导论文之余，陈老师仍不忘拓展我们的文化视野，让我们感受到了文学的美妙与乐趣。特别是陈老师借给我的周易美学一书，让我对周易中神奇瑰丽的殿堂多了一份盼望与神往，虽然与论文不甚相关，却为我将来步入学术研究的殿堂打开了不可多得的方便法门。值得一提的是，陈老师宅心仁厚，闲静少言，不慕荣利，对学生认真负责，在他的身上，我们可以感受到一个学者的严谨和务实，这些都让我们获益菲浅，并且将终生受用无穷。毕竟“经师易得，人师难求”，希望借此机会向陈老师表示最衷心的感谢！ 此外，本文最终得以顺利完成，也是与文学院其他老师的帮助分不开的，虽然他们没有直接参与我的论文指导，但在开题时也给我
43、提供了不少的意见，提出了一系列可行性的建议，他们是李生龙老师，吴建国老师，王建老师等，在此向他们表示深深的感谢！ 最后要感谢的是我的父母，他们不仅培养了我对中国传统文化的浓厚的兴趣，让我在漫长的人生旅途中使心灵有了虔敬的归依，而且也为我能够顺利的完成毕业论文提供了巨大的支持与帮助。在未来的日子里，我会更加努力的学习和工作，不辜负父母对我的殷殷期望！我一定会好好孝敬和报答他们！在本人的写作过程中，XXX老师给予了大力的帮助和指导，在此深表感谢！同时也感谢其他帮助和指导过我的老师和同学。最后要感谢在整个论文写作过程中帮助过我的每一位人。 首先，也是最主要感谢的是我的指导老师，XXX老师。在整个过程
44、中他给了我很大的帮助，在论文题目制定时，他首先肯定了我的题目大方向，但是同时又帮我具体分析使我最后选择失地农民的养老保险这个具体目标，让我在写作时有了具体方向。在论文提纲制定时，我的思路不是很清晰，经过老师的帮忙，让我具体写作时思路顿时清晰。在完成初稿后，老师认真查看了我的文章，指出了我存在的很多问题。在此十分感谢李老师的细心指导，才能让我顺利完成毕业论文。 其次，要感谢帮我查资料的张超同学，后期因为实习的关系，不能随时去学校的图书馆查阅资料，在此也十分感谢他能抽出时间帮我找的一些外文资料。值此本科学位论文完成之际，首先要感谢我的导师XXX老师。X老师从一开始的论文方向的选定，到最后的整篇文论
45、的完成，都非常耐心的对我进行指导。给我提供了大量数据资料和建议，告诉我应该注意的细节问题，细心的给我指出错误。他对分时电价领域的专业研究和对该课题深刻的见解，使我受益匪浅。X老师诲人不倦的工作作风，一丝不苟的工作态度，严肃认真的治学风格给我留下深刻的影响，值得我永远学习。在此，谨向导师XXX老师致以崇高的敬意和衷心的感谢！毕业论文致谢词（英语专业） Acknowledgements My deepest gratitude goes first and foremost to Professor aaa , my supervisor, for her constant encouragement and guidance. She has walked me through all the stages of the writing o
