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1、第七章 中药致突变作用,Genetic Toxicology,第一节 遗传毒理学及其相关概念,突变(mutation)：生物体遗传物质发生的可遗传的变化(遗传物质发生的变化及引起的变异)。自发性突变(spontaneous mutation)：自然条件下发生的突变。诱发性突变(induced mutation)：人为地或受各种因素诱发产生的突变。突变是毒理学中的一种损害作用,中药致突变剂(chemical mutagen)：能引起致突变作用的中药成分。Direct-acting mutagenIndirect-acting mutagen遗传毒理学(genetic toxicology)：研究
2、化学性和放射性物质的致突变作用以及人类接触致突变物质可能引起的健康效应的学科。,遗传毒性(genetic toxicity)：对基因的损害能力。包括对基因组的毒性作用引起的致突变性及其他各种不同的效应(如原发性DNA损伤)，包括致突变性。遗传毒性的效应可能转变为突变，也可能被修复。,研究中药致突变作用目的或内容：致突变的中药及其成分 致突变作用的机制 检测及其评价致突变健康危害的方法,第二节 中药的致突变作用,遗传学损伤的类型：基因突变(gene mutation)：基因中DNA序列的变化。也称点突变(point mutatiion)，是组成一个染色体的一个或几个基因发生变化。不能用光学显微镜
3、直接观察，须通过生长发育、生化、形态等表型改变来判断。目前，可直接分析DNA序列。染色体畸变(chromosome abrration)：染色体结构的改变。基因组突变(染色体数目改变)(genomic mutation)：是某一个或几个染色体的结构或染色体的数目发生变化，用光学显微镜可直接进行观察。三者本质相同，区别是受损程度。,第三节 中药致突变作用的机制及其后果,中药成分作用细胞部位不同，产生不同的突变：诱导基因突变和染色体畸变的主要靶分子为DNA，诱导基因组突变的靶部位常是有丝分裂和减数分裂的成分，如纺锤丝。,一、引起突变的DNA变化,致突变作用的基础是DNA结构的理化性质的改变。DNA
4、的损伤有多种类型。(一)、碱基损伤碱基错配、平面大分子嵌入DNA链、碱基类似物取代、碱基化学结构改变或破坏(二)DNA链受损二聚体的形成、DNA加合物形成、DNA-蛋白质交联物形成,二、引起突变的细胞分裂过程的改变,非整倍体和多倍体是由于染色体分离异常产生，涉及纺锤体、微管蛋白等与纺锤体有关的机制：1、与微管蛋白二聚体(构成结合纺锤体的基本成分)：如秋水仙碱2、与微管上巯基结合：如甲基汞3、已组装好微管的破坏：如秋水仙碱、灰黄霉素等4、中心粒移动受阻：如秋水仙碱5、其他作用：如N2O,三、其他改变,1、DNA复制的高保真性：多种酶类2、修复：修复过程及其基因与酶,四、突变的后果,靶细胞的类型决
5、定突变对人类健康的影响：体细胞：影响个体，可能与肿瘤发生有关；生殖细胞：遗传下一代孕体体细胞：新生儿的存在或畸形，流产、死胎等(一)生殖细胞：1、对机体无影响：如无义突变2、导致正常人体生化组成的异常：如ABO血型，在特殊情况下，可引起严重后果，如输血。3、导致遗传易感性的改变4、导致遗传性疾病5、致死突变：配子死亡、死胎、自发流产,DNA损伤修复障碍,生殖细胞突变,显性致死,隐性致死,存活突变,流产、死胎,出生缺陷、基因负荷,先天性疾病,一种物种的群体中每一个携带的可遗传给下一代的有害基因的平均水平,纯合子或半合子出现死亡,DNA损伤修复障碍,体细胞突变,良性肿瘤,细胞衰老,未分化的胚胎细胞
6、受损,动脉硬化,未知疾病,出生缺陷(功能或结构畸形),恶性肿瘤,已分化的胚胎细胞受损,癌变,老 化,出生缺陷(流产、死胎、癌变,(二)体细胞突变,第四节 机体对致突变作用的影响,DNA可受到自发性化学降解、氧化、非酶甲基以及环境中化学致突变物、辐射等因素的影响，而受到损伤，但遗传物质在所有的物种中均能世代相传。其原因：1)DNA执行高度保真复制：对复制中的错误能及时纠正，即通过修复而达到高度保真。2)机体有多种机制修复DNA损伤，以保护亲代DNA链，使其免受化学毒物的作用。机体修复机制：损伤耐受机制和修复机制,接触化学致突变物致突变作用在个体之间，反应有很大差异个体对致突变物敏感性差异的原因：
7、代谢酶的遗传多态性 修复能力差异 宿主因素,细胞处理广泛的DNA损伤有两个过程：如果损伤是广泛的，细胞发生凋亡；如果损伤不十分严重，细胞进行多种修复，使NDA回到未损伤状态(无错误修复)或到一个有所改善但仍发生了改变的状态(错误倾向修复)。大多数修复过程的基本原则是：损伤识别，移除损伤片段，修复DNA合成和连接。,化学致突变模式：损伤-修复-突变修复功能饱和或能力不足如肿瘤发生率每年约为1%吸烟者中患肺癌约有10%先天性(遗传因素)，即遗传多态性后天性(生活方式)，,个体因素,突变,第五节 观察中药致突变作用的基本方法,致突变试验：有200余种，常用约20种一、观察项目的选择 1、观察效应终点
8、及类型：遗传学终点(genrtic endpoint)：致突变试验的观察终点 基因突变；染色体畸变；染色体组畸变(非整倍体)原发性DNA损伤(DNA原始损伤)遗传毒理学试验是通过直接检测遗传学终点或检测导致某一终点的DNA损伤过程伴随的现象，来确定中药产生遗传物质损伤并导致遗传性改变的能力。,DNA的基本特性具有普遍性，故用非人类检测系统预测对人类的遗传危害性。指示生物：病毒、细菌、霉菌、昆虫、植物、培养的哺乳动物细胞和哺乳动物没有一种致突变试验能涵盖所有的遗传学终点，常用一组试验配套进行检测。2、成套观察项目：采用何种方法，根据需要 一般包括基因突变、断裂作用、重组作用、非整倍体或多倍体测定
9、。受试物在其中任何一种试验中出现可重复的阳性结果，即可认为是遗传毒性。,入选遗传毒理学成套观察项目的原则：1)一组试验系统应包括每一类型的遗传学终点2)配套试验应包括多种进化程度不同的物种3)体内与体外试验结合如ICH，1997药品遗传毒性评价组合：细菌基因突变；体外哺乳动物细胞染色体畸变或体外小鼠淋巴瘤细胞tk试验；体内啮齿类造血细胞染色体损伤试验,二、常用致突变试验,基因突变试验应用选择技术检测突变选择技术是利用只有突变的细胞或微生物才能生长的实验条件，从许多未突变细胞中发现很少的突变细胞。利用选择技术可以在微生物和培养哺乳动物细胞检测正向突变和回复突变。微生物和培养哺乳动物细胞缺乏整体动
10、物的代谢能力，在许多遗传试验中，需加入活化体系以检测出间接致突变物。常用：大鼠肝细胞匀浆的微粒体上清液+缓冲液和辅助因子-S9混合物,1、细菌回复突变试验(Ames试验)(bacterial reverse mutation assay)以营养缺陷型的突变体菌株为指示生物检测基因突变的体外试验。常用菌株：组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门菌 色氨酸营养缺陷型大肠杆菌原理：某个调控组氨酸合成的基因发生了点位突变，丧失了合成组氨酸能力，必需依赖外源性组氨酸才能生长。突变菌株可被各种诱变因素诱导，回复突变为原养型，在不含组氨酸的选择培养基上生长成可见的菌落。如果选择培养基上回变菌落数显著超过了自发回变数，即
11、可判断受试物为鼠伤寒沙门菌的致突变物。,图 Ames试验原理,鼠伤寒沙门菌原养型(his+),组氨酸营养缺陷型突变株(his-),正向突变,回复突变,受试物,代谢活化系统,Ames试验有多种菌株，组氨酸突变部位不同、方式不同，附加的基因型改变也不同，不同的菌株对不同化学致突变物的检出能力不同。因此：试验中的菌株也要配套！Ames试验根据菌株特性，可测定：碱基置换、移码突变或两者。ICH推荐菌株：TA98、TA100、TA1535、TA1537或TA97(TA97a)TA102或E.Coli WP2uvrA、E.Coli WP2uvrA(pKM101)我国：TA100、TA98、TA97、TA1
12、02（1983年）,Ames试验方法：点试验法：一般用于预试验 平板掺入法：标准方法 预培养法：提高测试的灵敏度,哺乳动物细胞基因突变试验(mammalian cell gene mutation assay)基因正向突变试验(即野生型基因失活的突变)常用方法：小鼠淋巴瘤(L5178Y)细胞胸苷激酶位点(tk)突变检测中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、中国仓鼠肺(V79)细胞次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶位点(hgpt)突变检测中国仓鼠卵巢细胞的AS52细胞株黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶位点(gpt)突变检测可检测：座位内碱基置换、缺失、移码、重排,附：其它的致突变试验检测生物,一、微生物1、大肠杆菌W
13、P2回复致突变试验2、酵母菌正向回复突变分析二、哺乳动物细胞突变试验三、昆虫致突变试验：黑腹果蝇性连锁隐性致死(SLRL)试验：雄性生殖细胞遗传损伤分析果蝇体细胞分析四、哺乳动物致突变试验1、生殖细胞突变试验：小鼠特异位点测试(SLT)(生殖细胞)2、简单串联重复(ESTR)突变试验3、体细胞突变试验：小鼠体细胞皮毛斑点突变测试五、转基因动物突变试验,2、染色体畸变测试-微核试验,微核(micronucleus)：染色体片段或整条染色体在细胞分裂过程中未按正常程序进入细胞核而滞留在细胞质中的染色质小体。微核通常作为染色体结构损伤、染色体分离异常的标志。微核试验(micronucleus tes
14、t，MNT)：通过观察有微核的细胞率()，用于检测断裂剂及非整倍体诱发剂。,微核试验的细胞：1)植物细胞：紫露草花粉母细胞、蚕豆根尖2)哺乳类动物细胞：骨髓细胞、肝细胞、脾细胞、肺细胞、淋巴细胞、红细胞、精子、鼻及胃粘膜上皮细胞、皮肤细胞等3)非哺乳类动物细胞：鱼红细胞、蟾蜍红细胞常用：啮齿类动物骨髓多染红细胞(PCE)微核试验成红细胞红细胞，主核排出PCE 正染红细胞(NCE)，进入外周血。主核排出时，微核可留存胞浆中。,微核试验的发展：1)体外微核试验：中国仓鼠肺细胞(CHL)、卵巢细胞(CHO)、成纤维细胞(V79)。易于控制和操作2)周围血微核试验：可用于人类观察3)双核细胞法：体细胞
15、培养体系中加入细胞松驰素B，细胞质分裂受阻，形成双核，仅选择双核细胞进行微核计数。灵敏度提高4)免疫荧光染色法和荧光原位杂交法：灵敏度、精确度提高，判断微核来源（片段或染色体）,3、染色体畸变分析(细胞遗传学试验),制备细胞分裂中期染色体标本，在光镜下直接观察染色体数目和形态的改变。体外染色体畸变试验：指示细胞：CHO、CHL、V79、外周血淋巴细胞染色体异常：裂隙、断裂、缺失、微小体、着丝点环、无着丝点、辐射体等(耗时、技术要求娴熟，倾向于用微核试验代替),体内染色体畸变试验：啮齿类动物骨髓细胞染色体畸变试验啮齿类动物睾丸细胞染色体畸变试验 精原细胞：末次染毒后一天取样；初级精母细胞：染毒后
16、12-14天取样,4、姐妹染色单体交换试验(sister-chromatid exchange assay),原理：在DNA合成期，所有染色体均进行复制，形成两条姐妹染色单体。姐妹染色单体交换(SCE)可与DNA复制的断裂和重接有关，故可间接反映DNA损伤。方法：在光学显微镜下，观察经光处理(紫外)和染色(Giemsa)后的交换染色单体，计数SCE数，判断受试物对DNA的损伤作用 结果较染色体分析枳度差,5、果蝇伴性隐性致死试验(sex-linked recessive lethal test，SLRL),主要用于雄性生殖细胞遗传损伤分析。利用隐性基因在伴性(性连锁)遗传中具有交叉遗传特性。优
17、点：简便、经济。特异性高，几乎100%缺点：敏感性低，与哺乳动物差异大 阳性结果(SLRL5倍对照)价值高发展：体细胞分析检测遗传变异：重组、突变、染色体缺失,6、显性致死试验(dominant lethal assay),显性致死(dominant lethal)：发育中的精子或卵子细胞发生遗传学损伤，此损伤不影响受精，但导致受精卵或发育中的胚胎死亡。主要由于染色体损伤(结构或数目)。观察终点：胚胎早期死亡检测目标：受试物对性细胞染色体的损伤方法：对雄性动物染毒(卵子敏感性低)，与未染毒雌性交配，观察胚胎死亡情况。指示生物：小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、果蝇等特点：实用，灵敏度差，动物数大,7、程
18、序外DNA合成试验(unscheduled DNA synthesis test，UDS),程序外DNA合成：正常细胞在有丝分裂过程中，仅在S期进行DNA复制合成，当DNA受损后，DAN的修复合成可发生在正常复制合成期(S期)以外的其他时期。方法：同步培养细胞，将细胞阻断于G1期，受试物处理，并加入标记DNA合成原料(3H-胸腺嘧啶核苷)。DNA损伤，启动修复机制，标记物掺入到DNA链中，通过测定掺入量，检测修复合成，判断受试物作用。指示生物：大鼠原代培养肝细胞、外周血淋巴细胞、人成纤维细胞、Hela细胞等。特点：经济、操作简便、无特殊设备,8、单细胞凝胶电泳试验(single cell ge
19、l electrophoresis，SCGE),彗星试验(comet assay)，近年来发展的单细胞水平检测有核细胞DNA损伤与修复的方法。可进行体内或体外试验。方法：制细胞悬液，裂解细胞获DNA，在碱性(PH13)溶液中获单链DNA，碱性条件下电泳，中和碱，显色和彗星观察优点：对低水平DNA损伤敏感性高，样品细胞数少，快速，简便缺点：标准化、认可度不足,9、技术进展,1)转基因动物致突变试验(transgenic animal mutagenicity assay)小鼠，基因回收分析，在体组织器官分析外源与内源靶基因反应的一致性需进一步证实，昂贵2)微核自动检测技术流式细胞仪、图像分析系统
20、3)荧光原位杂交技术精细结构、非整倍体检测准确、迅速、不同细胞(期)探针不足,三、遗传毒理学试验的应用和评价,1、遗传毒理学试验的应用目的1)鉴定生殖细胞、体细胞致突变物2)预测潜在的致癌物3)环境遗传毒物污染的监测和评价根据危害鉴定、描述剂量-反应关系、致突变机制，进行危险度和致癌危险度评价。,2、遗传毒理学试验的设计1)试验中应设定阳性和阴性对照2)体外试验的活化系统检测直接或间接遗传毒性哺乳动物细胞介导：无细胞体系(S9)大鼠肝原代细胞体内S9系统：肝细胞匀浆上清液(9000g)+辅助因子(NADP、G-6-磷酸、K+Mg2+等)纯化酶和基因工程：纯化CYP450，GSH,3、致突变试验
21、与致癌试验的关系致突变试验可鉴定潜在致癌物及揭示致癌作用机制，但存在不确定性。1)大多数致癌物具有致突变作用2)人类接触的致癌物与DNA加合物及相关癌或抑癌基因突变有相关性3)传统长期致癌试验花费大、周期长，难以检出弱致癌物中药按致突变性和致癌性的分类：遗传毒性致癌物、非遗传毒性致癌物、遗传毒性非致癌物、非遗传毒性非致癌物遗传毒理学试验适用于：遗传毒性致癌物、非遗传毒性非致癌物可假阳性：遗传毒性非致癌物 假阴性：非遗传毒性致癌物 短期检测，与其它试验互为补充,4、试验结果在毒理学安全性评价中的作用质量控制：1)设立阴性和阳性对照2)盲法观察(指标观察)3)资料的统计分析4)结果的重现性阴性结果
22、判定条件：1)最高剂量应包括：溶解度许可、最大给药量、最大耐受量2)组间距：不能过大阳性结果应考虑：有量-效关系、与阴性组有显著差异、所观察的遗传学终点、试验条件的控制,5、对人遗传危险的评价在用遗传毒理学试验预测对人类危险时：1)体内试验的权重大于体外试验2)真核生物试验大于原核生物试验3)哺乳动物试验大于非哺乳动物试验4)对于预测可遗传的效应，生殖细胞大于体细胞5)各遗传学终点的相对重要性不明确，如基因突变、染色体畸变、非整倍体大于原发性DNA损伤哺乳动物性细胞致突变性对人的遗传危害性之间缺乏直接相关证据。遗传流行病学研究最直接。,评价遗传危害主要依据遗传毒理学试验的结果，特别是体内生殖的致突变试验结果；如一种化学物在多项遗传毒理学试验中证明有致突变性，一般假定其对人也可能有遗传危害性具有遗传毒性化学物的判定：任一遗传学终点的试验中呈现阳性反应不具有遗传毒性化学物的判定：试验组合中的一系列结果均为阴性对人类的遗传毒性或致突变性，需与流行病学调查相互印证。,思考题,1、致突变与致癌的关系，致突变有哪些后果？2、为什么检查致突变物需要一组配套试验？在选择一组试验时注意事项有哪些？,
